Вплив N-ацетилцистеїну на рухову активність геміпаркінсонічних щурів, викликану ін’єкцією агоніста дофамінових рецепторів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив N-ацетилцистеїну на рухову активність геміпаркінсонічних щурів, викликану ін'єкцією агоніста дофамінових рецепторів

Вступ

Скелетні м'язи мають великі енергетичні резерви для тривалих скорочень, але надмірна фізична активність призводить до зниження їхньої сили й розвитку втоми. Тривале та інтенсивне м'язове скорочення, пов'язане з фізичною активністю або роботою, часто супроводжується м'язовим болем, порушенням постави й контролю над рухами [1; 2]. У процесі формування м'язової втоми відбувається порушення обміну речовин, утворюються продукти неповного окислення кисню: перекис, вільні радикали та іони кисню. Збільшення продукції реактивних форм кисню (РФК), що впливає на розвиток м'язової втоми й викликає пошкодження механізму тривалої скорочувальної активності [3]. Пошкодження може включати зміни в структурах білка, азотистих основ і руйнування мембран [4]. Захист клітин від ушкоджень забезпечується антиоксидантною системою [5]. Хоча механізми втоми скелетних м'язів досить детально описані [6], проблема запобігання або корекції втоми м'язів залишається нерозв'язаною. У дослідженнях м'язової втоми ендогенні антиоксиданти, такі як N-ацетил- цистеїн (К-АЦ) і Р-аланін, широко використовуються для прискорення відновлення м'язової активності після їх утоми [7; 8]. Також нещодавно показано, що біоактивні розчинні вуглецеві наноструктури, такі як фулерени С₆₀, завдяки властивості приєднувати вільні електрони можуть бути використані як потенційні антиоксиданти [9]. У попередній роботі ми вже досліджували вплив К-АЦ і Р- аланіну на втому триголового м'яза литки щурів, індуковану переривчастою високочастотною електростимуляцією n. tibialis. Показано, що застосування N-АЦ призводить до зменшення часу відновлення сили м'язового скорочення й збільшення часу роботи м'язової активності під час розвитку втоми в анестезованих щурів [10; 11].

У цьому дослідженні для оцінки розвитку та модуляції втоми скелетних м'язів у неанестезованих щурів використано модель тварин з експериментальним геміпаркінсо- нізмом [12; 13]. Ми припустили, що внутріш- ньоочеревинна ін'єкція агоніста рецептора дофаміну (ДА) апоморфіну (AM), який викликає тривалі циркулярні рухи в гемі пар- кінсонічних тварин, може призвести до втоми скелетних м'язів тварини, а використання антиоксиданта N-АЦ дасть змогу виявити зміни в рухах щурів протягом однієї години.

Мета досліджень - виявити профілактичний ефект попередньої ін'єкції N-АЦ на розвиток м'язової втоми у неанестезованої тварини з експериментальним геміпаркін- сонізмом під час тривалих циркуляторних рухів, викликаних ін'єкцією АМ.

Матеріали й методи досліджень

Експериментальні дослідження виконано на щурах-самцях лінії Вістар масою 260-350 г, які отримано з віварію Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Експериментальні тварини утримувалися в плексигласових клітках (1 щур у клітці) у приміщенні з фільтрацією повітря та температурою повітря 20-22 °С. Усі тварини утримувалися на стандартній харчовій дієті й мали вільний доступ до їжі та води ad libitum.

Усі експериментальні процедури з лабораторними тваринами виконані з дозволу Комітету з біомедичної етики Інституту та проводилися згідно з Європейською директивою Ради громад від 24 листопада 1986 р. (86/609/EEC) та відповідно до Закону України від 21.02.2006, № 3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження».

Щоб змусити неанестезованих щурів рухатися за допомогою хімічної стимуляції, у них викликали експериментальний геміпар- кінсонізм (рис. 1). Операцію проводили під «нембуталовим» наркозом (45 мг/кг, в/о, «Nembutal», США). За допомогою ін'єкції 6-гідроксидофаміну (6-ГОДА, 8 мкг, «Sigma», США), розчиненого у 4 мкл фізіологічного розчину з додаванням 0,1 % аскорбінової кислоти, яка гальмує окислення нейротоксину, викликали однобічне руйнування дофамі- нергічної (ДА) висхідної системи мозку.

