Сверхэкспрессия аденовирусного Е1А сенсибилизирует клетки, трансформированные E1A+Ras, к действию ингибиторов гистоновых деацетилаз

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт цитологии РАН

Сверхэкспрессия аденовирусного Е1А сенсибилизирует клетки, трансформированные E1A+Ras, к действию ингибиторов гистоновых деацетилаз

М.В. Иготти, С.Б. Светликова, В.А. Поспелов



РЕФЕРАТ

Аденовирусный белок Е1А рассматривается в качестве потенциального средства комплексной терапии злокачественных опухолей. Наибольший цитотоксический эффект E1A в опухолевых клетках наблюдается при совместном применении с ингибиторами гистоновых деацетилаз (ИГД). Однако ранее мы установили, что ИГД не вызывают апоптотической гибели клеток, трансформированных E1A и активированным cHa-ras. В представленной работе показано, что в таких клетках ИГД подавляют транскрипцию с собственного промотора гена Е1А, что приводит к развитию клеток преимущественно по cHa-ras- зависимому пути, который вызывает активацию антиапоптотических каскадов PI3K/Akt и NF-kB. Однако ИГД способны индуцировать апоптотическую гибель клеток E1A+Ras при условии высокой нерегулируемой экспрессии E1A с цитомегаловирусного промотора, активность которого не подавляется ИГД. Таким образом, для эффективного цитотоксического воздействия ИГД и Е1А на клетки опухоли оптимальной является экспрессия гена Е1А с промотора, независимого от ИГД.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аденовирус, апоптоз, E1A, cHa-ras, ингибиторы гистоновых деацетилаз (ИГД), трансформированные клетки.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИГД - ингибиторы гистоновых деацетилаз; mERas - эмбриональные фибробласты мыши, трансформированные cHa-ras и E1A; NaBut - бутират натрия.



ВВЕДЕНИЕ

Ранний ген E1A аденовируса человека типа 5 экспрессируется в инфицированной клетке и обеспечивает условия для репликации вируса [1]. В первое время E1A считали онкогеном из-за его способности иммортализовать клетки грызунов и в кооперации с другими онкогенами трансформировать их [2, 3]. Позднее обнаружили, что E1A проявляет противоопухолевую активность [4], в связи с чем его иногда рассматривают как опухолевый супрессор.

Трансформирующая активность Е1А определяется его способностью дерегулировать клеточный цикл, связываясь и изменяя активность таких клеточных факторов, как белки семейства pRb [5-7], а также ингибиторы циклинзависимых киназ р21Waf1 [8, 9] и p27Kip1 [10]. E1A взаимодействует также с белками, ремоделирующими хроматин, включая гистон-ацетилтрансферазы (p300/CBP) [11] и гистоновые деацетилазы [12], что приводит к изменению транскрипции ряда генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Известно, что ДНК и белок E1A аденовируса обнаруживаются в клетках легочного эпителия пациентов с хронической обструктивной болезнью легких [13]. Однако, как уже сказано, Е1А обладает противоопухолевой активностью и является объектом клинических исследований [14, 15]. Многие экспериментальные данные свидетельствуют о том, что экспрессия аденовирусного белка Е1А повышает чувствительность раковых клеток млекопитающих к действию ряда цитотоксических агентов, используемых в противоопухолевой терапии, таких, как этопозид, циспла- тин, таксаны и др. [16-19]. При этом совместное действие Е1А-генотерапии и ИГД приводило к более существенному повышению уровня гибели раковых клеток при минимальном негативном воздействии на нормальные клетки, чем действие таксола или этопозида [19].

Аденовирусный Е1А способствует апоптотической гибели клеток, модулируя экспрессию генов, регулирующих апоптоз [17-19], активацию МАР-киназы p38 [17] и подавление антиапоптотического фактора NF-kB [20, 21]. Также Е1А стабилизирует р53 через модификацию убиквитин-протеасомного механизма [16, 22], в результате чего в клетках, экспрессирующих белок E1A аденовируса, устанавливается повышенное содержание белка p53, что приводит к р53- зависимому апоптозу [16].

Уровень апоптоза в клетках, экспрессирующих Е1А, может быть снижен комплементирующим трансформирующим онкогеном ras, который, стимулируя киназный каскад Ras/Raf/MEK/ERK, активирует антиапоптотический каскад PI3K/Akt и NF-kB [23]. Антиапоптотические функции Ras связаны также с его способностью стимулировать экспрессию антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL [23]. Так, действие проапоптотического белка Е1А и онкогенного Ras сбалансировано в эмбриональных фибробластах мыши, стабильно трансформированных вектором, кодирующим cHa-ras, и плазмидой, кодирующей белок E1A аденовируса человека типа 5 [24].

Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ИГД) подавляют рост опухолевых клеток, вызывая остановку клеточного цикла, старение или апоптоз, не оказывая при этом токсического воздействия на нормальные клетки [25, 26]. Поэтому ИГД рассматривают как вещества, имеющие перспективы в качестве противоопухолевых препаратов.

