Физиология протонной помпы

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Секреция соляной кислоты слизистой оболочкой желудка обеспечивается специализированными париетальными (обкладочными) клетками, находящимися в эпителиальном слое желудочных желез фундального отдела. Характерной особенностью этих клеток является наличие специальных структур - так называемых внутриклеточных канальцев, образованных впячиваниями апикальной мембраны (рис. 1).

Рис. 1. Структура париетальной клетки. 1 - канальцы; 2 - микроворсины; 3 - митохондрии; 4 - ядро

Поверхность канальцев, как и поверхность апикальной мембраны, покрыта многочисленными микроворсинками. Наличие внутриклеточных канальцев и микроворсинок значительно увеличивает поверхность, через которую осуществляется секреция соляной кислоты. Кроме того, для париетальных клеток характерно наличие большого числа митохондрий, обеспечивающих клетку энергией в виде АТФ.

Активация секреции соляной кислоты в желудке происходит под действием нескольких секретогенов: гистамина, гастрина, ацетилхолина. Она сопровождается значительными морфологическими изменениями париетальных клеток: наблюдается увеличение размеров внутриклеточных канальцев и длины микроворсинок, что приводит к увеличению поверхности мембраны, через которую происходит секреция. В активированных париетальных клетках внутриклеточные канальцы открываются в люминальное пространство, что обеспечивает доступ выделяющейся соляной кислоты в просвет желудка.

В транспорте соляной кислоты через апикальную мембрану участвует несколько переносчиков (транспортеры), работающих сопряженно (рис. 2). Переносчики ионов через биологические мембраны подразделяют на три типа: ионные насосы (на языке биохимиков - ионтранспортирующие АТФазы), ионообменники и каналы. Ионные насосы, или помпы (натриевый, кальциевый и протонный), переносят ионы через биологические мембраны против электрохимического градиента, используя энергию, запасенную в виде макроэргической связи в молекуле АТФ. Ионообменники обменивают один ион на другой, используя градиент концентраций одного из обмениваемых ионов, созданный ионными насосами или другими ферментными системами (Na+/H+-обменник, НСO3+/Сl--обменник, Na+/Ca2+-oбменник). Наконец, перенос ионов по градиенту концентраций осуществляют каналы, представляющие собой белковую пору в мембране, обладающую проводимостью для ионов определенного типа (Na+-, Ca2+- и Сl-канал), которая регулируется электрическим (потенциалозависимые каналы) или химическим (лигандозависимые каналы) путем. Наличие ионных переносчиков разного типа позволяет клетке очень тонко регулировать ионный гомеостаз.

Ионные переносчики всех трех типов участвуют в секреции соляной кислоты париетальными клетками. Основным элементом этой транспортной системы является протонный насос, обеспечивающий АТФ-зависимый обмен внутриклеточных Н+ на внеклеточные ионы К+ и локализованный в апикальной мембране париетальной клетки [6]. Оба иона (Н+ и К+) переносятся протонной помпой через мембрану против электрохимического градиента. Из клетки накапливающиеся ионы К+ выходят по градиенту концентраций, по-видимому, через специальный канал, причем выход этого катиона сопровождается выходом из клетки анионов О также по специальному каналу. Таким образом, суммарным результатом работы транспортной системы, локализованной в апикальной мембране клетки (протонной помпы, К+- и Сl- -каналов; см. рис.2), являются секреция соляной кислоты в люминальное пространство и циклическое перемещение ионов калия из клетки наружу и в обратном направлении.

Рис. 2. Париетальная клетка

Ионы Сl- попадают в клетку через базолатеральную мембрану. В транспорте этого аниона принимает участие НСO3/Сl - анионный обменник (см. рис.2). Необходимые для обмена ионы НСO3 образуются в клетке за счет работы фермента карбоангидразы, обеспечивающего синтез Н2СO3 из углекислого газа, который появляется в клетке в результате метаболических процессов, и воды. Н+, образующийся при диссоциации Н2СO3, секретируется протонным насосом в люминальное пространство. Карбоангидраза локализована в клетке в непосредственной близости от системы внутриклеточных канальцев. При интенсивной работе насоса, когда начинает ощущаться нехватка Н+ внутри клетки, включаются также встроенные в базолатеральную мембрану катионобменни-ки (К+/Н+ или Na+/H+), обменивающие внеклеточный Н+ на внутриклеточный К+ или Na+. Таким образом, присутствие дополнительных переносчиков, находящихся на базолатеральной мембране, обеспечивает трансэпителиальный транспорт анионов О и частично Н+.