Рис. 1. Модель експериментального геміпаркінсонізму

Мікроін'єкції 6-года робились у лівий медіальний висхідний пучок переднього мозку, який розміщений за координатами: ростро- каудально від Брегми (AP) =-2,2 мм, медіолатерально від середньої лінії (ML) = +1,5 мм та дорсовентрально від dura mater (DV) =-8,0 мм, відповідно до стереотаксичного атласу мозку щура [14]. Щоб забезпечити високо-ефективну дію 6-ГОДА, за 25-30 хв до його ін'єкції проводили преме- дикацію тварин інгібітором моноамінооксидази Паргіліном (40 мг/кг, в/о, «Sigma», США) і блокатором захоплення нейротоксину норадренергічними нейронами Дезипраміну, (25 мг/кг, в/о, «Sigma», США). Через тиждень після однобічного введення 6-ГОДА вивчали поведінкові реакції тварин на ін'єкцію дофаміноміметика апоморфіну (0,5 мг/кг, в/о «Sigma», США). Це було непрямим тестом на ступінь дегенерації ДА-нейронів середнього мозку. Раніше встановлено, що інтенсивні циркуляторні рухи у відповідь на введення АМ (у бік, протилежний введенню 6-ГОДА) з інтенсивністю понад 180 обертів за 30 хв свідчать про зменшення кількості ДА-нейронів компактної частини чорної субстанції (SNC) і вентрального поля покришки (VTA) лівої півкулі в середньому на 96,6 i 92,1відповідно [12].

Через сім днів після введення 6-ГОДА тварин розділили на такі групи: 1 - контрольні тварини, у яких викликали інтенсивні циркуляторні рухи за допомогою ін'єкції апоморфіну (0,5 мг/кг) (n = 6); 2 - щури, яким за годину до ін'єкції АМ вводили 0,5 мл фізіологічного розчину (n = 6); 3 - тварини, яким за годину до ін'єкції АМ уводили розчин N-ацетилцистеїну (150 мг/кг) (n = 6).

Кількість обертів геміпаркінсонічних тварин, викликаних ін'єкцією апоморфіну, усереднювали за кожні 6 хв протягом години (1-6 хв, 7-12 хв, 13-18 хв, 19-24 хв, 25-30 хв, 31-36 хв, 37-42 хв, 43-48 хв, 49-54 хв і 5560 хв) і нормалізували відносно першої шестихвилинки. Кожна тварина брала участь у шести експериментах. Отримані дані (середнє ± стандартна похибка середнього) аналізували за допомогою однопараметричного дисперсійного аналізу варіацій ANOVA. Значення р<0,05 вважали достовірним. Якщо міжгрупова різниця була виявлено, використовували апостеріорний аналіз Bonferroni.

Результати

Щоб виявити вплив ^АЦ на фізичну активність щурів та розвиток м'язової втоми у тварин у процесі виконання тривалих рухів, у цій роботі застовували модель щурів з експериментальним геміпаркінсонізмом.

Особливість цієї моделі полягає у відсутності електричної стимуляції, яка є основним чинником, завдяки якому розвивається втома скелетних м'язів. Роль такої стимуляції бере на себе дофаміноміметик Апоморфін, який може викликати в таких геміпаркінсонічних щурів тривалі циркуляторні рухи, які в результаті призводять до фізичної втоми тварин.

