Антибіоплівкова активність азитроміцину

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Формування мікробних угрупувань -- біоплівок, є однією з основних стратегій виживання бактерій в навколишньому середовищі. Біоплівки формуються на різних біотичних та абіотичних поверхнях, їх утворення є механізмом захисту від несприятливого впливу різних факторів. Біоплівки можуть бути сформовані одним або декількома видами грампозитивних та грамнегативних бактерій, до їх складу входять як метаболічно активні клітини, так і клітини у стані спокою. Утворювати біоплівки здатні умовно-патогенні та патогенні мікроорганізми.

Бактеріальні біоплівки спричиняють різноманітні захворювання: від катетер-асоційованих до хронічних інфекцій: муковісцидоз, остеомієліт, ендокардит, риносинусит, пієлонефрит, тривало незагоювані рани тощо. За даними Національного інституту здоров'я США, з біоплівками асоційовані близько 80 % усіх хронічних захворювань [4].

Значна роль при формуванні хронічних інфекцій належить біоплівкам, сформованим Staphylococcusaureus та Рseudomonasаeruginosa. S. aureus обумовлює хронічну ЛОР-патологію (отит, риносинусит, аденотонзиліт), інфекції нижніх дихальних шляхів (хронічні обструктивні захворювань легень (ХОЗЛ), бронхоектази, вентилятор-асоційовані пневмонії), хронічні рани (пролежні, діабетична стопа, трофічні виразки нижніх кінцівок) тощо. Відзначена провідна роль Р. аeruginosa при бронхоектазах, вентилятор-асоційованих пневмоніях, гнійно-запальних ускладненнях з трахеостомою, ендотрахеальними трубками та кохлеарними імплантами, муковісцидозі У пацієнтів з муковісцидозом P.aeruginosa виявлено у 80 % випадків [5].

При аналізі чутливості біоплівкових мікроорганізмів до антимікробних засобів отримані дані, які свідчать про значну їх резистентність, біоплівки у 100-1000 разів є менш чутливими порівняно з планктонними клітинами [3; 6].

Стійкості таких угруповань до антибіотиків сприяє багато факторів: обмежене проникнення антибіотиків через екзополісахаридний матрикс, зміни в метаболізмі бактерій, наявність персистерів, активація ефлюксних помп тощо [7]. Недостатня ефективність антимікробної терапії при біоплівкових патологіях потребує впровадження в клінічну практику нових ефективних та безпечних лікарських засобів. На увагу заслуговують як перспективні сполуки так і антимікробні препарати різних груп. Для оцінки активності останніх щодо біоплівок необхідно дослідити спектр їх дії та механізм інгібуючого ефекту.

Завдяки дослідженням останніх років в медичну практику впроваджено антимікробні засоби пептидної природи Даптоміцин та Орітаванцин, які порушують адгезію мікроорганізмів до субстрату, здатні руйнувати сформовані біоплівки грампозитивних бактерій та підсилювати специфічну антибіоплівкову дію антибіотиків. Багато антимікробних пептидів на сьогодні досліджуються у доклінічних і клінічних випробуваннях для застосування при катетерній інфекції, муковісцидозі чи хронічних ранових інфекціях, серед яких пексіганан та оміганан [8].

При оцінці антибіоплівкової активності антибіотиків виявлено відмінності в їх дії порівняно з планктонними клітинами. На увагу заслуговують макроліди, які здатні порушувати плівкоут- воренняР. аeruginosa.

Азитроміцин -- макролідний антибіотик з підгрупи азалідів. До спектру дії азитроміцину належать грамнегативні та грампозитивні бактерії Bordetellapertussis, Legionellaspp. Staphylococcusaureus, Bordetellapertussis, Chlamydiatrachomatis, Gardnerellavaginalis, H. influenzae, Legionellapneumophila, Mycobacterium spp., Mycoplasmapneumoniae, S. pneumoniaeта ін. [9]. Азитроміцин не застосовується для лікування пацієнтів з інфекцією, обумовленою Р. аeruginosa, оскільки планктонні клітини стійкі до дії азитроміцину: внаслідок диметилювання субодиниці рибосоми порушується зв'язування макролідів з мішенню дії [10].

Проте в ході досліджень було виявлено вплив азитроміцину на різні етапи формування біоплівок [11]. За даними [12], порушення адгезії відбувається за рахунок інгібування експресії флагеліну IV-типу. Дослідження показали, що азитроміцин пригнічує продукцію QS-залежних факторів вірулентності шляхом негативної регуляції генів, що кодують автоіндуктори. Крім цього, антибіотик може порушувати структуру біоплівок, впливаючи на мембранні білки, проте механізм такої активності потребує детальних досліджень [13].

Мета дослідження - встановити антибіоплівковий вплив азитроміцину на плівкоутворення та сформовані біоплівки S. aureusта P. aeruginosa.

