Кількісний та якісний склад мікробіоти дистального відділу товстої кишки щурів у різні терміни експериментального 6-он0а-викликаного паркінсонізму (пілотні дослідження)

Вступ

мікробіота товстий кишка паркінсонізм

Хвороба Паркінсона (ХП) це повільно прогресуюче нейродегенеративне захворювання, для якого характерна загибель дофамінергічних нейронів чорної субстанції (substantia nigra) головного мозку [1]. За статистичними даними Міністерства охорони здоров'я, нині в Україні на ХП страждають понад 75 тисяч чоловік. Ця хвороба діагностується з частотою 145 випадків на 100 тис. населення. Незважаючи на традиційні уявлення про віковий характер ХП, трапляються випадки захворювань у більш молодому віці: приблизно кожен десятий пацієнт хворіє на ХП у віці до 50 років, а кожен двадцятий до 40 років [2].

Протягом останнього десятиліття стало відомо про двонаправлений взаємозв'язок між шлунково-кишковим трактом (ШКТ) та центральною нервовою системою (ЦНС), або так звану вісь "кишечник-мозок", яка в свою чергу стимулювала перегляд концепцій, щодо патогенезу захворювань ЦНС, в тому числі ХП [3, 4].

Одним з механізмів регуляторного впливу кишкової мікробіоти, що регулює стан ЦНС є активація чотирьох типів їо//-подібних рецепторів (TLR-2, TLR-З, TLR-4, TLR-7) [5]. Ці рецептори зв'язуються з бактеріальними пептидами і викликають активацію нейронів ШКТ, в тому числі аферентних. З іншого боку бактерії здатні виробляти серотонін, мелатонін, у-аміномасляну кислоту (ГАМК), гістамін та ацетилхолін, які відомі, як медіатори ЦНС та периферійної нервової системи. Порушення синтезу цих молекул потенційно може викликати зміни в стані ЦНС і сприяти ускладненню захворювання [6].

На сьогодні існує дві позиції щодо першопричин розвитку ХП: одні схиляються до гіпотези Браака, що ХП є багатоцентровим нейродегенеративним процесом, який впливає на кілька нейрональних структур за межами чорної субстанції, серед яких ентеральна нервова система (ЕНС). Тому помітні розлади з боку ШКТ розвиваються на ранній стадії захворювання (раніше залучення ЦНС), через токсичні та прозапальні субстанції, які проникають у системну циркуляцію з просвіту товстої кишки, в результаті підвищення проникності його епітелію. Інша частина науковців схиляється до того, що зміни у функціонуванні кишечника та кишкової мікробіоти не є центральним чинником в розвитку ХП, а є вторинними причинами нейродегенерації, які приєднуються згодом. Тому ретельне дослідження механізму патогенезу ХП не втрачає своєї актуальності [7].

Було виявлено, що 20-77 % пацієнтів з ХП ще задовго до прояву моторних симптомів страждають на дисфункції ШКТ, такі як гастропарези, анорексії, відчуття переповнення шлунку, нудоти; патологію дистального відділу кишечника (у вигляді закрепів, зниження швидкості кишкового транзиту) [8, 9]. Ці розлади є серйозною супутньою патологію даної хвороби [10]. Недавні дослідження показали високу поширеність (54-67 %) надмірної колонізації тонкої кишки в разі ХП та можливу їх асоціацію із симптомами запалень ШКТ і зниженою моторикою шлунку [11, 12].

Таким чином, визначення змін нормобіоти кишечника може бути прогностичним фактором та критерієм для формування груп ризику розвитку ускладнень перебігу ХП, а також основою для розробки нових пробіотичних препаратів, що підтримують інтегративну цілісність кишкового бар'єру і нормального функціонування осі "кишечник-мозок", на основі специфічних змін мікробіоти ШКТ в разі ХП.

Метою цієї роботи було дослідження кількісного та якісного складу просвітної мікробіоти товстої кишки в різні терміни після моделювання 6-гідроксидофамін (6-OHDA)-викликаного паркінсонізму у щурів.