У процесі експериментального дослідження встановлено, що в контрольній групі щурів у відповідь на введення АМ тварини починали виконувати тривалі (протягом однієї години) циркуляторні рухи з різними швидкостями та з тенденцією до поступового зменшення їх кількості. У середньому тварини починали обертатися зі швидкістю 12-16 оборотів за хвилину (об/хв) з поступовим їх зниженням до кінця експерименту до 1-6 об/хв. Тобто середня кількість обертів щурів у кінці експерименту знижувалася до 20-30% відносно початкових значень. Щури другої контрольної групи, що одержували в ролі премедикації фізіологічний розчин, демонстрували подібні результати. Як видно з табл. 1, тварина № 2 першої контрольної групи після ін'єкції АМ починала обертатись із середньою швидкістю 15,3 ± 0,9 об/хв, а закінчувала через годину з результатом 5,16 ± 0,7 об/хв. Тварина № 2 із групи 2 починала обертатися зі швидкістю 14,8±1,7 і закінчувала з 3±0,8 об/хв, тобто результати були дуже подібними. Загальна кількість обертів (за годину) для обох груп щурів складала 534 і 568 обертів відповідно. Зазначимо, що достовірних відмінностей у середній кількості обертів між групами щурів 1- та 2-х груп було зареєстровано (табл. 1).

Тварини третьої групи, яким попередньо (за 1 год) внутрішньоочеревинно вводили ^АЦ, у відповідь на ін'єкцію АМ, починали обертатись зі швидкістю аналогічною до щурів груп 1 і 2. Так, у щурів з ін'єкцією ^АЦ у перші 12 хв експерименту спостерігали зменшення

Тварини третьої групи, яким попередньо (за 1 год) внутрішньоочеревинно вводили N АЦ, у відповідь на ін'єкцію АМ починали обертатись зі швидкістю аналогічною до щурів груп 1 і 2. Так, у щурів з ін'єкцією ^АЦ у перші 12 хв експерименту спостерігали зменшення середньої кількості обертів на 15-20 %, після чого інтенсивність циркуляторних рухів поступово збільшувалося до початкових значень. Наприклад, щур № 2 з групи тварин з ін'єкцією ^АЦ після ін'єкції АМ починав обертатись із середньою швидкістю 16,1 ± 1,8 об/хв і закінчував експеримент через годину зі швидкістю 16,6 ± 0,8 об/хв, із загальною кількістю оборотів протягом години 783. Однофакторний аналіз варіацій ANOVA використано для оцінки дії ^АЦ на інтенсивність рухів тварин усіх трьох експериментальних груп. Апостеріорний аналіз Во^еггош засвідчив достовірне (р <0,001) збільшення середнього числа обертів у щурів групи 3, порівняно з тваринами груп 1 і 2, починаючи з 13-18 хв.

Таблиця 1 Середня кількість обертів тварини, викликаних ін'єкцією апоморфіну

Рис. 2. Нормовані (відносно до першої шестихвилинки) усереднені (середнє ± стандартна похибка середнього) значення кількості обертів за хвилину в щурів з ін 'єкцією апоморфіну

Примітки. Чорні, сірі та заштриховані стовпчики - контрольна група тварин, щури з попередньою системною ін'єкцією фізіологічного розчину та попередньою ін 'єкцією Ч-АЦ.

Обговорення

Отже, отримані результати проведеного нами дослідження виявили значне зменшення обертів у тварин контрольної групи щурів і тварин із попередньою ін'єкцією фізіологічного розчину. Тобто протягом однієї години експерименту, починаючи від ін'єкції АМ та до кінця експерименту, кількість обертів за хвилину в таких тварин зменшилася приблизно на 70 %. Відомо, що після тривалої фізичної активності метаболізм у м'язах значно Розділ ІІІ. Фізіологія людини і тварин посилюється. Це призводить до накопичення вторинних продуктів окислення в м'язових волокнах і надалі сприяє розвитку втоми [16]. Під час інтенсивної фізичної активності, потік кисню через м'язові клітини значно збільшується. Високий рівень поглинання кисню може спричинити до надмірне утворення АФК та пов'язується із хворобливою чутли-вістю м'язів і руйнуванням міофібрил [17]. Водночас в умовах м'язового стомлення під час біохімічного дослідження тканин ТМЛ виявило значне збільшення продуктів метаболізму (LA) й маркерів прооксидантного та окисного стресу (TBARS і Н₂О₂). Таке зростання концентрації маркерів призводило до підвищення активності ендогенних антиоксидантів GSH, CAT, GPx і SOD у волокнах ТМЛ. Уведення ж N-АЦ спричиняли до зниження рівня активності TBARS і Н₂О₂ та GSH, CAT, GPx і SOD майже до контрольних значень. Передбачається, що N-АЦ впливає на вміст та активність ендогенних антиоксидантів і може певною мірою запобігати стомленню під час активного скорочення м'язів, підтримуючи тим самим їх нормальний фізіологічний стан [11].

