Маркер хронического злоупотребления алкоголем – карбогидрат дефицитный трансферрин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Маркер хронического злоупотребления алкоголем - карбогидрат дефицитный трансферрин

Злоупотребление алкоголем имеет серьезные медицинские, социальные, психологические, юридические и экономические последствия. Оно приводит к антисоциальному поведению, деградации личности, ухудшению генофонда нации. В состоянии алкогольного опьянения совершается большинство преступлений. Пьянство и алкоголизм занимают третье место среди причин смертности.

Трудности диагностики хронического злоупотребления алкоголем во многом обусловлены тем, что хроническое злоупотребление может иметь различные клинические варианты -- от бессимптомных, латентных форм, до тяжелых, прогностически неблагоприятных, сопровождающихся крайне высокой летальностью.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ, а также в рамках комплекса мер, направленных на реализацию новой государственной антиалкогольной политики, Московским научно-практическим центром наркологии Департамента здравоохранения Москвы были разработаны Методические рекомендации «Диагностика, мониторинг хронического злоупотребления алкоголем и скрининг наиболее распространенных патологических состояний, обусловленных злоупотреблением» [1], данные рекомендации легли в основу медицинской технологии: «Определение фракций карбогидрат-дефицитного трансферрина методом капиллярного электрофореза».

Методика одобрена профессиональным сообществом врачей-наркологов Российской Федерации и внесена в Приказы МЗ РФ [2,3,4], во исполнение 230-ФЗ, а также Приказы, утверждающие Порядок и Стандарты оказания специализированной медицинской помощи по профилю "психиатрия-наркология" [5,6,7,8] (1034н, 299н, 300н, 301н).

Процедуре определения карбогидрат-дефицитного трансферрина (CDT) в сыворотке крови методом капиллярного электрофореза присвоен код номенклатуры медицинской услуги A09.05.229 (Приказы Минздрава от 27.12.2011г. №1664н и от 10.12.2014г. № 813н).

Определение карбогидрат-дефицитного трансферрина при диагностике, мониторинге и оценке системы потребления алкоголя широко применятся за рубежом.

В 2001 г. маркер CDT был одобрен Федеральным агентством по контролю за продуктами питания и лекарствами США в качестве показателя хронического злоупотребления (Food and Drug Administration, FDA) - карбогидрат-дефицитный трансферрин.

В 2002 г. в Сборнике официальных публикаций Американского общества по Медицине Зависимостей и Алкоголизму описан современный алгоритм тестирования в наркологических учреждениях. Эффективность данного алгоритма была подтверждена многочисленными исследованиями. Одно из них описано в статье Schmidt L.G. с соавт. (одобрено этическим комитетом Rudolf Virchow).

В Великобритании в 2010 г. CDT признан маркером, способным достоверно определять злоупотребление алкоголем, и применяется при обследовании лиц, лишенных водительских прав за вождение в нетрезвом виде, а также при обследовании военнослужащих для выявления скрытых форм алкоголизма.

В Италии лица, повторно задержанные за вождение в нетрезвом виде, направляются на лечение, в ходе которого CDT анализируется ежеквартально. Права возвращают при нормальных значениях маркера, полученных в течение года.

В Испании данное обследование проходят трудовые мигранты. В Швеции - работники автотранспортных предприятий.

Трансферрин (Tf) - гликопротеин в1-глобулиновой фракции. Tf присутствует в крови в виде различных изоформ в зависимости от разветвления углеводной цепи. В зависимости от состава углеводных цепей трансферрина, количество присоединенных остатков сиаловых кислот в его молекуле может быть вплоть до 8. В норме трансферрин представлен преимущественно 5 (пента)-, 4 (тетра)-, 3 (три)- и 2 (ди)- сиалотрансферрином [1, 10].

Процентное содержание этих изоформ в сыворотке крови строго упорядочено и у здорового человека составляет: < 1,5% для гептасиало-Tf; 1-3% для гексасиало-Tf; 12-18% для пентасиало-Tf; 64-80% для тетрасиало-Tf; 4,5-9% для трисиало-Tf и < 2,5% для дисиало-Tf. Асиало-, моносиало- и октасиалотрансферрин в норме не детектируются или обнаруживаются в незначительных концентрациях: < 0,5% для асиало-Tf, < 0,9% для моносиало-Tf [1].

Хроническое употребление больших доз алкоголя приводит к угнетению гликозилирования трансферрина, в результате чего возрастает содержание изоформ со сниженным количеством остатков сиаловых кислот, которые оценивают суммарно как углевод-дефицитный трансферрин (УДТ) или карбогидратдефицитный трансферрин (CDT).

