Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Волгоградский государственный социально-педагогический университет»

Естественно-географический факультет

Кафедра зоологии, экологии и общей биологии

Курсовая работа на тему:

«Современные методы диагностики генетических заболеваний»

Брехова Д.О.

Волгоград, 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ

1.1 Клинико-генеалогический метод

1.2 Популяционно-статистический метод

1.3 Цитогенетический метод

1.4 Близнецовый метод

Глава 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ

Глава 3. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЮЩИЕСЯ В МЕДИЦИНЕ

3.1 Дерматоглифика

3.2 Метод выявления гетерозиготного носительства

3.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Врождённые наследственные патологии вносят всё более возрастающий вклад в структуру младенческой смертности, детской заболеваемости и инвалидности. Глубокие изменения в деятельности ведущих органов и систем детского организма, возникающие вследствие генетически детерминированных состояний, способствуют формированию ранних повреждений у детей. В решении проблемы предупреждения врождённых и наследственных заболеваний у детей, и в первую очередь 2 основных групп заболеваний - врождённых пороков развития (ВПР) и хромосомных аномалий, большая роль принадлежит научно-практическим учреждениям медико-генетического профиля - медико-генетическим консультациям (МГК) местного и регионального масштаба, обеспечивающим практическую реализацию профилактических мероприятий.

Расшифровка генома человека, первый этап которого завершился в 2000 году созданием «чернового» варианта первичной нуклеотидной последовательности гигантской молекулы ДНК, явилась предпосылкой возникновению нового научно-практического направления - молекулярной медицины, в которой проблемы диагностики, профилактики и лечения решаются на молекулярном уровне при помощи нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и продуктов их экспрессии (белков). Методологическую основу молекулярной медицины составляют современные представления о структуре генома человека, его генах, их функциональных взаимодействиях, о так называемых генных сетях - генных ансамблеях - обеспечивающих различные функции организма в норме и при патологии.

Характерными особенностями молекулярной медицины как медицины, основанной на расшифровке генома человека, является её индивидуальный характер. Она направлена на коррекцию патологического процесса у вполне конкретного человека с учётом уникальных особенностей вполне конкретного генома. Её другая важная особенность - выраженная профилактическая направленность. Полные сведения о геноме могут быть получены задолго до начала заболевания. Отсюда соответствующие коррективы и профилактические мероприятия могут полностью ликвидировать или в значительной мере предупредить развитие тяжёлого заболевания. генетический диагностика цитогенетический

Внедрение молекулярной медицины в практическое здравоохранение требует овладения знаниями молекулярной биологии и генетики не только учёными всех разделов медицинской науки, но и врачами разных специальностей, в том числе акушерами и гинекологами.

Целью настоящей курсовой работы является рассмотрение диагностических методов современной медицинской генетики. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Рассмотреть основные методы медико-генетической практики.

2. Классифицировать данные методы в зависимости от степени их использования в диагностике.

3. Рассмотреть, какие нарушения позволяет идентифицировать каждый метод.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ

Исследование наследственных и врожденных заболеваний у человека сопряжено со многими трудностями, среди которых можно выделить следующие:

1) в отличие от исследователя-экспериментатора, клиницист-генетик не может проводить экспериментальных скрещиваний и проследить наследование признака в ряду поколений;

2) оценка полученных данных ограничивается продолжительностью жизни исследователя;

3) современные семьи имеют малое число детей, что затрудняет изучение направлений сегрегации того или иного наследственного признака.

В связи с этим клиницисту приходится анализировать то, что накапливается в существующих человеческих популяциях - признаки, болезни, пороки развития, аномалии органов и систем, тканевые дисплазии и т.д.

В медико-генетической практике используются специфические генетические методы, которые позволяют установить наследственный характер заболевания, типы наследования мутантного гена, выявить гетерозиготное носительство патологического гена, определить риск повторения генетически обусловленного заболевания у потомства и родственников больного.

Среди множества генетических методов классическими, используемыми в медико-генетической практике, являются четыре основных метода[1]:

1) клинико-генеалогический;

2) популяционно-статистический;

3) цитогенетический;

4) близнецовый.