Роль протонного насоса в системе, обеспечивающей секрецию соляной кислоты, выполняет Н+-,К+-АТФаза - фермент, относящийся к семейству АТФаз Р-типа [6]. Ближайшим родственником этого фермента является Na+-,К+-АТФаза, которая вместе с Н+-,К+-АТФазой образует отдельное подсемейство. Кроме эпителиальных клеток желудка, Н+-,К+-АТФаза (или ее изоформа) встречается также в эпителиальных клетках почечных канальцев и эпителии некоторых отделов кишечника. Как и Na+-,К+-АТФаза, Н+-,К+-АТФаза состоит из субъединиц двух типов: a-субъединицы - полипептида с молекулярной массой около 100 кДа (1033 аминокислотных остатка), выполняющего каталитическую функцию, b-субъединицы - гликопротеида с невыясненной до конца функцией, молекулярная масса которого составляет 50-60 кДа (291 аминокислотный остаток; остальная часть молекулы, примерно 1/3 по массе, представлена углеводными фрагментами). В настоящее время определена аминокислотная последовательность как а- [8], так b-субединиц [2], а также установлено расположение полипептидных цепей этих белков в мембране (рис. 3).

Рис. 3. Структура протонной помпы

протонный помпа желудочный слизистый

Полипептидная цепь a-субъединицы несколько раз пересекает мембрану, образуя 5 трансмембранных петель. N- и С-концы a-субъединицы находятся в цитоплазме. Значительная часть полипептидной цепи (около 800 аминокислот) образует большой цитоплазматический домен, в котором расположен активный центр фермента, где и происходит гидролиз АТФ. Катионы перемещаются через мембрану сквозь канал, который формируется трансмембранными петлями. N-конец b-субъединицы находится внутри цитоплазмы, ее полипептидная цепь пересекает мембрану только один раз. Большая часть b-субъединицы располагается с внеклеточной стороны мембраны. На ней расположены участки, подвергающиеся гликозилированию.

Протонный насос (Н+-,К+-АТФаза) осуществляет гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата. Высвобождающаяся в процессе гидролиза энергия используется для переноса катионов через мембрану против электрохимического градиента. В процессе каталитического цикла терминальная фосфорильная группа молекулы АТФ переносится на остаток аспарагиновой кислоты, расположенный на а-субъединице (Asp-385). В процессе гидролиза АТФ Н+-,К+-АТФаза пребывает в двух основных конформациях -- Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам. Процесс фосфорилирования - дефосфорилирования фермента сопряжен с закрыванием - открыванием створок канала с цитоплазматической или люминальной стороны мембраны, а переход Е1-Е2 - с изменением сродства к переносимым катионам. Циклическое чередование двух основных конформаций, а также процесса фосфорилирования - дефосфорилирования обеспечивает перенос протонов и ионов калия против градиента.