В настоящее время и до завершения программы международной стандартизации CDT, инициированной Международной Федерацией Клинической Химии (IFCC), к карбогидрат-дефицитному трансферрину принято относить асиало-, моносиало- и дисиало- изоформы трансферрина [11,12].

В норме содержание CDT не превышает 1,3% от общей концентрации трансферрина. Однако, с учётом максимальной погрешности метода (±0,3%), за патологическое принимается содержание CDT выше 1,6%. Период полураспада трансферрина составляет 14-17 дней. Время, необходимое для нормализации показателя после прекращения употребления, составляет в среднем 4 недели [1,10].

Патомеханизм повышения уровня CDT в ответ на хроническое злоупотребление алкоголем состоит из множества звеньев [13,14,15]. Этанол и его главный метаболит -- ацетальдегид оказывают следующее влияние на биохимические процессы в организме:

· Инициирование (повышение) активности сиалидазы (нейраминидазы) гепатоцитов. Усиление гидролиза связей между остатком N-ацетилнейраминовой кислоты и сиаловой кислотой.

· Ингибирование (подавление) активности галактозилтрансферазы и N-ацетилглюкозаминилтрансферазы в аппарате Гольджи.

· Подавление экспрессии генов, кодирующих сиалилтрансферазу,

Как результат, при синтезе гликопротеинов происходит нарушение гликозилирования (галактозилтрансфераза не присоединяет к гликопротеинам галактозу, а сиалилтрансфераза не присоединяет остатки сиаловых кислот) и образование их мало- и а- сиалированных форм.

Специфичное повышение CDT наблюдается у лиц, потребляющих не менее 60 г алкоголя в течение не менее 7-10 дней, что позволяет устанавливать факт хронического злоупотребления лабораторным путем [1, 10].

В течение двух последних десятилетий разработано несколько методов определения CDT [1,10], таких как

· метод ионно-обменной хроматографии

· турбодиметрический метод с использованием антител к трансферрину

· радиоиммунологический метод

· высокоэффективная жидкостная хроматография. Исследование, выполненное с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), обладает значительным преимуществом перед иммунологическим методом в плане специфичности и чувствительности.

· капиллярный электрофорез и капиллярный зонный электрофорез.

Метод капиллярного электрофореза основан на разделении заряженных молекул в жидкой среде внутри сверхтонкого кварцевого капилляра под действием электрического тока. Белковые молекулы при этом разделяются согласно своему электрическому заряду. Разделение изоформ трансферрина методом капиллярного электрофореза основано на разнице их электрического заряда, величина которого прямо пропорциональна количеству остатков сиаловой кислоты [16,17].

Результаты качественной оценки представляют собой электрофоретические кривые, отображающие фракции трансферрина, присутствующие в анализируемом образце сыворотки (рис.1).

Рис. 1 Качественная оценка фракций трансферина

Результаты относительной количественной оценки представляют собой автоматически скалькулированные относительные (%) концентрации изоформ трансферрина (Рис.2а; 2б), полученные посредством прямой денситометрии фракций при 200 нм [18].

Рис.2а Относительная количественная оценка

Рис. 2б Относительная количественная оценка CDT (нормальное значение) CDT (патологическое значение)

алкоголь карбогидрат электрофорез

При проведении относительной количественной оценки маркера CDT в отсутствии интерферирующих факторов, значение CDT 1,6 % следует расценивать как показатель хронического алкогольного злоупотребления (положительный результат). Значение CDT < 1,6 % при отсутствии интерферирующих помех на ЭФ профиле следует расценивать как отрицательный результат. При получении значений в диапазоне 1,3% ? CDT ? 1,6% («серая зона») рекомендуется провести повторное исследование спустя 3-4 недели с использованием образца свежей сыворотки от этого же пациента.

Измерение относительной концентрации фракции белка не внесено в перечень измерений, относящихся к сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений (в сфере здравоохранения) Приказ МЗ России от 21.02.2014 г. и, соответственно, не подлежит обязательной поверке. (Письмо ФГУП "ВНИИОФИ" №9-12/605 от 03.02.2015 г.)

Данный метод реализован при помощи коммерческих анализаторов трех производителей: SEBIA (системы Minicap и Capillarys-2 Flex Piercing), Helena Bioscience (система V8), Beckman Coulter (системы P/ACE 5000 и P/ACE MDQ) [1].