Ранее мы показали, что ИГД вызывают остановку клеточного цикла и старение клеток, трансформированных онкогенами cHa-Ras и E1A [27-29], но не индуцируют их гибель, что в значительной степени отличает эти клетки от ряда опухолевых клеток, где ИГД стимулируют апоптотическую гибель [25, 26]. Поэтому мы изучали причины отсутствия апоптотической гибели клеток, экспрессирующих Е1А с активированным Ras, при действии ИГД. Установлено, что способность клеток, трансформированных E1A и cHa-ras, избежать гибели при воздействии ИГД обусловлено ИГД-зависимым снижением экспрессии Е1А и активации антиапоптотического фактора NF-kB. Соответственно индукция апоптоза в E1A+Ras-трансформированных клетках ингибиторами гистоновых деацетилаз возможна только при условии нерегулируемой экспрессии Е1А.



ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии

Исследования проводили на линии эмбриональных фибробластов мыши, стабильно трансформированных вектором, кодирующим cHa-ras, и плазмидой p1A, содержащей нуклеотиды 1-1634 генома аденовируса человека типа 5, кодирующие белок E1A [16, 24]. Клетки обрабатывали NaBut (4 мМ) в течение 24-72 ч.

Распределение клеток по содержанию ДНК

Распределение клеток по содержанию ДНК изучали методом проточной цитофлуориметрии. Клетки промывали раствором PBS (0.14 М NaCl, 2.7 мМ KCl,мМ Na₂HPO₄, 1.5 мМ KH₂PO₄, рН 7.2), пермеабили- зировали сапонином в конечной концентрации 0.01% в течение 20 мин и многократно отмывали от сапонина раствором PBS. Затем клетки инкубировали в присутствии РНКазы А (100 мкг/мл) и йодида про- пидия (10 мкг/мл, 15 мин при 37⁰С) с последующим анализом на проточном цитофлуориметре Coulter Epicks XL (Bechman, США).

Жизнеспособность клеток

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Для этого клетки рассевали на 96-луночные планшеты в плотности 2 х 10³ клеток на ячейку и культивировали в присутствии или в отсутствие соответствующих ингибиторов в течение 24 ч. Жизнеспособность определяли спектрофотометрически, оценивая метаболическую активность клеток по способности восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) (Sigma) в нерастворимый пурпурный формазан. Клетки инкубировали в растворе МТТ в конечной концентрации 0.5 мг/мл, приготовленном на PBS (1.5 ч при 37⁰С в СО₂-инкубаторе), после чего удаляли среду культивирования, а клетки суспендировали в диметилсульфоксиде (ДМСО). Определяли оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 570 нм на Multiscan-EX (Labsystems), используя ДМСО в качестве нулевого контроля.

Иммуноблотинг белков

Клетки лизировали в буфере, содержащем 1% NP-40, 0.5% дезоксихолата натрия, 0.1% додецил- сульфата натрия (SDS), ингибиторы протеаз и фосфатаз. Белки разделяли электрофоретически, переносили на мембрану PVDF (Millipore) и анализировали с помощью соответствующих специфических антител. Белки на мембранах выявляли методом усиления хемилюминесценции (Thermo Sci., США). Использовали антитела против белков E1A (M73) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., США), Gapdh (14C10) (Cell Signalling, США) и pan-Ras (Oncogene Sci., США).

Анализ транскрипции генов

Клеточную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя 2 мкг РНК. Реакцию амплификации (ПЦР) проводили в присутствии 100 нг соответствующих праймеров к кДНК генов е1а и gapdh мыши: 5'-TGTGATGGGTGTGAACCACG-3'/5'- CCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'. ПЦР в пределах линейной амплификации фрагментов ДНК продолжалась в течение 25-35 циклов. Специфический продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

Активность каспазы-3

Активность каспазы-3 in vitro оценивали по разрезанию специфического колориметрического субстрата Ac-DEVD-pNA (Calbiochem). Клетки лизировали в течение 20 мин при +4⁰C в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5; 120 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1% NP-40 и ингибиторы протеаз. Активность каспаз определяли на 96-луночных плато в 40 мкл лизатов, смешанных с 160 мкл реакционного буфера (20% глицерин; 0.5 мМ EDTA; 5 мМ ДТТ; 100 мМ HEPES, pH 7.5) с субстратом Ac-DEVD-pNA. Эффективность разрезания субстрата определяли спектрофотометрически по накоплению п-нитроанилида при длине волны 405 нм на планшетном спектрофотометре Multiscan-EX (Labsystems).

Временные трансфекции и анализ люциферазной активности

Клетки трансфицировали, используя реагент Lipofectamine-2000 (Invitrogen), по протоколу фирмы-производителя. Для трансфекции использовали люциферазный репортерный вектор, содержащий три копии NF-xB-связывающих последовательностей (3 х xB-luc). В качестве внутреннего контроля использовали экспрессию люциферазы Renilla. Через 24 ч после трансфекции клетки обрабатывали 4 мМ NaBut, а через 48 ч подвергали процессингу согласно инструкции производителя для измерения активности люциферазы. Люциферазную активность определяли на люминометре TD-20/20 (Turner Designs). Каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибитор гистоновых деацетилаз бутират натрия подавляет экспрессию аденовирусного Е1А

Чтобы выяснить причины отсутствия ожидаемого цитотоксического эффекта ИГД в Е1А- экспрессирующих клетках, мы проанализировали влияние ИГД бутирата натрия (NaBut) на экспрессию трансформирующих онкогенов. Представленные на рис. 1 данные показывают, что экспрессия Е1А снижается в присутствии NaBut. Так в ЭФК, транс-

Рис. 1. Снижение экспрессии Е1А при действии NaBut в клетках, экспрессирующих E1A. А - ОТ-ПЦР-анализ транскрипции гена E1A в клетках mERas, необработанных (-) и обработанных в течение 16 ч NaBut (+).