Виклад основного матеріалу. У експериментах використовували клінічні штами золотистого стафілококу та синьогнійної палички. S. aureus чутливий до дії гентаміцину, резистентний до ципрофлоксацину, оксациліну та метициліну, P. aeruginosa449 - до дії гентаміцину, цефепіму та ципрофлосксацину.

Антибіоплівкову активність азитроміцину визначали за здатністю впливати на плівкоутворення та сформовані 2-добові та 5-добові біоплів- ки. Дослідження здійснювали у концентрації азитроміцину 0,5 МІК, 2 МІК та 5 МІК, відповідно 15,65 мкг/мл, 62,5 мкг/мл та 156,25 мкг/мл для P. aeruginosaта 0,25 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2,5 мкг/мл -- для S. aureus222. У дослідженні використовували метод сорбції барвника на біоплівці та його подальшій десорбції в органічний розчинник з використанням 96-лункових планшетів [14]. При дослідженні впливу сполуки на плівкоутворення розчини азитроміцину вносили одночасно з інокулятом, на сформовані біоплівки -- на 2-у та 5-у добу експерименту.

Для отримання біоплівок використовували нічну культуру, яку розводили в середовищі TSB1:100 та висівали на планшети. Після завершення інкубації вміст планшетів видаляли, промивали дистильованою водою, вносили 0,1 % розчин генціанвіолету та витримували 10-15 хв та екстрагували етанолом. Вимірювання оптичної щільності проводили на Adsorbance Microplate Reader ELx 800 (BMTek, США) при довжині хвилі 630 нм. Контролем слугували інтактні культури мікроорганізмів, вирощені за тих самих умов.

Життєздатність клітин P. aeruginosaта S. aureus визначали на етапі плівкоутворення та у сформованих біоплівках з використанням окисно-відновного індикатора резазурину згідно [15; 16].

Вирощування біоплівок здійснювали як описано вище. Культури в присутності азитроміцину вирощували впродовж 24 год при 37 0С. Після інкубації вміст лунок видаляли, промивали двічі фосфатним буфером (рН 7,2±0,2), додавали по 200 мкл ПС (TSB) та 10мкл розчину резазурину (0,5 мкг/лунка). Після інкубації протягом 30 хв у темряві при кімнатній температурі отримані результати реєстрували на флуоресцентному спектрофотометрі «HITACHI, MPF-3» (Японія) при lex550 нм--Aem590. Експерименти супроводжувались контролями культури, поживного середовища та відповідних розчинів сполук/ препаратів та проводились не менше ніж у 3 повторах.

Отримані результати свідчать, що макролідний антибіотик здатен пригнічувати формування біоплівок S. aureusта P. aeruginosa.Встановлено (рис. 1), що інгібіція біоплівок золотистого стафілокока на етапі плівкоутворення за дії азитроміцину у субінгібуючій концентрації 0,5 МІК становила 57 %, при збільшення концентрації до 2МіК та 5 МІК -- 89 % та 94 % відповідно.

азитроміцин антимікробний біоплівковий клінічний

Рис. 1

Рис. 2

Біоплівки грамнегативних бактерій P. aeruginosa були більш стійкими до дії азитроміцину: у концентрації 0,5 МІК інгібуючої активності антибіотика не виявлено, при 2 МІК та 5 МІК спостерігалося пригнічення плівкоутворення на 44-46 %.

При оцінці життєздатності клітин на етапі плівкоутворення золотистого стафілокока та синьогнійної палички за дії азитроміцину встановлено, що антибіотик виявляє виразний дозозалежний ефект. Показано (рис. 2), що при дії азитроміцину життєздатність клітин S. aureus знижувалась на 21 % у концентрації 0,5 МІК та на 97-98 % -- при 2 та 5 МІК. Подібний ефект зареєстровано і щодо P. aeruginosa:у концентрації 0,5 МІК інгібіція становила 46 %, 2 МІК -- 88 %, 5 МІК - 91 %.

Оскільки біоплівки на різних етапах розвитку відрізняються за чутливістю до антимікробних засобів, доцільним було оцінити вплив азитроміцину на сформовані біоплівки S. aureusта P. aeruginosa. Отримані дані (рис. 3) свідчать, що антибіоплівкова активність азитроміцину на зрілі біоплівки була нижчою, ніж на етапі плівкоутворення. За наявності в інкубаційному середовищі антибіотика у субінгібуючій концентрації біомаса біоплівок S. aureus зменшувалась на 12 %, при збільшені дози до 2 МІК -- на 17 %, до 5 МІК - на 33 %.

При дії азитроміцину на P. aeruginosa його антибіоплівкова активність була вищою порівняно з S. aureus та становила 30 % при 0,5 МІК, 54 % - при 2 МІК та 69 % при 5 МІК.