Каталитический цикл Н+-,К+-АТФаза представлен на рис. 3, б. Конформация Е, имеет высокое сродство к Н+, а конформация Е2 - к катионам К+. В конформации Е1, с ионсвязывающими центрами a-субъединицы, расположенными на цитоплазматической поверхности мембраны, связывается Н+, после чего происходит фосфорилирование Asp-385, расположенного в активном центре фермента (образование формы Е1-Р). Вследствие фосфорилирования закрываются створки канала, находящиеся на цитоплазматической стороне мембраны. Затем протоны перемещаются через мембрану, что приводит к изменению конформации фермента (переход Е1-Р в Е2-Р). В этом состоянии открываются створки канала с люминальной (внеклеточной) стороны. После этого протоны высвобождаются из катионсвязывающих участков фермента, а ионы К+ связываются с катионсвязывающими центрами на люминальной поверхности мембраны. Связывание К+ с Е2-Р формой фермента активирует гидролиз ацилфосфатной связи и высвобождение неорганического фосфата. Вслед за этим происходит закрывание створок канала с внеклеточной стороны, и ионы калия с внеклеточной поверхности мембраны перемещаются на цитоплазматическую. Связывание АТФ приводит к тому, что фермент претерпевает изменение конформаций (из Е2 переходит в Е,), и ионы К+ высвобождаются в цитоплазму, после чего цикл может повториться. Обмен ионов Н+ на ионы К+, осуществляемый Н+-,К+-АТФазой, является электронейтральным. Создаваемая в результате работы протонного насоса разница в концентрации ионов Н+ по разные стороны апикальной мембраны составляет 106. Это самый большой градиент концентраций, создаваемый известными в настоящее время системами активного транспорта.

Активность Н+-,К+-АТФазы (протонная помпа) специфически подавляется омепразолом и другими соединениями (лансопразол, пантопразол), являющимися замещенными производными бензимидазола (рис. 4). Эти соединения, широко используемые для лечения кислотозависимых заболеваний желудка, представляют собой слабые основания.

Рис. 4. Ингибиторы протонного насоса

Накапливаясь в кислых компартментах клетки, главным образом во внутриклеточных канальцах париетальных клеток, они связывают Н+ и претерпевают внутримолекулярные перестройки, превращаясь в собственно ингибитор, который ковалентно (необратимо) взаимодействует с SH-группами белка, расположенными на люминальной поверхности апикальной мембраны [7]. Восстановление активности Н+-,К+-АТФазы после обработки омепразолом происходит главным образом по мере синтеза новых молекул фермента, поэтому длительность вызванного им ингибирования зависит от скорости обновления фермента (половина молекул Н+-,К+-АТФазы человека обновляется за 30-48 ч). Специфичность действия омепразола и родственных соединений зависит от двух факторов: во-первых, от того, что их превращение в ингибитор происходит только в кислой среде (т.е. собственно в желудке), а во-вторых, от того, что мишенью действия ингибитора являются SH-группы протонной помпы, которые экспонированы в люминальное пространство желудка. Таким образом, ингибитор доставляется прямо к месту его действия.

Кроме омепразола и его аналогов, известны и нековалентные (обратимые) ингибиторы Н+-,К+-АТФазы [5]. Среди них наиболее изучены имидазопиридин SCH-28080 и SK&F 96936 (см. рис. 4). Эти соединения взаимодействуют с К-связывающим участком фермента. Длительность их действия на Н+-,К+-АТФазу обусловлена временем жизни главным образом самого соединения, а не фермента. В настоящее время предпринимаются попытки на основе обратимых ингибиторов Н+-,К+-АТФазы создать новый класс фармакологических средств для лечения кислотозависимых заболеваний желудка.

Помимо Н+-,К+-АТФазы, в секреции соляной кислоты участвуют также компоненты, обеспечивающие транспорт ионов К+ по градиенту концентраций и сопряженного с ним выхода Cl- против градиента концентраций. Транспорт ионов Cl- осуществляется через хлорный канал, который идентифицирован [4]. Он представляет собой белок с молекулярной массой около 100 кДа (898 аминокислот) и по структуре похож на каналы семейства СlС-2+, которые присутствуют в мозге и сердце (гомология в первичной аминокислотной последовательности между хлорным каналом из слизистой оболочки желудка кролика и СlС-2 хлорным каналом из мозга крысы составляет 93%). Проводимость канала равна 7 pS при концентрации CsCl 150 мМ с обеих сторон мембраны. Через канал, кроме Cl-, могут проходить и другие анионы. Селективность канала для катионов уменьшается в ряду: I-, Сl-, Вr-, NO-. Канал является потенциал- и рН-зависимым. Изменение потенциала от 0 до -80 мВ приводит к 10-кратному увеличению проводимости канала. При потенциале -80 мВ и внутриклеточном рН 7,4 снижение рН вне клетки до 3,0 дополнительно увеличивает проводимость канала в 5-6 раз.