Б - иммуноблотинг белков из клеток mERas, необработанных или обработанных NaBut в течение 24-72 ч (верхняя панель) или 2.5 мкМ SAHA (нижняя панель) с антителами против Е1А аденовируса человека типа 5 (E1A5Ad). В - иммуноблотинг белков из клеток HEK- 293 с антителами против E1A5Ad. Г - иммуноблотинг белков из клеток mERas с антителами против panRas

формированных онкогенами E1A и cHa-Ras (линия mERas), уже в первые часы действия NaBut снижается как транскрипция гена E1A (рис. 1А), так и количество белкового продукта Е1А (рис. 1Б). Специфичен ли наблюдаемый эффект для конкретной клеточной линии и используемого ИГД? Чтобы понять это, мы проанализировали экспрессию Е1А в трансформированных линиях человека, а также использовали альтернативные ИГД. Оказалось, что вальпроевая кислота (VA), трихостатин А (TSA) (данные не представлены) и вориностат также приводили к уменьшению Е1А в трансформантах mERas (рис. 1Б, нижняя панель). Результаты, приведенные на рис. 1В, показывают, что снижение экспрессии Е1А при действии ИГД не является специфичным только для линии mERas. Методом иммуноблотинга показано, что в присутствии NaBut уменьшается количество белка Е1А в трансформированных клетках почечного эпителия человека HEK-293. Результаты иммуноблотинга показывают, что экспрессия белка Ras не изменяется при действии NaBut (рис. 1Г). Таким образом, установлено, что ИГД подавляют экспрессию аденовирусного E1A, тогда как экспрессия Ras не модулируется ИГД.

Выявленное нами снижение содержания белка Е1А при действии ИГД может приводить к сдвигу баланса активностей трансформирующих белков в клетках mERas. При этом доминирующим становится действие онкогенного Ras. Мы предположили, что низкий уровень апоптотической гибели клеток, трансформированных E1A+Ras, в присутствии ИГД связан со снижением экспрессии проапоптотического белка E1A и активацией антиапоптотического каскада Ras/Akt/NF-xB.

Рис. 2. Иммуноблотинг белков клеток mERas (верхняя панель) и MER-E1A (нижняя панель), обработанных №В^ в течение 24-72 ч, с антителами против E1A5Ad

Получение E1A+Ras-трансформированной клеточной линии, с нерегулируемой ИГД экспрессией Е1А

Клеточную линию mERas-1A получали с использованием плазмиды p1A, которая содержит нуклеотиды 1-1634 генома аденовируса человека типа 5, кодирующие белок E1A [16, 24]. В этих клетках экспрессия гена Е1А регулируется собственным промотором. Чтобы проверить гипотезу, согласно которой снижение экспрессии Е1А необходимо для уменьшения индуцируемого ИГД апоптоза, мы сначала на основе клеток mERas создали клеточную линию MER-E1A, которая дополнительно экспрессирует белок E1A 12S под контролем нерегулируемого в этих условиях промотора цитомегаловируса (CMV). Регуляция и активность вирусных промоторов CMV и Ad5 имеют существенные различия. Это позволяет использовать их с различной целью в клетках-мишенях. Высокоактивный промотор CMV удобен для эффективной экспрессии трансгена.

На рис. 2 представлены результаты иммунобло- тинга, показывающие как NaBut влияет на экспрессию белка Е1А в исходной клеточной линии mERas (верхняя панель) и в новой клеточной линии MER- E1A с конститутивной экспрессией Е1А под контролем промотора CMV (нижняя панель). В контрольных клетках mERas экспрессия Е1А снижается практически до нуля уже в первые часы действия NaBut и находится на низком уровне на протяжении всего времени исследования (до 72 ч). Однако в клетках линии MER-E1A белок Е1А 12S экспрессируется на высоком уровне независимо от NaBut.

Таким образом, нами получена линия трансформированных клеток грызунов, экспрессирующая аденовирусный ген E1A под контролем промотора CMV, в которой экспрессия E1A не снижается при действии ИГД.

Бутират натрия индуцирует апоптоз только в E1A+Ras-трансформированных клетках, количество E1A в которых не снижается при действии ИГД

Далее сравнили влияние ИГД на пролиферацию ElA+Ras-трансформированных клеток, в которых E1A экспрессируется под контролем собственного промотора, и в клетках, где экспрессия E1A регулируется промотором CMV. Мы оценили влияние NaBut на жизнеспособность клеток в зависимости от характера экспрессии Е1А. Контрольные клетки mERas и клетки MER-E1A с нерегулируемой экспрессией E1A обрабатывали NaBut в течение 24-72 ч и определяли их жизнеспособность, используя тест МТТ. Как показано на рис. 3, жизнеспособность контрольных клеток mERas, обработанных NaBut, снижается сильнее, чем необработанных. Однако количество формазана, характеризующего жизнеспособность клеток, повышается при увеличении продолжительности воздействия NaBut на клетки mERas, отражая тот факт, что клетки не делятся, но остаются живыми. Количество жизнеспособных клеток MER-E1A при этом снижается ниже стартового уровня, что указывает на их гибель.