1. Матеріали та методи

Об'єктом дослідження була просвітна мікробіота товстої кишки щурів. Дослідження проведені на лабораторних білих нелінійних щурахсамцях (140-160 г, n = 7), які утримувались за стандартних умов щодо температури (21-23 °С), освітлення (12/12 год), вологості (30-35 %) та раціону харчування (повнораціонний корм для лабораторних тварин К-12-4) віварію ННЦ "Інститут біології та медицини". Експерименти здійснювали згідно з вимогами біоетичної комісії Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Паркінсонізм моделювали в 4 щурів шляхом однобічного руйнування дофамінергічних нейронів компактної частини чорної субстанції, що викликали шляхом стереотаксичних мікроін'єкцій 12 мкг селективного нейротоксина 6-OHDA (Sigma-Aldrich, Німеччина) в лівий латеральний висхідний передньомозговий пучок [13]. Контрольній групі тварин (n = 3) вводили фізіологічний розчин. Через 2 тижні після операції у щурів з 6-OHDA-ХП оцінювали відсоток зруйнованих нейронів відповідно до результатів апоморфінового тесту [13]. Тваринам вводили апоморфін в дозі 0,5 мг/кг, внутрішньочеревинно

(Sigma-Aldrich, Німеччина) та спостерігали за їх обертальною поведінкою протягом 30 хв. У щурів, що мали чітку циркуляторну активність з інтенсивністю < 180 об/30 хв, у результаті дії 6-OHDA було зруйновано в середньому 86 % дофамінергічних нейронів (n = 2), а з інтенсивністю > 180 об/30 хв майже 100 % (n = 2).

Для дослідження просвітної мікробіоти, відбирали 1 г фекалій та гомогенізували їх в 9 мл стерильного 0,5 % розчину хлориду натрію. З отриманого гомогенату готували робочі десятикратні розведення (10-1-10-8). Кількісний та якісний склад мікробіоти визначали посівом робочих розведень на диференційно-діагностичні середовища з селективними властивостями (HiMedia, Індія). Культивували при 37°С, обрахунок колоній здійснювали через 24-48 год. Ідентифікацію виділених мікроорганізмів робили за морфологічними та тинкторіальними властивостями. Результати представляли у вигляді lg колонієутворюючих одиниць (КУО) в 1 г фекалій (lg КУО/г).

Динаміка рухових розладів у щурів з 6-OHDAіндукованою моделлю ХП свідчить про те, що ступінь вираження симптомів хвороби досягає максимуму через 1 місяць після хірургічного втручання. Тому, дослідження здійснювали через 1, 1.5 та 2 місяці після моделювання ХП. Початком експерименту вважали перший день введення 6-OHDA або контрольної речовини.

Статистичний аналіз даних здійснювали з використанням програми Statistica 8.0. Для кожної з вибірок перевіряли чи є нормальним розподіл досліджуваного показника, застосовуючи критерій Шапіро-Вілка. Для порівняння вибірок підраховували середнє арифметичне та середнє статистичне відхилення. Достовірність різниці між порівнюваними групами оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента. Статистично значущою для всіх показників вважали різницю р < 0,05.

Результати та їх обговорення. Під час бактеріологічного аналізу змін мікробіоти передусім звертали увагу на кількісні зміни представників анаеробноцукролітичної мікробіоти (табл. 1). Оскільки відомо, що Bifidobacterium та Lactobacillus здатні синтезувати ГАМК, яка є основним гальмівним нейромедіатором ЦНС і мішенню для великого арсеналу ліків. На відміну від його ролі в ЦНС, ГАМК залучається до ЕНС, зокрема через GABAA-рецептори. ГАМК стимулює моторику ШКТ, а також забезпечує перистальтичний рефлекс товстої кишки. Слід відміти, що ГАМК не перетинає гематоенфефалічний бар'єр, проте її участь в осі "кишечник-мозок" є доведеною [14]. У наших дослідженнях кількісні показники представників родів Bifidobacterium та Lactobacillus залишалися в межах контрольних значень протягом усього експерименту.

Таблиця 1 Зміни просвітної мікробіоти дистального відділу товстої кишки щурів у різні терміни 6-ОНDA-індукованого паркінсонізму

Примітка: *р < 0,05 порівняно з контролем.

Роль представників роду Clostridium в організмі людини має досить суперечливий характер: з одного боку вони є одними з основних продуцентів бутирату, який є енергетичним субстратом для епітеліоцитів кишечнику; з іншого боку, нещодавно виявлено, що Clostridium sporogenes здатен виробляти нейротрансмітерний триптамін через декарбоксилювання триптофану. У мозку триптамін відіграє важливу роль у пригніченні реакції на 5-НТ-серотонінові рецептори через його дію на рецептор, пов'язаний з аміном, і може модулювати настрій та апетит. Хоча триптамін насправді може перетинати гематоенцефалічний бар'єр із сироватки, але поки невідомо, чи триптамін, що виробляється кишковою мікробіотою переноситься з травного тракту до ЦНС і чи потім впливає на неврологічні функції [15].