Відомо, що посилення вільнорадикальних процесів є одним із головних патогенних факторів розвитку втоми скелетних м'язів [18]. При значних фізичних навантаженнях спостерігаємо сильне перевиробництво вільних радикалів у м'язовій тканині [19]. Використання екзогенних антиоксидантів різної природи призводить до значного зниження кількості вільних радикалів у скелетних м'язах при інтенсивних фізичних навантаженнях і збільшує час розвитку м'язової втоми [20-22]. Вищеописані дані демонструють доцільність використання антиоксидантів для корекції рівня окисного стресу в м'язовій тканині при екстремальних впливах на організм.

Висновок

геміпаркінсонізм м'язовий втома n-aц

Порівнюючи поведінкові тести на щурах у трьох групах, можемо припустити, що зменшення кількості обертів щурів контрольної групи й тварин із попередньою ін'єкцією фізіологічного розчину відбувалося не через припинення дії апоморфіну, а через розвиток м'язової втоми під час тривалих циркуляторних рухів. Водночас у щурів третьої групи після застосування ^АЦ зниження середньої кількості обертів не спостерігалося. Це може вказувати на активацію захисної дії антиоксидантної системи у відповідь на тривалу м'язову активність, а ^АЦ можна розглядати як потужний активатор захисних механізмів, спрямованих на зниження стомлюваності скелетних м'язів.

Література

1. Ervilha, U. F.; Farina, D.; Arendt-Nielsen, L.;Graven-Nielsen T. Experimental muscle pain changes motor control strategies in dynamic contractions. Exp BrainRes,2005;164,215-224https://doi.org/10.1007/s00221-005-2244-7

2. Gandevia, S. C.; Spinal and supraspinal factors in human muscle fatigue. Physiol Rev; 2001, 8, 17251789 https://doi.org/10.1152/physrev.2001.8L4.1725

3. Pinheiro, C. H. J.; Vitzel, K. F.; Curi, R. Effect of N-acetylcysteine on markers of skeletal muscle injury after fatiguing contractile activity. Scand J Med Sci Sports; 2012, 22, 24-33 https://doi.org/10.1111/j.1600- 0838.2010.01143.x

4. Powers, S. K.; Jackson, M. J. Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production. Physiol Rev; 2008, 88, 12431276https://dx.doi.org/10.1152%2Fphysrev.00031.2007

5. Baneijee, A. K.; Mandal, A.; Chanda, D.; Chakraborti, S. Oxidant, antioxidant and physical exercise. Mol CellBiochem; 2003, 253, 307-312.

6. Boyas, S.; Gueivel, A. Neuromuscular fatigue in healthy muscle: Underlying factors and adaptation mechanisms. Ann Phys Rehabil Med; 2011, 54, 88-108 https://doi.org/10.1016/j .rehab.2011.01.001

7. Reid, M. B.; Stokic, D. S.; Koch, S. M.;Khawli F. A.; Leis, A. A. N-acetylcysteine inhibits muscle fatigue in humans. J Clin Invest; 1994,94,2468-2474 https://doi.org/10.1172/JCI117615

8. Harris, R. C.; Sale C. Beta-alanine supplementation in high-intensity exercise. Med Sport Sci; 2012, 59, 1-17 https://doi.org/10.1159/000342372

9. Gharbi, N.; Pressac, M.; Hadchouel, M.; Szwarc, H.; Wilson, S. R.; Moussa F. C60 fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Lett; 2005, 5, 2578-2585.