Рис. 3. NaBut подавляет жизнеспособность клеток mERas и MER-E1A в разной степени.

Контрольные клетки mERas и клетки MER-E1A, стабильно экспрессирующие E1A, обрабатывали NaBut в течение 24-72 ч и определяли их жизнеспособность с помощью МТТ- теста. Изменение жизнеспособности (разы) оценивали относительно жизнеспособности необработанных клеток через 24 ч после посева.

Чтобы проверить предположение об индукции гибели клеток с нерегулируемой экспрессией E1A под действием NaBut, мы проанализировали распределение клеток по содержанию ДНК на проточном цитофлуориметре. На рис. 4А приведено распределение клеток после временной трансфекции. Видно, что NaBut не вызывает увеличения субдиплоидного пика в клетках, трансфицированных пустым контрольным вектором pcDNA3 (рис. 4А, верхняя панель). При этом в клетках, трансфицированных CMV-E1A, доля клеток с субдиплоидным содержанием ДНК увеличивается в 2 раза уже через 48 ч после действия NaBut (рис. 4А, нижняя панель).

Полученные данные указывают на существенную разницу в характере ответа клеток на ИГД в зависимости от того, как ИГД модулируют экспрессию E1A.

Соответствующие результаты получены в стабильных клонах со сверхэкспрессией Е1А под промотором CMV (MER-E1A). В контрольных клетках mERas NaBut и через 72 ч не вызывал характерного для гибнущих клеток увеличения субдиплоидного пика в гистограмме распределения по содержанию ДНК (рис. 4Б). При этом в клетках линии MER-E1A через 72 ч после действия NaBut 35% клеток содержали фрагментированную ДНК.

Таким образом, показано, что NaBut индуцирует гибель только тех Ras-трансформированных клеток, в которых экспрессия Е1А не снижается при действии NaBut.

Мы проанализировали активность каспазы-3, опосредующей передачу апоптотического сигнала. Для этого клетки, трансфицированные pcDNA3 или CMV-E1A, оставляли необработанными или обрабатывали NaBut в течение 24 ч, после чего определяли активность каспазы-3 in vitro в клеточных лизатах. Оказалось, что в контрольных клетках, трансфицированных pcDNA3, NaBut вызывает снижение активности каспазы-3, как в исходных клетках mERas [30]. При этом в клетках, трансфицированных CMV-E1A, активность каспазы-3 не снижается при действии NaBut (рис. 4В). Различия в регуляции активности каспазы-3 ИГД в зависимости от модуляции экспрессии E1A соответствуют полученным нами данным о различиях в пролиферативном ответе таких клеток на ИГД.

Рис. 4. Аденовирусный Е1А изменяет влияние NaBut на трансформированные клетки.

А - распределение клеток по содержанию ДНК. Клетки mERas трансфицировали контрольным вектором pcDNA3 (верхняя панель) или экспрессионным вектором CMV-E1A (нижняя панель) и через 24 ч обрабатывали NaBut в течение 48 ч. Б - распределение стабильных клонов по содержанию ДНК. Контрольные клетки mERas или клетки MER-E1A, стабильно экспрессирующие E1A, обрабатывали NaBut в течение 72 ч. В - относительная активность каспазы-3 в клетках mERas, трансфицированных pcDNA3 (светло-серые столбики) или CMV-E1A (темные столбики), необработанных (Ctrl) или обработанных NaBut в течение 24 ч. Г - относительная активность люциферазы, транскрибируемой с NF-xB-регулируемого промотора. Клетки mERas котрансфицировали репортерным вектором 3xxB-luc совместно с пустым вектором pcDNA3 (светло-серые столбики) или с экспрессионным вектором CMV-E1A (темные столбики) и обрабатывали NaBut спустя 24 ч после трансфекции в течение 24 ч.

Активность NF-kB не возрастает при действии NaBut в клетках с нерегулируемой экспрессией E1A

Ранее было показано, что ИГД активируют антиа- поптотический фактор NF-xB в клетках, трансформированных E1A и cHa-ras [30]. Это позволяет трансформантам избегать апоптоза при действии ИГД. Поэтому мы сравнили влияние ИГД на активность NF-xB в клетках с регулируемой и нерегулируемой экспрессией Е1А. Для этого исходные клетки mERas котрансфицировали вектором 3XxB-luc, содержащим ген люциферазы под промотором, регулируемым NF-xB, а также либо экспрессионным вектором CMV-E1A, либо пустым вектором pcDNA3 в качестве контроля. Спустя 24 ч после трансфекции клетки оставляли необработанными, либо обрабатывали NaBut в течение 24 ч, и измеряли активность лю- циферазы в лизатах. Оказалось, что в контрольных клетках (pcDNA3) NF-xB-зависимая транскрипция увеличивалась при действии NaBut в 3 раза, тогда как в клетках с нерегулируемой высокой экспрессией E1A (CMV-E1A) активность NF-xB не изменялась (рис. 4Г). Нами установлено, что нерегулируемая высокая экспрессия аденовирусного E1A с промотора CMV препятствует ИГД-зависимой активации ан- тиапоптотического фактора NF-xB. Таким образом, подавление активности NF-xB аденовирусным E1A является одной из причин индукции апоптоза ИГД в этих клетках.