Рассмотрим эти методы более подробно.

1.1 Клинико-генеалогический метод

Генеалогический метод диагностики наследственных болезней - один из важнейших методов в генетике, он представляет собой систему изучения заболеваемости в роду с составлением соответствующей родословной. Правильно построенная родословная дает возможность проследить семейные связи, соотношение между лицами женского и мужского пола, заболеваемость и причины смерти отдельных членов семьи в разных поколениях. При генеалогическом исследовании родословная строится не только на основании бесед, но и на непосредственном обследовании максимально возможного числа родственников[1].

С помощью генеалогического метода можно установить доминантный тип наследования заболевания (у кого он чаще всего проявляется - в некоторых случаях и рецессивный тоже). В этом случае один из родителей также будет страдать данным заболеванием, и будет отмечаться, что это же заболевание имелось у его более отдаленных предков. Если один из родителей при доминантном типе наследования является гомозиготным по данному признаку, то все его дети бывают больными; если родитель является гетерозиготным, что наблюдается чаще всего, то риск рождения больного ребенка снижается в 2 раза.

У различных родственников выраженность признаков болезни может быть разной. У отдельных лиц при наличии доминантного измененного гена заболевание может вовсе не проявиться. Такие носители гена остаются практически здоровыми, что связано с неполной распространенностью гена. Выраженность и частота проявлений гена зависят от влияния других генов, перекрывающих неполноценную информацию измененного участка. При рецессивном типе наследования болезни на родословной можно видеть, что одно и то же заболевание обнаруживается только у братьев и сестер больного. У других представителей родословной такого заболевания не отмечается. Родители, как правило, здоровы, но они являются носителями измененного гена, т.е. гетерозиготными. Иногда в таких случаях при составлении родословной удается установить кровное родство родителей. При браках между близкими родственниками (родные брат, сестра) особенно часто встречаются скрытые измененные гены, совмещение которых у ребенка обусловливает развитие наследственного заболевания. При рецессивном наследовании заболеванием в семье может страдать один ребенок из четырех. При исследовании родословных можно заметить, что заболевание, которым страдает ребенок мужского пола, обнаруживается в различных поколениях и только у мужчин, т.е. четко выступает явная передача болезни по наследству у лиц мужского пола. Такое наследование характерно для гемофилии (заболевание крови, при котором нарушается ее свертываемость), цветовой слепоты (дальтонизма) и др.

В настоящее время известно более 50 наследственных заболеваний, связанных с полом. Пол определяется половыми хромосомами: женский - хромосомами ХХ, мужской - ХY. Если измененный ген локализуется на Х-хромосоме, то другой, нормальный ген, отвечающий за этот же признак - на такой же Х-хромосоме у женщины, компенсирует отсутствие или низкую активность фермента, образующегося при считывании информации с измененного участка. Поэтому у лиц женского пола заболевание не проявляется, но 50% женщин такой семьи будут носителями патологического гена, который передадут половине своих сыновей. У лиц мужского пола, получивших от матери Х-хромосому с измененным геном, дефект не возмещается, и у них развивается заболевание.

Итогом клинико-генеалогического обследования является генетический анализ. Как известно, наследственная патология проявляется весьма полиморфно.

Наиболее частой ошибкой при использовании клинико-генеалогического метода является ограничение информации только простым опросом родственников. Этого, как правило, недостаточно. Для уточнения диагноза часто приходится проводить перекрестный опрос родственников, полное клиническое, лабораторное или инструментальное обследование членов семьи, а затем вновь возвращаться к генетическому анализу. Иногда только при подобном подходе удается выявить стертые формы наследственной патологии.