10. Prylutskyy, Y. I.; Vereshchaka, I. V.; Maznychenko, A.V.; Bulgakova, N.V.;

Gonchar, O. O.; Kyzyma, O. A.; Ritter, U.; Scharff, P.; Tomiak, T.; Nozdrenko, D. M.; Mishchenko, I. V.; Kostyukov, A. I. C60 fullerene as promising therapeutic agent for correcting and preventing skeletal muscle fatigue. J Nanobiotechnology; 2017,15(1),8https://doi.org/10.1186/s12951-016-0246-1

11. Vereshchaka, I.V.; Bulgakova, N. V.; Mazny- chenko, A. V.; Gonchar, O. O.; Prylutskyy, Y. I.; Ritter, U.; Moska, W.; Tomiak, T.; Nozdrenko, D. M.; Mishchenko, I. V.; Kostyukov, A. I. C₆₀ Fullerenes diminish muscle fatigue in rats comparable to N- acetylcysteine or в-alanine. Front Physiol, 2018, 9, 517

12. Maisky,V.A.;Oleshko,N.N.;Bazilyuk, O. V.; Talanov, S. A.; Sagach, V. F.; Appenzeller, O. Fos and nitric oxide synthase in rat brain with chronic mesostriatal dopamine deficiency: effects of nitroglycerin and hypoxia. Parkinsonism RelatDisord; 2002, 8:261-270

13. Talanov,S.A.;Maisky,V.A.;Fedorenko, O. A. Natural complexes are more effective in neuroprotection than single antioxidants. Neuromedicine; 2017, 1:1-8 http://www.isaacpub.org /23/1458/1/1/11/2018/NRM.html

14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates, 3rd edition. Academic Press; 1997.

15. Kirik, D.; Rosenblad, C.; Bj^klund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hyd- roxydopamine in the rat. Exp Neurol; 1998,152, 259277 https://doi.org/10.1006/exnr.1998.6848

16. Casey, D. P.; Joyner, M. J. Local control of skeletal muscle blood flow during exercise: influence of available oxygen. J Appl Physiol; 2011, 111, 15271538 https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00895.2011

17. Clanton, T. L.; Zuo, L.; Klawitter P. Oxidantsand skeletal muscle function:physiologic and pathophysiologic implications. Proc Soc Exp Biol Med; 1999, 222, 253-262 https://doi.org/10.1046/j.1525- 1373.1999.d01-142.x

18. Lee, K. P.; Shin, Y. J.; Cho, S. C.; Lee, S. M.; Bahn, Y. J.; Kim, J. Y.; Kwon, E. S.; Jeong, D. Y.; Park, S. C.; Rhee, S. G.; Woo, H. A.; Kwon, K. S. Peroxiredoxin 3 has a crucial role in the contractile function of skeletal muscle by regulating mitochondrial homeostasis. Free Radical Biol Med; 2014, 77, 298-306 https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2014.09.010

19. Clarkson, P. M.; Thompson, H. S. Antioxidants: what role do they play in physical activity and health? Am J Clin Nutr; 2000, 72, 637-646 https://doi.org/10.1093/ajcn/72.2.637S

20. Ferreira, L. F.; Reid, M. B. Muscle-derived ROS and thiol regulation in muscle fatigue. J Appl Physiol; 2008,104,853-860 https://doi.org/

10.1152/japplphysiol.00953.2007

21. Mach, J.; Midgley, A. W.; Dank, S.; Grant, R.; Bentley, D. J. The effect of antioxidant supplementation on fatigue during exercise: potential role for NAD+(H). Nutrients; 2010, 2, 319-329 https:// dx.doi.org/10.3390%2Fnu2030319

22. Hong, S. S.; Lee, J. Y.; Lee, J. S.; Lee, H. W.; Kim, H. G.; Lee, S. K.; Park, B. K.; Son, C. G. The traditional drug Gongjin-Dan ameliorates chronic fatigue in a forced-stress mouse exercise model. J Ethnopharmacol; 2015, 168, 268-278

Размещено на Allbest.ru