Клетки с нерегулируемой экспрессией Е1А не накапливают маркер клеточного старения SA-Я-Gal при действии NaBut

Клеточное старение и апоптоз - альтернативные антипролиферативные программы, которые индуцируются цитотоксическимии стресс-факторами. Ранее было показано, что ИГД индуцируют старение клеток, трансформированных онкогенами cHa-Ras и E1A [27-29]. Запуск программы старения в этих клетках, вероятно, связан с тем, что под действием ИГД снижается уровень экспрессии E1A, что приводит к доминированию процессов, индуцируемых активированным Ras, а именно, программы клеточного старения [31]. Чтобы проверить предположение, согласно которому клеточное старение не индуцируется в тех ElA+Ras-трансформированных клетках, экспрессия E1A в которых не подавляется ИГД, мы проанализировали экспрессию маркера стареющих клеток SA-Я-Gal. Результаты световой микроскопии, приведенные на рис. 5, показывают, что почти во всех контрольных трансформантах mERas через 72 ч действия NaBut выявляется SA- Я-Gal, что указывает на индукцию клеточного старения. Тогда как в клетках MER-E1A маркер SA- Я-Gal не накапливается. Стоит отметить, что после воздействия NaBut в течение 72 ч очень мало клеток MER-E1A оставалось прикрепленными к стеклам для дальнейшей окраски на SA-Я-Gal, а большинство клеток погибало и всплывало. Таким образом, можно заключить, что NaBut индуцирует клеточное старение в клетках, трансформированных E1A и Ras, если экспрессия Е1А снижается при действии NaBut, тогда как трансформанты с конститутивной экспрессией Е1А подвергаются гибели, а не старению.



Рис. 5. Бутират натрия не вызывает старение в клетках с нерегулируемой экспрессией Е1А. Окрашивание SAP-Gal. Клетки mERas и MER-E1A обрабатывали NaBut в течение 72 ч, после чего фиксировали и окрашивали на SA-P-Gal

ОБСУЖДЕНИЕ

аденовирусный белок гистоновый

Аденовирусный E1A иммортализует и трансформирует в кооперации с активированным Ras или другими онкогенами первичные клетки грызунов [2, 3]. В связи с этим Е1А рассматривали как онкобелок, несмотря на то, что он не был ассоциирован ни с какой онкогенной активностью. Позднее обнаружили, что E1A проявляет противоопухолевую активность [2, 17-19]. Сверхэкспрессия E1A вызывает остановку пролиферации и апоптоз опухолевых клеток человека in vitro [4, 16]. Причем именно апоптоз играет ключевую роль в противоопухолевой активности E1A. В ряде доклинических исследований было показано, что липосомная или аденовирусная доставка гена E1A подавляет рост и метастазирование опухолей у животных [17, 32]. Клинические испытания генной моно-, а также комбинированной терапии с применением E1A при раке различной локализации показали рациональность такого подхода [14, 33, 34]. В последнее время усилия многих ученых направлены на изучение возможности терапии с использованием онколитических вирусов на основе аденовируса типа 5 человека (Ad5) [35]. По данным портала ClmicalTrials. gov Национального института здоровья, к настоящему моменту проведено более 180 клинических испытаний с использованием аденовирусов в той или иной форме. Основной мишенью при создании онколитических аденовирусов с ограниченной репликативной способностью является ген, кодирующий Е1А, благодаря способности белка Е1А побуждать покоящуюся клетку к делению за счет секвестрирования опухолевого супрессора pRb. Принимая во внимание потенциальную значимость аденовирусов и аденовирусного Е1А в противоопухолевой терапии, подробное изучение функционирования и регуляции E1A, приводящие к сенсибилизации клеток к действию цитостатиков, является актуальной задачей молекулярной биологии.

