Иммунохроматографический метод исследования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Волгоградский государственный медицинский университет

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Реферат

Иммунохроматографический метод исследования

Волгоград, 2019

Актуальной задачей современного здравоохранения является ранняя диагностика возбудителей инфекционных заболеваний. При достижении достаточной быстроты ответа, экспресс-методы приобретают важное ориентирующее значение для своевременного проведения комплекса противоэпидемических мероприятий (изоляция, дезинфекция, обследование контактных) и назначения адекватной этиотропной терапии.

Ввиду значительного разнообразия для иммунохимических методов анализа предлагаются различные классификации. По режиму взаимодействия их можно разделить на гомогенные и гетерогенные методы. Гомогенный анализ основан на реакциях, протекающих в растворе. В случае гетерогенного анализа образование детектируемых иммунных комплексов идет с участием носителя - твердой подложки, мембраны, геля и пр.

Иммуноаналитические методы можно также разделить по способу детектирования образующихся иммунных комплексов: прямые - без использования маркеров (например, преципитация), косвенные - детектируемый сигнал формируется с помощью меток (латекс-агглютинация, иммунохроматография, иммуноферментный анализ и др.). Способ детекции результатов анализа зависит от природы маркера, он может быть оптическим, флуоресцентным, электрохимическим и др. Далеко не все виды иммунохимического анализа трансформируются в формат тест-методов или имеют портативные варианты реализации. Так, например, классический ИФА, капиллярный электрофорез, проточно-инжекционный анализ характеризуются значительной продолжительностью, необходимостью сложного аппаратурного обеспечения и отсутствием компактных тест-систем. Успешно трансформируются в тест-системы следующие иммунохимические методы: агглютинация, иммуноферментный анализ в кинетическом режиме, методы на основе резонансного переноса энергии с флуоресцентной и хемилюминесцентной регистрацией, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, иммунофильтрация, иммунохроматография. Перечисленные виды анализа переходят в разряд тест-методов при условии специальной комплектации набора для проведения тестирования, включающей все необходимые реагенты в готовой к применению форме, что сокращает время и снижает трудоемкость определении.

Одним из перспективных, среди вышеперечисленных, является иммунохроматографический метод.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) -- иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материала (моча, слюна, цельная кровь, сыворотка или плазма крови и т.п.). Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет.

Антиген - это вещество, которое определяется организмом человека как чужеродное и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию.

Антитела - это белки, образующиеся клетками организма человека в ответ на внедрение в него антигена.

Сущность метода

Одним из самых важным свойством антител является их способность избирательно связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело связывается только с определенным антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа, в том числе и ИХА.

Схема работы иммунохроматографического экспресс-теста (на примере тестов производства компании R-Biopharm (ФРГ)) приведена на Рис.

*Исследуемый образец суспендируют в специальном буферном растворе, твердым частицам дают осесть в течение нескольких минут.

*Надосадочную жидкость вносят в специальное окошко тест-кассеты, после чего она смешивается в определенной пропорции с конъюгатом -- специфичными к определяемому антигену антителами, связанными с окрашенными частицами латекса.

*Частицы образовавшегося комплекса «антиген-конъюгат» двигаются с током жидкости вдоль нитроцеллюлозной мембраны, в определенном месте которой (тестовой зоне) иммобилизованы другие антитела, также специфичные к антигену.

*Молекулы этих антител связывают частицы движущегося комплекса, в результате чего в тестовой зоне концентрируются окрашенные частицы и образуется видимая глазом полоса, свидетельствующая о наличии определяемого возбудителя в образце.

*Кроме того, проявляется контрольная полоса, свидетельствующая о том, что миграция образца вдоль мембраны произошла нормально, следовательно, анализ выполнен правильно и его результат достоверен.

*На мембране комбинированных экспресс-тестов, предназначенных для определения нескольких возбудителей одновременно, антитела разной специфичности присутствуют в нескольких тестовых зонах, соответственно в результате анализа может окраситься несколько тестовых полос, обычно разного цвета, соответствующих присутствующему в образце возбудителю

иммунохроматографический диагностика инфекционный

Принцип работы иммунохроматографического экспресс-теста. 1 - образец, содержащий аналит; 2 - конъюгат; 3,4 - иммобилизованные антитела (тестовая и контрольная полосы); 5 - подушечка для образца; 6 - подушечка для конъюгата; 7 - мембрана; 8 - подушечка для абсорбции реагентов; 9 - подложка для мембраны; 10 - тестовая полоса: положительный результат; 11 - контрольная полоса: достоверный результат теста.

Положительный результат экспресс-теста RIDA Quick Verotoxin / О157 Combi. Формат теста: вверху - тест-кассета, внизу - тест-полоска. 1 - участок внесения образца. 2 - участок расположения конъюгата. 3 - реакционная зона; слева направо - контрольная полоса (С); тестовая полоса, свидетельствующая о наличии в образце веротоксина (T2); тестовая полоса, свидетельствующая о наличии антигенов штамма O157 (T1). 4 - участок абсорбции реагентов (закрыт пленкой с названием теста).

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

1. В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии - антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений - вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.

2. Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит: белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит: белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце, конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг: белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Не связавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Метки, используемые в ИХА

В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами:

1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мультианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота.

2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.

3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.

4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.

5. Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.).

Антитела, используемые в экспресс-тестах

В экспресс-тестах используются три типа антител:

1. Подвижные моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость.

2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.

3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Взаимодействие (и окрашенная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда, если анализ проведен правильно, независимо от присутствия исследуемого антигена в исследуемом субстрате.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в т.ч. "полевых".

Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

Таким образом, в связи с высокой экспрессностью, специфичностью и чувствительностью иммунохроматографический анализ с успехом используется в лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Кроме этого, иммунохроматографические тест-системы - наиболее успешно коммерциализованный класс тест-методов.

Размещено на Allbest.ru