Клинико-генеалогический метод позволяет определить круг лиц, которые подлежат более глубокому обследованию для выявления скрытых клинических признаков болезни или признаков, выявляемых с применением лабораторных методов обследования. В связи с этим для уточнения наследственного характера заболевания и проведения эффективного медико-генетического консультирования клинико-генетический метод особенно ценен в следующих ситуациях:

- при наличии в семье генного заболевания;

- при выявлении врожденных пороков развития или различных уродств;

- при обнаружении в семьях мультифакториальных болезней (язвенная болезнь, гипертоническая болезнь, шизофрения, и др.);

- при выявлении однотипных симптомов в семье или у ближайших родственников;

- при устойчивости к традиционным способам лечения болезней с хроническим течением;

- при непереносимости ряда лекарств или пищевых продуктов;

- при наличии семейных форм аллергических заболеваний в семье;

- при кровнородственных браках родителей больного ребенка;

- при неблагоприятном акушерском анамнезе (спонтанные выкидыши, бесплодие, мертворождения и др.).

1.2 Популяционно-статистический метод

С помощью популяционно-статистического метода изучают наследственные признаки в больших группах населения, в одном или нескольких поколениях. Существенным моментом при использовании этого метода является статистическая обработка получаемых данных. Этим методом можно рассчитать частоту встречаемости в популяции различных аллелей гена и разных генотипов по этим аллелям, выяснить распространение в ней различных наследственных признаков, в том числе заболеваний. Он позволяет изучать мутационный процесс, роль наследственности и среды в формировании фенотипического полиморфизма человека по нормальным признакам, а также в возникновении болезней, особенно с наследственной предрасположенностью. Этот метод используют и для выяснения значения генетических факторов в антропогенезе, в частности в расообразовании.

При статистической обработке материала, получаемого при обследовании группы населения по интересующему исследователя признаку, основой для выяснения генетической структуры популяции является закон генетического равновесия Харди -- Вайнберга. Он отражает закономерность, в соответствии с которой при определенных условиях соотношение аллелей генов и генотипов в генофонде популяции сохраняется неизменным в ряду поколений этой популяции. На основании этого закона, имея данные о частоте встречаемости в популяции рецессивного фенотипа, обладающего гомозиготным генотипом (аа), можно рассчитать частоту встречаемости указанного аллеля (а) в генофонде данного поколения. Распространив эти сведения на ближайшие поколения, можно предсказать частоту появления в них людей с рецессивным признаком, а также гетерозиготных носителей рецессивного аллеля[2].

Математическим выражением закона Харди -- Вайнберга служит формула (рА + qa)², где р и q -- частоты встречаемости аллелей А и а соответствующего гена. Раскрытие этой формулы дает возможность рассчитать частоту встречаемости людей с разным генотипом и в первую очередь гетерозигот -- носителей скрытого рецессивного аллеля: p²AA + 2pqAa + q²аа. Например, альбинизм обусловлен отсутствием фермента, участвующего в образовании пигмента меланина и является наследственным рецессивным признаком. Частота встречаемости в популяции альбиносов (аа) равна 1:20 000. Следовательно, q² = 1/20 000, тогда q = 1/141, up = 140/141. В соответствии с формулой закона Харди -- Вайнберга частота встречаемости гетерозигот = 2pq, т.е. соответствует 2 х (1/141) х (140/141) = 280/20000 = 1/70. Это означает, что в данной популяции гетерозиготные носители аллеля альбинизма встречаются с частотой один на 70 человек.

Анализ частот встречаемости разных признаков в популяции в случае их соответствия закону Харди -- Вайнберга позволяет утверждать, что признаки обусловлены разными аллелями одного гена.

В том случае, если ген в генофонде популяции представлен несколькими аллелями, например ген группы крови системы АВО, соотношение различных генотипов выражается формулой (pI^A + qI^B + rI⁰) ².

Метод находит широкое применение в клинической генетике, т.к. внутрисемейный анализ заболеваемости неотделим от изучения наследственной патологии как в странах с большим населением, так и в относительно изолированных популяционных группах.

Статистический анализ распространенности отдельных генов и контролируемых ими признаков в популяционных группах позволяет определить адаптивную ценность конкретных генотипов. Среди людей невозможно найти генетически одинаковых лиц (за исключением монозиготных близнецов, для которых предполагается 100% общих генов), хотя общность генов хорошо прослеживается у близких и дальних родственников.