Ионы К+ покидают клетку, по-видимому, через специальный калиевый канал. Установлено, что секреция соляной кислоты тормозится тетраэтиламмонием, который известен как ингибитор калиевых каналов. Однако в отличие от Сl-канала, структура которого хорошо изучена, калиевый канал идентифицирован только в электрофизиологических экспериментах.

Для выяснения молекулярных механизмов, обеспечивающих активацию секреции соляной кислоты, необходимо определить последовательность процессов, происходящих после связывания молекулы секретогена с рецептором, расположенным на поверхности париетальной клетки. В течение многих лет было известно, что париетальная клетка содержит как минимум рецепторы двух типов: гистаминовые Н2-рецепторы и мускариновые рецепторы для ацетилхолина. До недавнего времени не было данных о рецепторе для гастрина. Считалось, что гастриновые рецепторы находятся на энтерохромаффинных клетках, которые после связывания гастрина высвобождают гистамин. Выделяющийся из этих клеток гистамин связывается с Н2-рецепторами париетальных клеток, обеспечивая стимуляцию секреции.

Однако недавно было установлено, что и париетальные клетки содержат гастриновые рецепторы [10]. Рецептор для гастрина относится к типу В-рецепторов для холецистокинина (ССК-В). Этот тип рецепторов, как и находящиеся на поверхности париетальных клеток М-рецепторы, обеспечивает свое действие, активируя фосфолипазу С (рис. 5). Этот фермент гидролизует фосфоинозитиды, находящиеся в липидном слое мембраны. По-видимому, образующийся в результате гидролиза инозитолтрифосфат вызывает выход Са2+ из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум), в результате чего концентрация Са2+ внутри клетки возрастает. Второй продукт этой реакции - диацилглицерол вместе с Са2+ активирует Са, фосфолипидозависимую протеинкиназу (протеинкиназа С), которая в свою очередь фосфорилирует белки мишени, влияя на их функциональную активность. Кроме того, при связывании гастрина и ацетилхолина с рецепторами, находящимися на поверхности париетальных клеток, внутриклеточный уровень цГМФ повышается, вызывая цГМФ-зависимое фосфорилирование белков.

Рис. 5. Схема активации париетальной клетки

Таким образом, в результате активации париетальных клеток под действием как гастрина, так и ацетилхолина могут происходить увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и цГМФ и обусловленное этими агентами фосфорилирование белков-мишеней под действием протеинкиназ (см. рис. 5). Однако вся последовательность событий, от момента связывания гастрина и ацетилхолина с рецепторами до активации протонной помпы в отношении париетальной клетки, недостаточно изучена.

Наиболее исследована активация секреции соляной кислоты под действием гистамина. Связываясь с Н2-рецептором, находящимся на клеточной мембране, этот секретоген через G-белки активирует аденилатциклазу, в результате чего повышается внутриклеточный уровень цАМФ [1]. Вслед за этим происходит повышение внутриклеточной концентрации Са2+: он входит в клетку через плазматическую мембрану. Париетальные клетки содержат цАМФ-зависимые протеинкиназы, для которых мишенью является большое количество как цитоплазматических, так и мембранных белков. Одной из идентифицированных мишеней цАМФ-зависимой протеинкиназы служит Сl-канал. In vitro установлено, что фосфорилирование канала этой протеинкиназой приводит к увеличению его проводимости. В экспериментах с мембранными везикулами, полученными из стимулированных гистамином и несекретирующих (обработанных антагонистом Н2-рецептора циметидином) париетальных клеток, показано, что скорость секреции соляной кислоты в несекретирующих клетках лимитируется не активностью Н+-,К+-АТФазы, а проницаемостью Сl-канала. Таким образом, фосфорилирование Сl-канала цАМФ-зависимой протеинкиназой устраняет лимитирующую стадию в процессе секреции соляной кислоты. Использование Н2-блокаторов (циметидин) предотвращает активацию секреции НСl, блокируя лишь один из путей активации секреции. Сохраняются еще два пути активации - через рецепторы для гастрина и ацетилхолина. Именно поэтому Н2-блокаторы действуют менее эффективно, чем ингибиторы протонной помпы, которые блокируют собственно протонный насос.