Многие исследования указывают на усиление цитотоксического эффекта при совместном использовании ИГД и аденовирусного E1A в опухолевых клетках [19, 36, 37]. ИГД не вызывали гибель использованных нами клеток, трансформированных онкогенами cHa-ras и E1A. Однако бутират натрия индуцировал апоптоз в этих клетках, если аденовирусный Е1А экспрессировался под ИГД-нерегулируемым промотором. В работах, описывающих усиление цитотоксического эффекта при совместном использовании Е1А и ИГД, Е1А экспрессировался не с собственного промотора, а с промотора цитомегаловируса (CMV) или каталитической субъединицы теломеразы (TERT), активность которых не подавляется, а стимулируется ИГД [19, 38-40]. Следовательно, наши результаты подтверждают данные об эффективности совместного использования ИГД и Е1А для элиминирования злокачественно трансформированных клеток при условии повышенной нерегулируемой экспрессии Е1А. Приоритетность наших результатов заключается в том, что мы показали способность ИГД подавлять экспрессию Е1А на нескольких уровнях. Во-первых, при действии NaBut снижается транскрипция гена Е1А (рис. 1А). Регуляция экспрессии E1A к настоящему моменту изучена недостаточно. Не опубликованы данные о роли ацетилтрансфе- раз или деацетилаз в регуляции транскрипции E1A. Ингибирование деацетилаз гистонов активирует транскрипцию генов через релаксацию структуры хроматина. С другой стороны, ИГД могут ингибировать или активировать транскрипцию, изменяя уровень ацетилированности факторов транскрипции [41]. Таким образом, показанное нами ингибирование транскрипции E1A опосредовано скорее модуляцией гистоновыми деацетилазами активности факторов транскрипции, вовлеченных в регуляцию экспрессии E1A. В энхансерной области промотора гена ранней области Е1А наряду с иными регуляторными элементами присутствуют два участка связывания транскрипционных факторов семейства E2F [42]. Отсутствие этих участков полностью подавляет экспрессию Е1А, что указывает на исключительную значимость E2F-связывающих областей в регуляции транскрипции Е1А. Ранее мы показали, что NaBut подавляет транс-активирующую способность фактора E2F [28, 43]. Следовательно, можно предположить, что наблюдаемое снижение экспрессии Е1А отчасти обусловлено NaBut-зависимым ингибированием фактора E2F. Известно, что активности других часто используемых в генной инженерии вирусных промоторов - цитомегаловирусного и полиомави- русного (SV40), стимулируются ИГД [38]. Вирусные промоторы, несмотря на ряд схожих особенностей, существенно отличаются характером регуляции их активности. Например, промотор CMV положительно регулируется белком Е1А [44], тогда как собственный промотор гена Е1А, а также промотор HIV-LTR репрессируются белком Е1А [45, 46]. Поэтому можно предположить, что регуляция активности вирусных промоторов ингибиторами деацетилаз также не является универсальной.

Во-вторых, наши данные свидетельствуют о том, что ИГД вызывают снижение содержания белка Е1А как в клетках mERas, так и в линии трансформированных клеток HEK-293 эмбриональной почки человека (рис. 1Б). Причем содержание белка Е1А снижается более интенсивно, чем транскрипция гена Е1А, что указывает на модуляцию стабильности белка Е1А ингибиторами деацетилаз. Как и многие клеточные белки, белки, кодируемые вирусами, также служат субстратами ацетилтранс- фераз и деацетилаз. Белок Е1А способен связываться с p300/CBP и может ацетилироваться р300 и PCAF [47]. Ацетилирование изменяет характер взаимодействия Е1А с белками-партнерами [48] и определяет его внутриклеточную локализацию [47]. Так, ацетилирование Е1А препятствует ядерному импорту и соответственно приводит к накоплению Е1А в цитоплазме. Однако показано, что ингибирование деацетилаз бутиратом натрия в клетках HEK-293, экспрессирующих Е1А, не увеличивало количество ацетилированного Е1А и не приводило к накоплению Е1А в цитоплазме [47]. Эти данные предполагают, что Е1А подвергается быстрой деградации, следующей за ацетилированием белка. Деградация Е1А может осуществляться в протеасомах [48]. Также показано, что белки раннего района 1А аденовирусов типа 2 и 12 (Ad2 и Ad12 E1A) расщепляются каспазами-3 и -7 в процессе индуцированного апоптоза в трансформированных аденовирусом клетках человека и мыши [49]. В соответствии со сказанным можно заключить, что усиленное ацетилирование белка Е1А, индуцированное ИГД, может быть одним из факторов, определяющих деградацию Е1А.

Сравнение ответа трансформированных клеток с регулируемой и нерегулируемой экспрессией Е1А на ИГД показало, что апоптоз индуцировался только в клетках с нерегулируемой повышенной экспрессией Е1А, тогда как в контрольных клетках mERas, где содержание Е1А снижалось, запускалась программа клеточного старения (рис. 5). Мы показали, что избегание контрольными клетками mERas апоп- тотической гибели связано со снижением экспрессии проапоптотического белка E1A и активацией антиапоптотического каскада NF-xB. При этом доминирующим становится действие онкогенного Ras, который индуцирует старение. В свою очередь, индукция апоптотической гибели в присутствии NaBut на фоне сверхэкспрессии Е1А связана с подавленной и нерегулируемой активностью антиапоптотического комплекса NF-kB. Опубликованы данные о репрессии активности NF-kB онкобелком E1A [18, 20, 21]. Так, Е1А конкурентно связывает и инактивирует протеинкиназуА, которая должна фосфорилиро- вать NF-kB и таким образом активировать его [21]. Также Е1А подавляет активность IKK, что приводит к снижению деградации IkB - ингибитора, регулирующего функционирование NF-kB [20]. Таким образом, принимая во внимание сказанное, а также данные о синхронизированном во времени уменьшении содержания Е1А и активации NF-kB [30], можно предположить, что в клетках, трансформированных E1A+Ras, ИГД влияет на активность NF-kB, модулируя экспрессию E1A.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспрессия аденовирусного Е1А повышает чувствительность опухолевых клеток к агентам, индуцирующим апоптоз [18], в связи с чем Е1А представляет большой интерес в качестве потенциального компонента комбинированной терапии опухолей. Совместное использование Е1А и ИГД приводит к усилению цитотоксического эффекта во многих раковых клетках с минимальным негативным влиянием на нормальные клетки [19]. Однако ИГД не индуцируют апоптоз в трансформированной онкогенами cHa-Ras и E1A клеточной линии, в которой Е1А экспрессируется под контролем собственного вирусного промотора. В представленной работе нами показано, что ИГД подавляют экспрессию аденовирусного Е1А. Апоптотическая гибель клеток E1A+Ras может быть индуцирована ИГД, если Е1А экспрессируется на нерегулируемом высоком уровне. Иными словами, избегание апоптотической гибели Ras-трансформированными клетками, экспрессирующими Е1А, связано со снижением экспрессии Е1А в присутствии ИГД. В свою очередь, форсированная экспрессия Е1А, независящая от ИГД, создает условия для индукции апоптоза.



