Дослідження впливу нанокомпозитного комплексу цитокіну ЕМАР II з декстраном 70 на організм мишей лінії BALB/C

Створення нових біомедичних препаратів на основі рекомбінантних білків є одним з приорітетних напрямів сучасної біотехнології [1]. На сьогодні для отримання функціонально активних рекомбінантних білків розроблено декілька гетерологічних систем, які містять клітинні лінії ссавців, клітини дріжджів і бактерій, а також ба- куловірусні системи на основі клітинних ліній комах [2,. Найбільш вживаною серед них є бактеріальна система на основі E.coli завдяки наявності великої кількості ефективних експресуючих векторів, можливості швидкого та дешевого отримання великої кількості рекомбі- нантних білків в нативному стані, простоті їх виділення та очищення, що є необхідною умовою впровадження в біотехнологічне виробництво [4].

Розроблений в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України протипухлинний нанокомпозитний комплекс EMAP II (endothelial monocyte-activating polypeptide II) з декстраном 70, у якому активним компонентом виступає білок із протипухлинними властивостями EMAP II, є перспективним біотехнологічним прду- ктом для досліджень [5].

Білок EMAP II є мультифункціональним цитокінподіб- ним білком, який утворюється у злоякісних пухлинах ссавців завдяки альтернативному сплайсингу та посттранс- ляційному процесингу його попередника - білка р43 [6, 7]. Виявлено здатність EMAP II у малих концентраціях стимулювати, а у великих - пригнічувати міграцію ендо- теліальних клітин, стимулювати їх апоптоз та аутофа- гію[8-10], впливати на активність моноцитів, нейтрофілів і макрофагів, сприяючи запальним процесам в пухлинах [11]. Відоме застосування цитокіну ЕМАР ІІ як засобу, який проявляє протипухлинну дію на ріст карциноми передміхурової залози [І2], аденокарциноми підшлункової залози [13] та гліом [і0, 13]. Рекомбінантний EMAP II виявляє ті самі властивості, що й нативний білок. Для нього характерні протипухлинна активність, гальмування проліферації клітин, стимулювання апоптзу, участь в ангіогенезі та ембріогенезі [12-14].

Нанокомпозитний комплекс ЕМАР ІІ з декстраном 70 створено з метою стабілізації рекомбінантного білка в процесі ліофілізації, зниженню його агрегації, та пролонгації терапевтичної дії препарату. На трансформованих лініях клітин L929 (фібробласти зі сполучної тканини миші СЗН/An, сублінія "a"), отриманих з клітинного банку Інституту експериментальної онкології та радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, та лініях клітин PST (тестикули поросяти), отриманих з колекції Інституту ветеринарної медицини УААН, було показано, що в разі концентрації нанокомпозитного комплексу EMAP II 50 мкг/мл спостерігається зниження кількості клітин в моношарі порівняно з контролем [15]. У звязку з цим метою нашої роботи було дослідження впливу наноко- мпозитного комплексу EmAPII на організм тварин.

Матеріали і методи. Експресія, виділення та очищення рекомбінантного білка ЕМАР ІІ з клітин E.coli. У роботі використано штам-продуцент рекомбі- нантних білків, отриманий на основі реципієнта E.coli BL21(DE3)pLysE. Клітини були трансформовані за загальноприйнятою методикою плазмідною конструкцією pET30а-ЕМАР ІІ, що містила ген, який кодує синтез цільового білка ЕМАР ІІ під контролем промотора фага Т7. Селективним маркером плазміди pET30а є ген kan, який забезпечує стійкість трансформованих клітин до антибіотика канаміцина.

Штам-продуцент E.coli BL21(DE3)pLysE вирощували на середовищі Luria-Bertani (LB) з додаванням антибіотика канаміцина до кінцевої концентрації 30 мкг/мл. Культуру E.coli інкубували при температурі 37 °С та інтенсивному струшуванні (250 об/хв.) до досягнення нею оптичної густини 0,5-0,7 опт. од. Оптичну густину (ОГ600) визначали спектрофотометрично (спектрофотометр BioMate-5, Велика Британія) за довжини хвилі 600 нм.

