Использование гистохимического иммуноферментного метода для раннего обнаружения вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток

Размещено на http: //www. allbest. ru/

ФГБОУ ВПО «ДагГАУ им. М.М. Джамбулатова», г. Махачкала

Использование гистохимического иммуноферментного метода для раннего обнаружения вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток

Т.Б. Ильясов - студент 253 гр., Х.З.

Махмудов - студент 233 гр., Б.М. Гаджиев,

к.в.н., доцент Д.А. Суллаева - ст. преподаватель

Аннотация

инфекционный ринотрахеит рогатый скот

Проведен сравнительный анализ результатов обнаружения вируса инфекционного ринотрахеита (вИРТ) в культуре клеток через 20 и 44 часа после инфицирования носоглоточными смывами экспериментально зараженных телят традиционным вирусологическим методом и гистохимическим иммуно-ферментным методом (гИФМ). Показано преимущество гИФМ перед традиционным методом вирусовыделения.

Вирус, культура клеток, титрование вируса, вирусо-выделение, гистохимический метод, цитопатогенное действие.

Annotatіon

The comparative analysis of the results of detection of virus infectious rhinotracheitis (vIRT) in cell culture through 20 and 44 hours after infection of calves experimentally infected smyvami nosoglotoиnymi traditional virological and gistohimiиeskim enzymetic method (gIFM). Shows the advantage gIFM to the traditional method of virusovydeleniв.

Virus, cell culture, virus Titrations, shedding, Histochemical method, citopatogennoe action.

Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КРС) инфекция, вызываемая ДНК - содержащим герпес вирусом 1-го типа. Протекает она в респираторной и генитальной формах, имеет широкое распространение и поражает животных всех возрастов и пород, причиняя значительный экономический ущерб.

Важным звеном в борьбе с болезнью является своевременный и точный диагноз. Имеющиеся традиционные методы являются продолжительными по времени и технически трудоемким. Разработка ускоренных, высокочувствительных и специфических тестов остается актуальной проблемой ветеринарной вирусологии.

В работе применяли гистохимический иммуноферментный метод (ГИФМ) обнаружения вируса ИРТ КРС в культуре клеток при одно- и многоступенчатом циклах инфицирования, сравнивали с традиционным методом вирусо-выделения по цитопатогенному действию (ЦПД), принятым в диагностической практике.

В работе использовали перевиваемую культуру клеток почек теленка Маdin Darby bovini kidney (МDВК), которую выращивали на среде Дюльбекко-Игла с гидролизатом лактальбумина в соотношении 2:1. В среду добавляли 10% фатальной (Flow) или телячьей сыворотки. После заражения использовали среду с 2%-ной сывороткой. Вирус ИРТ КРС получен из лаборатории вирусологии Московской ветеринарной академии - штамм 4016. Титр вируса был равен 107.5 БОЕ/мл. Заражение культуры клеток проводили в стеклянных пробирках, а для титрования вируса в динамике использовали пластиковые чашки (35x10мм, Flow, по БОЕ). Бляшкообразующую способность оценивали модифицированным методом Dulbeccj еt. al. с двойным агаровым покрытием.

ГИФМ ставили непрямым методом в пробирках с монослосм клеток, зараженных вирусом ИРТ по методу, модифицированному D.Duglas. В первой фазе реакции использовали кроличий антивирус ИРТ сыворотку, а во второй меченную пероксидазой сыворотку против lgG кролика. Индикатором реакции служил субстрат диаминобензидинтетрахлорид (ДАБ). Учет реакции проводили под световым микроскопом. Определяли процент окрашенных клеток.

При одноступенчатом цикле инфицирования клеток вирусом ИРТ (10 ИД 50/кл) ЦПД развивалось к 16-20 часу, а к 28 монослой клеток полностью разрушался. Появление инфекционного вируса отмечали с 9-10 час, и к 24 часу он достигал предельного титра - 107,5 ПЦД50/мл.

ГИФМ позволил обнаружить вирус в ранние сроки (с 8-го по 12-й час), что выглядело в виде отдельных окрашенных скоплений клеток (бляшек), составляющие 5-30% монослоя, с 16 по 28-й часы в зараженных клетках нарастала интенсивность окрашивания, и эти клетки составляли 5-100%. В контрольных пробах (зараженные клетки с нормальной сывороткой и незараженные - с иммунной) специфического окрашивания не наблюдали.

В условиях многоступенчатого цикла инфицирования клеток вирусом ИРТ (1 ИД50/1000 кл.) ЦПД развивалось с 64-го часа и полное разрушение монослоя происходило к 96-му часу. Инфекционный вирус появлялся с 16-го часа и к 80-му достигал предельного титра. ГИФМ обнаруживал вирус ИРТ с 24-го часа, затем интенсивность реакции и % окрашенных клеток нарастал.

Следовательно, ГИФМ в условиях одноступенчатого цикла инфицирования позволил обнаружить вирус ИРТ в клетках на 12 часов, а при многоступенчатом на 40 часов раньше, чем традиционный метод вирусовыделения по ЦПД.

Сравнивая полученные данные, можно сделать вывод, что ГИФМ обнаруживал вирус ИРТ в более ранние сроки (через 24-48 ч), чем принятые в ветеринарной практике методы вирусовыделения (через 30 суток). Кроме того, ГИФМ является относительно простым тестом, перспективным для массовых диагностических исследований в ветеринарной практике.

Фото 1 Титрование вируса ИРТ крупного рогатого скота по БОЕ. С - лунка контрольная (бляшки отсутсвуют), А и В - опытные лунки (обнаруживаются светлые бляшки)

Фото 2 Обнаружение с помощью ГИФМ, заражённых вирусом ИРТ клеток в виде тёмной окрашенной бляшки

Фото 3 Наступление ЦПД в монослое клеток на месте появления окрашенной бляшек

Литература

1. Калюжная А.М. и др. Сопоставление методов обнаружения аденовируса крупного рогатого скота 3-го серотипа в зараженной культуре перевиваемых клеток почки теленка (MDBK) / / Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1988. - № 10.

2. Мейхи В.Ф. Вирусология. Методы - М.: Мир, 1988.

3. Осидзе Д.Ф. Инфекционные болезни животных . - М.: Колос, 1987.

4. Сюрин В.Н. и др. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. М.: Агропромиздат, 1986.

5. Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987.

6. RichmanD.D. etal. Immunoenzymaticstainingofviaralandchlamidialantigensincellculture / / Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 1985. - V. 3.

Размещено на Allbest.ru