Системы капиллярного электрофореза Capillarys/ Minicap и Helena Bioscience, наборы реагентов и расходные материалы к ним зарегистрированы как изделия медицинского назначения и разрешены к использованию для in vitro диагностики на территории Российской Федерации. В последние годы в Российской Федерации данный метод стал широко применяться в практике наркологической службы. На сегодняшний день исследование маркера проводится в 40 регионах РФ. В Тульском областном наркологическом диспансере с 2014 года проводится определение маркера CDT на системах капиллярного электрофореза Minicap и Capillarys-2 Flex Piercing. За прошедший период количество лиц, направленных на данное обследование, неуклонно растёт (Табл.1).

Таблица 1. Статистические данные ТОНД по определению маркера CDT.

Данным видом обследования охвачены следующие категории населения:

· Лица, ранее за наркологической помощью не обращавшиеся, у которых при медицинском осмотре врачом психиатром-наркологом были выявлены клинические признаки злоупотребления алкоголем, или прошедшие медицинское освидетельствование на состояние опьянения с заключением о наличии алкогольного опьянения при первичной диагностике;

· Пациенты, состоящие на диспансерном наблюдении, в соответствии с требованиями действующего порядка диспансерного наблюдения;

· Лица, обращающиеся для получения справки для допуска к работе с НС и ПВ в соответствии с Приказом МЗ Российской Федерации от 22.12.2016 г. № 988н [4].

· Иные категории, требующие экспертной оценки и комиссионного принятия решения, в том числе в соответствии с Приказом МЗ Российской Федерации от 15.06.2015 г. № 344н [2], а так же в связи со сложностью клинического случая или конфликтной ситуацией.

При обследовании лиц, направленных на врачебную комиссию для решения различных экспертных вопросов, в рамках лабораторной диагностики проводились исследования уровня активности ферментов (АЛТ, АСТ и ГГТ), анализировалась клиническая картина крови и, в обязательном порядке, проводилось определение карбогидрат дефицитного трансферрина.

Проведённое комплексное лабораторное исследование в совокупности с данными функциональной диагностики, а также имеющимися в распоряжении Комиссии анамнестическими данными и заключениями врачей-специалистов, позволяют объективизировать картину и ответить на поставленные вопросы.

Далее приведено несколько примеров использования метода определения фракций CDT в комплексной оценке состояния при первичном обращении в наркологическую службу:

Пациент I, мужчина 34 лет, обращение впервые с целью получения медицинской справки для допуска к управлению транспортным средством. Основанием для обследования явилось медицинское освидетельствование на состояние опьянения от 15.03.2012 г. (акт): алкогольное опьянение (0,86 мг/л; 0,82мг/л). Отрицал злоупотребление алкоголем.

Результаты лабораторного обследования: ОАК - в норме, MCV - в норме, АЛТ - 62,1, АСТ - 57,6, ГГТ - 212,7.

Гепатиты «B», «C» - не обнаружены.

УЗИ органов брюшной полости: патологии органов брюшной полости не выявлено.

CDT - 1,5%.

Заключение терапевта: стеатогепатит (вероятно алкогольного генеза).

Заключение гастроэнтеролога: стеатогепатит минимальной степени активности.

Вывод: предварительное заключение - имеет место злоупотребление алкоголем. Установлено диспансерное наблюдение.

Пациент II, женщина 30 лет, обратилась впервые по направлению КДН на консультацию в связи с тем, что «склонна к употреблению спиртных напитков», распивала алкоголь во дворе. Из анамнеза: начало употребления алкоголя в 16 лет, употребление 1 раз в месяц, толерантность 100 мл водки. ААС отрицала.

Результаты лабораторного обследования: тромбоциты - 144,00; MCV - 108,20; АЛТ - 90,2; АСТ - 84,6; ГГТ - 102,8.

Гепатиты «B», «C» - не обнаружены.

УЗИ органов брюшной полости от 02.12.2014 г.: признаки хронического холецистита. Дискинезия желчного пузыря. Диффузные изменения структуры поджелудочной железы.

CDT - 1,5%

Заключение терапевта: Хронический панкреатит. Хронический холецистит.

Вывод: диагноз «Пагубное потребление алкоголя».