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Flint J., Shenk T. // Annu. Rev. Genet. 1989. V. 23. № 1. P. 141161. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2533472

2. Frisch S.M., Mymryk J.S. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

2002. V. 3. № 6. P. 441-452. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/12042766

3. Ruley H.E. // Nature. 1983. V. 304. № 5927. P. 602-606. http:// www.nature.com/doifinder/10.1038/304602a0

4. Frisch S.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 20.

P. 9077-9081. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1833772

5. Pelka P., Ablack J.N.G., Fonseca G.J., Yousef A.F., Mymryk J.S. // J. Virol. 2008. V. 82. № 15. P. 7252-7263. http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18385237

6. Chinnadurai G. // Trends Microbiol. 2011. V. 19. № 4. P. 174183. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21330137

7. Zamanian M., La Thangue N.B. // EMBO J. 1992. V. 11. № 7.

P. 2603-2610. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1385776

8. Keblusek P., Dorsman J.C., Teunisse A.F., Teunissen H., van der Eb A.J., Zantema A. // J. Gen. Virol. 1999. V. 80. № 2.

P. 381-390.

9. Bulavin D.V., Tararova N.D., Aksenov N.D., Pospelov V.A., Pospelova T. V. // Oncogene. 1999. V. 18. № 41. P. 5611-5619. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10523840

10. Mal A., Poon R.Y.C., Howe P.H., Toyoshima H., Hunter T., Harter M.L. // Nature. 1996. V. 380. № 6571. P. 262-265. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8637577

11. Ferrari R., Pellegrini M., Horwitz G.A., Xie W., Berk A.J., Kurdistani S.K. // Science. 2008. V. 321. № 5892. P. 1086-1088. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18719284

12. Miura T.A., Cook J.L., Potter T.A., Ryan S., Routes J.M. // J. Cell. Biochem. 2007. V. 100. № 4. P. 929-940. http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/17063489

13. Keicho N., Higashimoto Y., Bondy G.P., Elliott W.M., Hogg J.C., Hayashi S. // Am. J. Physiol. 1999. V. 277. № 3 Pt 1. P. L523-L532. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10484459

14. Madhusudan S., Tamir A., Bates N., Flanagan E., Gore M.E., Barton D.P.J., Harper P., Seckl M., Thomas H., Lemoine N.R., et al. // Clin. Cancer Res. 2004. V. 10. № 9. P. 2986-2996. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15131034

15. Yoo G.H., Hung M.C., Lopez-Berestein G., LaFollette S., Ensley J.F., Carey M., Batson E., Reynolds T.C., Murray J.L.

// Clin. Cancer Res. 2001. V. 7. № 5. P. 1237-1245. http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11350889

16. Lowe S.W., Ruley H.E. // Genes Dev. 1993. V. 7. № 4. P. 535545. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8384579

17. Liao Y., Hung M.-C. // Cancer Res. 2004. V. 64. № 17. P. 59385942. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15342371

18. Radke J.R., Siddiqui Z.K., Figueroa I., Cook J.L. // Cell Death Discov. 2016. V. 2. № 1. P. 16076. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/27833761

19. Yamaguchi H., Chen C.-T., Chou C.-K., Pal A., Bornmann W., Hortobagyi G.N., Hung M.-C. // Oncogene. 2010. V. 29. № 41.

P. 5619-5629. http://www.nature.com/doifinder/10.1038/ onc.2010.295

20. Shao R., Tsai E.M., Wei K., von Lindern R., Chen Y.H.,

Makino K., Hung M.C. // Cancer Res. 2001. V. 61. № 20. P. 74137416. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11606372

21. Guan H., Jiao J., Ricciardi R.P. // J. Virol. 2008. V. 82. № 1.

P. 40-48. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17959673

22. Nakajima T., Morita K., Tsunoda H., Imajoh-Ohmi S.,

Tanaka H., Yasuda H., Oda K. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273.