В несекретирующих париетальных клетках большая часть Н+-,К+-АТФазы является неактивной и сосредоточена в везикулах, расположенных в цитоплазме неподалеку от апикальной поверхности мембраны (так называемые тубуловезикулы; см. рис. 1). Активация секреции сопряжена в первую очередь с перемещением этих везикул к поверхности апикальной мембраны или мембраны канальцев и их слиянием с этими мембранами. Этот процесс сопровождается увеличением количества молекул Н+-,К+-АТФазы на единицу поверхности мембраны. Активное участие в процессе морфологической перестройки париетальной клетки под действием секретогенов принимает ее цитоскелет: обработка клеток цитохалазинам А и Е, которые блокируют удлинение микрофиламентов, предотвращает активацию секреции. Известно, что около 4% белка париетальной клетки представлено сократительным белком актином и около 60% актина находится в полимеризованной форме [2]. Нити полимеризованного актина, сшитые друг с другом специальными белками цитоскелета, располагаются внутри микроворсинок апикальной поверхности мембраны, формируя своеобразный скелет. Другие белки цитоскелета сшивают нити актина с белками, встроенными в мембрану. Активация секреции сопряжена с перемещением актина к поверхности апикальной мембраны, а другого сократительного белка (миозин) - ближе к центру клетки. По-видимому, среди фосфорилируемых цАМФ-зависимой протеикиназой белков париетальных клеток немало белков цитоскелета. В частности, среди них идентифицирован 80 кДа переферический белок мембраны эзрин, который участвует в связывании актиновых микрофиламентов с мембраной [3]. Интересно отметить, что морфологические изменения клетки в значительной степени обеспечиваются под действием гастрина.

Суммируя изложенное выше, можно сделать вывод, что процесс секреции соляной кислоты париетальными клетками осуществляется за счет функционирования многокомпонентной транспортной системы, которая хорошо изучена. Активация секреции также является сложным процессом, осуществляемым в результате работы рецепторов трех типов и сопряженных с ними систем активации клеточного метаболизма. Молекулярные механизмы, обеспечивающие процессы активации секреции, изучены недостаточно. Современные фармакологические средства позволяют блокировать процесс активации секреции, воздействуя либо на один из путей активации секреции (блокада Н2-рецепторов), либо непосредственно на протонную помпу. Однако остается неясным, имеются ли в системе секреции соляной кислоты или в системе активации этой секреции молекулярные дефекты, которые приводят к возникновению у некоторых пациентов кислотозависимых заболеваний желудка. Изучение этой проблемы - задача ближайшего будущего.

Список литературы

1. Cuppoletti J., Malinowska D. Sachs G. Biochim. biophys. Acta. - 1988. - Vol. 972. - P.95-105.

2. Dabihe M., MunizagaA., Koenig C.S. Biol. Res. - 1994. - Vol. 27. - P. 29-38.

3. Hanzel D., Reggio H., BretcherA. et al. EMBO J. - 1991. - Vol. 10. - P. 2363-2373.

4. Malinowska D.N., Rupert T.Y., Baninski A. et al. Amer. J. Physiol. - 1995. - Vol. 268. - P. 191-200.

5. Pope A., Sachs G. Biochem. Soc. Trans. - 1992. - Vol. 20. - P. 566-572.

6. Rabon E.C., Reuben M.A. Ann. Rev. Physiol. - 1990. - Vol. 52. - P. 321-344.

7. Sachs G., Shin J.M., Briving C. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1995. - Vol. 35. - P. 277-305.

8. Schull G.E., Lingrel J.B. J. biol. Chem. - 1986. - Vol. 261. - P. 16788-16791.

9. Schull G.E. J. biol. Chem. - 1990. - Vol. 265. - P. 12123 - 12126.

10. Wolfe M.M., Tseny C.C. Gastroenterology. - 1993. - Vol. 104. - P. 1876-1878.

Размещено на Allbest.ru