Пациент III, мужчина 34 лет, обратился впервые 03.02.2015 г. для получения медицинской справки Ф 046-1 (охранная деятельность). Основанием для обследования явилось медицинское освидетельствование на состояние опьянения от 12.06.2014 г. (акт): алкогольное опьянение (0,53 мг/л; 0,50мг/л). Пациент не отрицал употребления алкоголя 2-3 раза в месяц, толерантность 250 мл водки, последнее употребление 2 дня назад. Предполагаемый диагноз: F10.1, F10.2?.

Результаты лабораторного обследования: MCV - 104,5, АЛТ - в норме, АСТ - 79,4, ГГТ - 83,6.

Гепатиты «B», «C» - не обнаружены (анализ от 04.02.2015 г.).

УЗИ органов брюшной полости: признаки хронического холецистита.

CDT - > 6,8%

Заключение терапевта: отклонение от нормы биохимических анализов связаны с употреблением алкоголя. Хронический холецистит.

Вывод: диагноз «Пагубное потребление алкоголя». Дифференциальный диагноз с «Синдромом зависимости от алкоголя, средняя стадия, периодическое потребление»

На результаты количественной оценки CDT влияет ряд факторов, связанных с проведением преаналитического этапа диагностики, а также наличием иных интерферирующих влияний (реологические особенности крови, генетические вариации, особенности состояния обследуемых лиц).

Так, получение корректных результатов в большой степени зависит от правильного проведения преаналитического этапа диагностики. На данный этап лабораторных исследований приходится от 35 до 70% ошибок.

Согласно Методическим рекомендациям [1] отбор крови должен производиться из поверхностной вены в пробирки, не содержащие реагентов, в том числе цитрата натрия и К2 ЭДТА и К3 ЭДТА. Находящийся в плазме фибриноген является значительным интерферирующим фактором и делает результаты анализа недействительными.

Немаловажное значение имеют условия хранения и транспортировки образцов.

Хранение образов крови и их последующая транспортировка к месту проведения исследования должны осуществляться в холодильнике или специальных термоконтейнерах, поддерживающих температуру среды не выше 2-8о С. Не допускается хранение и транспортировка образцов при комнатной температуре. При необходимости длительного транспортирования образцы крови должны быть отцентрифугированы для получения сыворотки не позднее, чем через 1 час после взятия образца. Свежая сыворотка крови пригодна для исследования без дополнительной пробоподготовки.

К анализу допускается сыворотка при хранении ее в условиях холодильника при температуре 2- 8°C не более 10 дней. При необходимости более длительного хранения образцы сыворотки крови должны быть заморожены (-18-24оС) в течение 8 часов с момента их взятия. Замороженная сыворотка пригодна для исследования в течение месяца.

К факторам, обусловленным нарушениями преаналитического этапа и способным вызывать помехи на ЭФ профиле (Рис. 3а,б), относят:

- образцы с признаками гемолиза;

- старые, неправильно хранившиеся образцы;

- образцы плазмы или неправильно подготовленная сыворотка;

- образцы с ЭДТА или цитратом.

Рис. 3а,б Интерференция, связанная с нарушением условий хранения и транспортировки проб.

При изменении реологических свойств крови образцы сыворотки могут содержать криоглобулины или моноклональный белок (белок, синтезирующийся при ряде лимфопролиферативных заболеваний) и обладать повышенной вязкостью (особенно при хранении в замороженном состоянии). Такие образцы при проведении электрофореза могут формировать помехи в виде одной или нескольких дополнительных фракций на профиле.

Для устранения данного вида интерференции необходимо проводить обработку образцов при помощи раствора для обработки проб (Рис. 4а, 4б).

Рис.4а Образец с интерференцией в (первичный анализ) (повторный анализ)

Рис. 4б Образец с интерференцией после виде дополнительной фракции обработки Solution de traitement

Наличие генетического варианта трансферрина.

У 95-97% европеоидной популяции в норме присутствует генетический вариант трансферрина С. У оставшейся части популяции отмечается синтез вариантного трансферрина В или Д с различной электрофоретической подвижностью. На электрофореграмме эти варианты легко обнаруживаются (Рис. 5а, 5б). Частота присутствия гетерозиготного варианта в популяции не превышает 2%. Показания уровня CDT в большинстве случаев является расчётным. В случае результатов анализа вблизи "серой зоны" рекомендуется проведение повторного исследования через 2-3 недели с целью оценки тенденции изменения уровня CDT.

Рис. 5а, 5б Генетический вариант трансферина.