№ 32. P. 20036-20045. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/9685342

23. Pylayeva-Gupta Y., Grabocka E., Bar-Sagi D. // Nat. Rev. Cancer. 2011. V. 11. № 11. P. 761-774. http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/21993244

24. Pospelova T.V., Medvedev A.V., Kukushkin A.N., Svetlikova S.B., van der Eb A.J., Dorsman J.C., Pospelov V.A. // Gene Expr. 1999. V. 8. № 1. P. 19-32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/10543728

25. Bolden J.E., Shi W., Jankowski K., Kan C.-Y., Cluse L., Martin

B. P., MacKenzie K.L., Smyth G.K., Johnstone R.W. // Cell Death Dis. 2013. V. 4. № 2. P. e519. http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/23449455

26. Bolden J.E., Peart M.J., Johnstone R.W. // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. № 9. P. 769-784. http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/16955068

27. Romanov V.S., Abramova M.V., Svetlikova S.B., Bykova TV., Zubova S.G., Aksenov N.D., Fornace A.J., Pospelova T.V., Pospelov V.A. // Cell Cycle. 2010. V. 9. № 19. P. 3945-3955.

28. Abramova M.V., Pospelova TV, Nikulenkov F.P., Hollander

C. M., Fornace A.J., Pospelov V.A. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 30. P. 21040-21051.

29. Igotti-Abramova M.V., Pojidaeva A.K., Filippova E.A., Gnedina O.O., Svetlikova S.B., Pospelov V.A. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2014. V. 51. № 6. P. 102-110.

30. Abramova M.V., Zatulovskiy E.A., Svetlikova S.B., Pospelov V.A. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010. V. 42. № 11. P. 1847-1855.

31. Kilbey A., Terry A., Cameron E.R., Neil J.C. // Cell Cycle. 2008. V. 7. № 15. P. 2333-2340. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/18677118

32. Ueno N.T., Bartholomeusz C., Xia W., Anklesaria P., Bruckheimer E.M., Mebel E., Paul R., Li S., Yo G.H., Huang L., et al. // Cancer Res. 2002. V. 62. № 22. P. 6712-6716. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12438271

33. Hortobagyi G.N., Ueno N.T., Xia W., Zhang S., Wolf J.K., Putnam J.B., Weiden P.L., Willey J.S., Carey M., Branham D.L., et al. // J. Clin. Oncol. 2001. V. 19. № 14. P. 3422-3433. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11454891

34. Villaret D., Glisson B., Kenady D., Hanna E., Carey M.,

Gleich L., Yoo G.H., Futran N., Hung M.-C., Anklesaria P., et al. // Head Neck. 2002. V. 24. № 7. P. 661-669. http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/12112540

35. Larson C., Oronsky B., Scicinski J., Fanger G.R., Stirn M., Oronsky A., Reid T.R. // Oncotarget. 2015. V. 6. № 24. P. 1997619989. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26280277

36. Hulin-Curtis S.L., Davies J.A., Jones R., Hudson E.,

Hanna L., Chester J.D., Parker A.L. // Oncotarget. 2018.

V. 9. № 41. P. 26328-26341. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/29899862

37. Marchini A., Scott E., Rommelaere J. // Viruses. 2016. V. 8.

№ 1. P. 9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26751469

38. Lai M.-D., Chen C.-S., Yang C.-R., Yuan S.-Y., Tsai J.-J., Tu C.-F., Wang C.-C., Yen M.-C., Lin C.-C. // Cancer Gene Ther. 2010. V. 17. № 3. P. 203-211. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/19851354

39. Balakrishnan L., Milavetz B. // Virol. J. 2008. V. 5. P. 43. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18353181

40. Takakura M., Kyo S., Sowa Y., Wang Z., Yatabe N., Maida Y., Tanaka M., Inoue M. // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. № 14.

P. 3006-3011. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11452025

41. Chueh A.C., Tse J.W.T., Tцgel L., Mariadason J.M. // Antioxid. Redox Signal. 2015. V. 23. № 1. P. 66-84. http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/24512308

42. Kirch H.C., Pьtzer B., Schwabe G., Gnauck H.K., Schulte Holthausen H. // Cell. Mol. Biol. Res. 1993. V. 39. № 8. P. 705716. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7951410

43. Abramova M.V., Zatulovskiy E.A., Svetlikova S.B., Kukushkin A.N., Pospelov V.A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. V. 391. № 1. P. 142-146. http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/19900401

44. Metcalf J.P., Monick M.M., Stinski M.F., Hunninghake G.W. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1994. V. 10. № 4. P. 448-452. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8136160

45. Schaack J., Allen B., Orlicky D.J., Bennett M.L., Maxwell I.H., Smith R.L. // Virology. 2001. V. 291. № 1. P. 101-109. http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11878880

46. Song C.Z., Loewenstein P.M., Green M. // J. Virol. 1995.

V. 69. № 5. P. 2907-2911. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/7707515

47. Madison D.L., Yaciuk P., Kwok R.P.S., Lundblad J.R. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 41. P. 38755-38763. http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/12161448

48. Turnell A.S., Grand R.J., Gorbea C., Zhang X., Wang W., Mymryk J.S., Gallimore P.H. // EMBO J. 2000. V. 19. № 17.

P. 4759-4773. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10970867

49. Grand R.J.A., Schmeiser K., Gordon E.M., Zhang X., Gallimore P.H., Turnell A.S. // Virology. 2002. V. 301. № 2.

P. 255-271. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12359428

Размещено на Allbest.ru