Отримані результати щодо впливу азитроміцину на життєздатність клітин золотистого стафілокока у складі 2-добової біоплівки свідчать, що макролідний антибіотик у субінгібуючих та бактерицидних концентраціях не зумовлював достовірних змін у бактеріальних клітинах (рис. 4).

При дії азитроміцину щодо біоплівок P. aeruginosa навпаки спостерігався виразний інгібуючий ефект: у концентрації 0,5 та 2 МІК зменшення життєздатності клітин на 87-88 %, при 5 МІК -- на 96 %.

Для P. aeruginosa зниження біомаси біоплівки та пригнічення життєдіяльності корелюють у всіх концентраціях. На етапі сформованих біоплівок азитроміцин виявляв незначну активність відносно S. аureus. Зниження активності може бути спричинене зміною характеристик бактеріальних клітин у складі біоплівок та наявністю матриксу, який ускладнює проникнення препарату до клітин.

Таким чином, проведені експерименти показали, що азитроміцин на стадії плівкоутворення більш активно пригнічував формування біоплівок S. oureus. Біоплівки P. aeruginosa були менш чутливі до дії азитроміцину. Життєдіяльність клітин на етапі плівкоутворення значно пригнічувалась при концентраціях вищих за мінімальну інгібуючу концентрацію. На етапі сформованих біоплівок азитроміцин активніше порушував біоплівки P. aeruginosa та майже повністю інгібував життєздатність клітин. Біоплівки S. oureus були менш сприйнятливі до дії азитроміцину, життєдіяльність клітин зменшилась незначно, що може бути пов'язано із зміною фенотипу клітин та погіршеної проникності азитроміцину в товщу матриксу. Виражена активність азитроміцину відносно P. aeruginosa може бути зумовлена впливом на аутоіндуктори систем Quorum Sensing, компоненти матриксу та клітинної стінки. Азитроміцин є перспективним для подальших молекулярних досліджень антимікробної активності.

Рис. 3

Рис. 4

Список літератури

1. Mulcahy, L.R., Isabella, V.M., &Lewis, K. Pseudomonas aeruginosa Biofilms in Disease. Microbial Ecology. 2013. V. 68(1), pp. 1-12.

2. Brady, R.A., O'May, G.A., Leid, J.G., Prior, M.L., Costerton, J.W., &Shirtliff, M.E. Resolution of Staphylococcus aureus Biofilm Infection Using Vaccination and Antibiotic Treatment. Infection and Immunity. 2011. 79(4), 1797-1803.

3. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 3. С. 99-109.

4. Jamal, M., Ahmad, W., Andleeb, S., Jalil, F., Imran, M., Nawaz, M.A., Kamil, M.A. Bacterial biofilm and associated infections. Journal of the Chinese Medical Association.2018. V. 81(1), pp. 7-11.

5. Недашкіська В.В., Дронова М.Л., Вринчану Н.О. Біоплівки та їх роль в інфекційних захворюваннях. Український науково-медичний молодіжний журнал. 2016. № 4(98). С. 10-19.

6. Mah, T.-F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G.C., Stewart, P.S., & O'Toole, G.A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 2003. V. 426(6964), pp. 306-310.

7. Ciofu, O., Rojo-Molinero, E., Macia, M.D., & Oliver, A. Antibiotic treatment of biofilm infections. APMIS. 2017. V. 125(4), pp. 304-319.

8. Chung, P.Y., &Khanum, R. Antimicrobial peptides as potential anti-biofilm agents against multidrug-resistant bacteria. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2017. V. 50(4), pp. 405-410.

9. Peters, D.H., Friedel, H.A., & McTavish, D. Azithromycin. Drugs. 1992. V. 44(5), pp. 750-799.

10. Imperi, F., Leoni, L., &Visca, P. Antivirulence activity of azithromycin in Pseudomonas aeruginosa. Frontiers in Microbiology. 2014. V. 5.

11. Baumann U., Fischer J.J., Gudowius P. et al. Buccal adherence of Pseudomonas aeruginosa in patients with cystic fibrosis under long-term therapy with azithromycin. Infection. 2001. V. 29, pp. 7-11.

12. Kawamura-Sato K., Iinuma T., Hasegawa T. et al. Effect of subinhibitory concentrations of macrolides on expression of flagellin in Pseudomonas aeruginosa and Proteus mirabilis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2000. V. 44, pp. 2869-2872.

13. Tateda, K., Comte, R., Pechere, J.-C., Kohler, T., Yamaguchi, K., & Van Delden, C. Azithromycin Inhibits Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001. V. 45(6), pp. 1930-1933.

14. O'Toole, G.A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments.2011.

15. K. Tote [et al.] A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureusbiofilm. Letters in Applied Microbiology. 2008. V. 46, № 2, pp. 249-254.

16. M.E. Sandberg [et al.] Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay J. Microbiol. Methods. 2009. V. 78, № 1, pp. 104-106.

Размещено на Allbest.ru