Для індукції синтезу рекомбінантного білка до культурального середовища додавали індуктор ІПТГ(ізопропіл-р-тіогалактопіранозид, Sigma, США) до кінцевої концентрації 1,25 мМ та інкубували культуру при 37 ^оС протягом 4 годин після індукції експресії.

Рекомбінантний білок отримували із супернатанту клітин E.coli після їх лізису ультразвуком методом ме- тал-хелатуючої хроматографії на колонці з Ni-NTA агарозою (Qiagen, Germany) [16]. Аналіз бактеріальних білків виконували за допомогою SDS-гель- електрофорезу за методом Леммлі в денатуруючих умовах у 12 % розділяючому гелі [17], використовуючи суміш маркерних білків виробництва Thermo Scientific (Литва). Гелі фарбували Coomassie blue R-250.

Нанокомпозитний комплекс ЕМАР ІІ отримували шляхом додавання до рекомбінантного білка ліганду полісахариду декстран-70 у концентрації 1,5 % [2]. Для дослідження використовували нанокомпозитний комплекс ЕМАР II у вигляді ліофілізованого порошку білого кольору в ампулі з концентрацією 0,1 мг. Нанокомпози- тний комплекс добре розчиняється у дистильованій воді та фізіологічному розчині протягом декількох секунд з утворенням прозорого розчину.

Токсикологічні випробовування. Токсикологічні випробовування нанокомпозитного комплексу здійснювали на лабораторних самцях мишей лінії Balb/с, вирощених у віварії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України згідно зі стандартними вимогами щодо доклінічних досліджень лікарських засобів. Тварини утримувались в умовах віварію в стандартних клітках на підстилці з тирси дерев згідно з правилами групового тримання тварин. Харчовий раціон містив зерно, овочі, брикети з вітамінами та мінеральними складовими. Доступ до води був вільним, світловий режим природний. Для досліду відбирали здорових тварин з гладким шерстним покровом, нормальною активністю. Із загальної кількості відібраних тварин формували рівноцінні групи й розміщували по окремих клітках. Для приготування робочих розчинів використовували стерильну воду для ін'єкцій. Препарат тваринам вводили внутріш- ньом'язово в обсязі 0,1 мл/10 г маси тіла. Дози розраховували в мкг/кг маси тіла тварини. Як плацебо використовували воду для ін'єкцій. Експериментальні дослідження виконували на 24 мишах вагою 20-25 г. Нанокомпозитний комлпекс вводили одноразово мишам в дозах 300 мкг/кг, 1000 мкг/кг та 10000 мкг/кг, які перевищують очікувану терапевтичну дозу в 30-1000 разів. В експерименті оцінювали такі показники: 14-добову летальність (реєструвалася щоденно), загальний стан, поведінку, збудливість та рухову активність тварин, динаміку зростання маси тіла, порушення пози та координації рухів, макроскопічні зміни внутрішніх органів.

Для оцінки можливості хронічного впливу наноком- позитного комплексу на організм тварин використовували самців мишей лінії BALB, віком 2-3 місяці. Нано- композитний препарат ЕМАР ІІ підшкірно вводили мишам в дозах 300, 1000 мкг/кг маси тіла, що перевищує терапевтичну дозу в 30 та 100 разів відповідно протягом 30 діб. Загальну дію нанокомпозитного комплексу ЕМАР ІІ оцінювали за динамікою маси тіла тварин під час зважування 2 рази на тиждень. Вегетативний статус оцінювали по стану слизових, шерстяного покриву, наявності салівації, діареї, охайність тварин. Котрольна група мишей отримувала воду для ін'єкцій.