В литературных источниках описаны редкие случаи неполного разделения фракций ди- и три- сиалотрансферрина, известные также как феномен ди-трисиало-блока (Рис. 6) Механизм формирования блока ди-трисиалотрансферрина до конца не изучен, однако большинство авторов указывают на его взаимосвязь с органическими поражениями печени алкогольной и неалкогольной этиологии, в т.ч. алкоголь-индуцированный цирроз. Вследствие неполного разделения фракций ди- и три- сиалотрансферрина корректная количественная оценка CDT невозможна.

Рис. 6 Образец с неполным разделением фракций ди- и три- сиалотрансферрина.

Из опыта работы по использованию метода CDT в рамках оказания наркологической помощи населению можно сделать выводы о том, что данный метод:

· позволяет объективизировать состояние ряда пациентов и установить диагноз наркологического заболевания при исходных скудном анамнезе и слабовыраженной клинической картине. Безусловно, метод при изолированном применении не позволяет установить нозологический диагноз, однако даёт возможность объективизировать и оценить тяжесть течения наркологического расстройства.

· позволяет перейти к активной целевой профилактике и раннему выявлению лиц, предрасположенных к злоупотреблению алкоголем.

· формирует "сдерживающую" мотивацию

Список литературы

1.Методические рекомендации: "Диагностика, мониторинг хронического злоупотребления алкоголем и скрининг наиболее распространенных патологических состояний, обусловленных злоупотреблением" (МНПЦ Наркологии Департамента здравоохранения города Москвы). // htpp://c-d-t.ru/wp-content/uploads/

/2016/05/metod-recomend.pdf.

2.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 15.06.2015 г. № 344н "Об проведении обязательного медицинского освидетельствования водителей транспортных средств (кандидатов в водители)".

3.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30.06.2016 г. № 441н "О порядке проведения медицинского освидетельствования на наличие медицинских противопоказаний к владению оружием и химико-токсикологических исследований наличия в организме человека наркотических средств, психотропных веществ и их метаболитов".

4.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 22.12.2016 г. № 988н "О порядке выдачи справки об отсутствии у работников, которые в соответствии со своими трудовыми обязанностями должны иметь доступ к наркотическим средствам, психотропным веществам, внесенным в список I и таблицу I списка IV перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российиской Федерации, прекурсорам или культивируемым наркосодержащим растениям, заболеваний наркоманией, токсикоманией, алкоголизмом".

5.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30.12.2015 г. № 1034н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "психиатрия-наркология" и Порядка диспансерного наблюдения за лицамипсихическими расстройствами и (или) расстройствами поведения, связанными с употреблением психоактивных веществ".

6.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 17.05.2016 г. № 299н "Об утверждении стандарта первичной специализированной медико-санитарной помощи при синдроме зависимости, вызванном употреблением психоактивных веществ".

7.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 17.05.2016 г. № 300н "Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при пагубном употреблении психоактивных веществ".

8.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 17.05.2016 г. № 301н "Об утверждении стандарта первичной специализированной медико-санитарной помощи при пагубном употреблении психоактивных веществ".

9.Булгакова В.С., Высокогорский В.Е., Притыкина Т.В., Титов С.С. Нарушение обмена углеводсодержащих соединений при алкогольной интоксикации // Наркология. -2008.-№5.-С.50-53.

10.Тарасова О.И., Огурцов П.П., Мазурчик Н.В., Моисеев В.С. Современные лабораторные маркеры употребления алкоголя // Клиническая фармакология и терапия. -2007.-№16 (1).-С.1-5.

11.Jeppsson J., Arndt T., Schellenberg F., Wielders J., Anton R., Whitfield J., Helander A. Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: I. Analyte definition and proposal of a candidate reference method. Clin Chem Lab Med 2007; 45(4): 558-562.

12.Jeppsson J-O., Siebelder C., Whitfield J.B., Schellenberg F. Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: III. Performance of native serum and serum spiked with disialotransferrin proves that harmonization of CDT assays is possible. Clin Chem Lab Med 2013; 51(5):991-996.

13.Helander A. Chromatographic measurement of transferring glycoforms for detecting alcohol abuse and congenital disorders of glycosylation. Chromatographic methods in clinical chemistry and toxicology 2007; 87-97.

14.Wolff F., Mesquita M., Corazza F., Demulder A., Willems D. False positive carbohydrate-deficient transferrin results in chronic hemodialysis patients related to the analytical methodology Clinical Biochemistry (Article in Press).

15.Arndt T. Carbohydrate-deficient transferrinasamarkerof chronic alcohol abuse: a critical review of preanalysis, analysis, and interpretation. Clin Chem 2001;47:13-27.

Размещено на Allbest.ru