За модельованого нами паркінсонізму, у щурів достовірних змін у складі представників роду Clostridium зареєстровано не було, помічали лише тенденцію до їх збільшення через 2 місяці від початку експерименту.

Бактерії, що метаболізують лактозу, розглядалися як лактозопозитивні Escherichia coli, а бактерії, що не здатні до ферментації як лактозонегативні E.coli. Наприклад, чисельність лактозопозитивної E.coli достовірно (р < 0,05) зростала через 1,5 та 2 місяці від початку експерименту. Водночас кількість лактозонегативої E.coli знижувалась на 2-3 порядки.

Тенденція до збільшення кількості E.coli, яка у своїй клітинній стінці має ліпополісахарид (ЛПС), здатна індукувати локальний синтез альфа-синуклеїну, що може сприяти розвитку нейродегенеративного процесу. З одного боку, доведеною є роль ЛПС, як ендотоксинів, що сприяють розвитку нейропорушень, зокрема судомам, а з іншого боку, нещодавно (у 2017 році) вченими з Мічиганського університету та Імперського коледжу Лондона доведено, що E.coli продукує протеїн, здатний інгібувати токсичний амілоїд, що накопичується в разі ХП та інших нейродегенеративних захворювань. Амілоїд утворюється внаслідок накопичення протеїнів всередині клітин тканини, де він викликає загибель клітин і, як наслідок, порушення нормального функціонування органу. Кишкова паличка здатна продукувати амілоїд у вигляді волокон карліну, які відкладаються не у середині клітини, а ззовні, що не призводить до загибелі клітин [16].

У ході експерименту, також визначалися бактерії за своєю здатністю зброджувати маніт: патогенний Staphylococcus aureus, який здатний до ферментації, і сапрофітний Staphylococcus epidermidis, який маніт не ферментує. Було показано, що чисельність Staphylococcus epidermidis достовірно збільшувалася через 2 місяці після моделювання паркінсонізму в 1,5 раза порівняно з контролем. Водночас кількість Staphylococcus aureus залишалася незмінною протягом усього експерименту.

Ali Keshavarzian з колегами показали, що зміна мікробіоти товстої кишки та дисбактеріоз може бути механізмом нейрозапалення, що призводить до розвитку ХП. Вони також показали, що відбуваються зміни у кількісному складі таксонів бактерій. У хворих на ХП зменшується кількість бактерій родини Bifidobacteridaceae та збільшується чисельність Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Enterobacteriaceae [12].

Отримані дані свідчать про незначні зміни мікробіоти за розвитку 6-OHDA-викликаного паркінсонізму. Проте, проведені нами дослідження мають ряд обмежень: по-перше, використаний нами метод бактеріологічного посіву дозволяє ідентифікувати лише 10 % мікроорганізмів здатних до культивування в стандартних умовах; по-друге досліджували мікробіоту фекального біоптату, яка є наближеною до клінічної практики, тоді як склад приепітеліальної мікробіоти та склад слизу є більш достовірним показником стану кишкового бар'єру.

Загалом, зміни мікробіоти ШКТ можна розглядати, як наслідок розвитку ХП. Оскільки, нервова система здатна впливати на кишечник та його нормобіоту через зміни моторики, секреції ферментів, гормонів, компонентів слизового бар'єру і т. д. У наших попередніх дослідженнях було виявлено, що у щурів з 6-OHDAвикликаним паркінсонізмом спостерігається затримка моторики товстої кишки [17]. Ці зміни можуть бути використані як ранній біомаркер розвитку ХП, коли нейромоторні симптоми ще не проявляються.

Висновки

Нами виявлено, що розвиток експериментального паркінсонізму асоціюється зі змінами складу просвітної мікробіоти, які прогресують у часі. Зокрема, з другого місяця від початку експерименту помічали тенденцію до зростання представників роду Clostridium; кількість E.coli, що ферментує лактозу, достовірно зростала на 2 порядки, і зовсім не висівались її лактозонегативні представники; реєстрували помірне зростання манітонегативних представників роду Staphylococcus.

Список використаних джерел