Результати та їх обговорення. Експресія, виділення та очистка рекомбінантного білка АІМР1/р43 з клітин E.coli. Білок ЕМАР ІІ було експре- совано в клітинах E.coli BL21(DE3)pLysE, як описано вище. Після здійснення бактеріальної експресії виконували афінне очищення рекомбінантного білка ЕМАР ІІ металхелатуючою хроматографією на Ni-NTA-агарозі. У результаті очищення отримано препарат білка ЕМАР ІІ високого ступеня чистоти (близько 95 %, рис. 1).

Дослідження токсичного впливу нанокомпози- тного комплексу ЕМАР ІІ на тварин. Раніше під час дослідження in vivo впливу рекомбінантного ЕМАР ІІ на розвиток ксенографтів аденокарциноми простати людини в організмі дорослих мишей лінії СВА було показано, що препарат в дозах 10, 100 та 200 мкг/кг ваги тварин у разі систематичного введення протягом 3 днів інгібує дозозалежним чином розвиток пухлини, але не виявляє токсичного ефекту на організм контрольних тварин [12].

Рис. 1. Електрофоретичний контроль чистоти отриманого препарату ЕМАРІІ.

1 - препарат ЕМАР ІІ після хроматографічного очищення; 2 - білкові маркери (Thermo Scientific)

Аналогічні дані були отримані під час вивчення дії ЕМАР ІІ на розвиток клітин С6 гліоми криси в організмі мишей у разі щоденного введення препарату цитокіну протягом 12 днів у дозах 8 та 80 мкг/кг [14]. Було показано, що період напіввиведення ЕМАР ІІ з плазми піддослідних мишей у разі внутрішньовенного введення дорівнює 47 хвилин [9].

Оскільки ЕМАР ІІ, як і більшість цитокінів, є нестабільним білком, то для його стабілізації ми використали декстран 70, який, як відомо, під час взаємодії з білками призводить до їх стабілізації та можливого підвищення біологічної активності.

Вивчення впливу комплексу ЕМАР ІІ з декстраном 70 на клітини раку простати людини лінії LNCaP вперше виявило цитотоксичну дію препарату на ракові клітини in vitro в дозах 1 та 10 мкг на мл середовища. Було показано, що інгібуючий ефект комплексу пов'язаний з розвитком апоптозу ракових клітин в культурі [18]. Цитотоксичний вплив комплексу ЕМАР ІІ з декстраном 70 був показаний також під час дослідження його дії на культури трансформованих клітинних ліній L929 фібробластів миші та PST тестикул поросяти [15].

Водночас вплив комплексу ЕМАР ІІ з декстраном 70 на організм тварин ще невідомий. Тому було вирішено протестувати його дію на тварин на модельному об'єкті та визначити межі можливої токсичності препарату. Які модельний об'єкт у роботі було взято мишей лінії Balb/с. Для вивчення дії цитокінового комплексу на організм мишей ми виходили з активно діючої на ракові клітини, згідно з літературними даними, дози 10 мкг/кг, яку перевищували до 1000 разів у разових дозах і до 100 раз перевищували для визначення хронічного впливу комплексу на тварин.

Експериментальні дослідження токсичного впливу нанокомпозитного препарату ЕМАР ІІ на мишах показали, що в разі введення препарату в разових дозах 30010 000 мкг/кг не спостерігається загальнотоксичної дії препарату, і він не спричинює загибель тварин. Одразу після введення препарату спостерігалася спонтанна рухлива збудливість. При цьому миші зберігали координацію рухів. Не було порушень дефекації, сечовипускання та інших ознак нейротоксичності. Стан слизових, шерстяний покрив та охайність залишалися без змін. Протягом наступних 14 діб спостереження за тваринами не виявлено змін в поведінці та загальному стані тварин. Спостерігалася і позитивна динаміка маси тіла. Зважування робили на 1, 7 та 14-ту добу після введення препарату. Результати зважування трьох піддослідних груп мишей, кожна з яких складалася з 6 особин, наведені в табл. 1

Таблиця 1. Динаміка маси тіла тварин у різних групах після введення нанокомпозитного комплексу ЕМАР ІІ