1.3 Цитогенетический метод

Цитогенетический метод диагностики наследственных болезней позволяет установить количественный состав хромосом в ядре клетки и некоторые их морфологические особенности (внешние формы), что имеет решающее значение в диагностике хромосомных болезней. Метод основан на том, что каждая пара хромосом имеет свои особенности, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании клетки в стадию деления. Культуру защитных клеток крови и клеток кожи фиксируют в период наибольшей активности, когда происходит размножение клеток. Их окрашивают, исследуют под микроскопом с большим увеличением, фотографируют хромосомы клеток, ядра которых находятся в стадии деления, вырезают и классифицируют. Дальнейшим анализом устанавливают возможные отклонения в структуре и количестве хромосом[3].

Хромосомный анализ необходим:

1) для уточнения диагноза при наличии у ребенка нечетких клинических признаков, характерных для хромосомного заболевания (болезни Дауна, синдрома Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера и др.);

2) при врожденных заболеваниях неясной причины с проявлениями, не вписывающимися в известные синдромы;

3) при повторных спонтанных абортах (выкидышах) в ранние сроки, мертворождениях и если в семье уже есть дети с врожденными пороками развития.

К цитологическому методу исследования относится и исследование полового хроматина, вещества из которого образуются хромосомы. Для этого используется мазок из снятого шпателем верхнего слоя клеток слизистой полости рта (щеки), который окрашивают ацето-орсеином. У нормальных женщин при наличии двух Х-хромосом одна из них во многих клетках принимает функционально пассивное состояние и обнаруживается в отдалении от клеточного ядра в виде интенсивного окрашивающегося основными красителями пятна (тельца Бара), называемого половым хроматином. У мальчиков половой хроматин в норме встречается не более чем в 5% клеток, тогда как у девочек он содержится в 20-70% клеток.

1.4 Близнецовый метод

Близнецовый метод основан на клиническом обследовании и сравнении моно- и дизиготных близнецов, воспитывающихся в одинаковых или различных условиях окружающей среды. Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют одинаковую наследственную конституцию. Таким образом, выявляемые между ними различия не связаны с наследственными факторами. Дизиготные близнецы развиваются из разных яйцеклеток, оплодотворенных различными сперматозоидами. Степень их генетического сходства неодинакова, но благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию они имеют больше общих средовых факторов. Особую ценность при изучении наследственных факторов, влияющих на тип поведения, психологические или интеллектуальные особенности, представляют монозиготные близнецы, разделенные в младенческом или раннем детском возрасте и воспитывающиеся в разных условиях. С помощью близнецового метода удалось доказывать значение генетической предрасположенности ко многим широко распространенным заболеваниям.

Близнецовый метод, также как и анализ родословной, позволяет установить наследственный характер признаков, и это единственный метод, выявляющий соотносительную роль (удельный вес) генетических (наследственных) и средовых факторов в формировании признака. Авторство близнецового метода приписывают Ф.Гальтону (1876). Этот метод сыграл очень большую роль в развитии генетики человека[1].

Принцип близнецового метода прост и заключается в сравнении моно- и дизиготных близнецов. Близнецы - потомство, состоящее из одновременно родившихся особей у одноплодных млекопитающих (человека и животных). Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют 100% общих генов, т.е. выявляемые между ними различия не связаны с наследственным фактором. Дизиготные близнецы развиваются из разных яйцеклеток, оплодотворенных разными спермиями. Они имеют 50% общих генов, но, благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию, имеют общие средовые факторы, следовательно, степень их различия определяется степенью несходства генотипов. Результатом сравнения этих двух групп близнецов является расчет показателей соответствия (конкордантности) и несоответствия (дискордантности), а также вычисление частоты возникновения заболевания /признака в каждой группе близнецов.

Методологические основы близнецового метода были разработаны в 1924 г. Сименсом, который показал необходимость исследования близнецов обоих типов и возможность надежной диагностики типа зиготности на основании анализа большого числа критериев. Кроме того, Сименс сформулировал принципы составления близнецовой выборки, создав предпосылки для изучения генетики нормальной изменчивости.

Результатом сравнения двух групп близнецов является расчет процента идентичности, или конкордантности, различных признаков или болезней, проявляющихся у каждого из пары близнецов. Чем больше наследственная составляющая признака или заболевания, тем выше значения конкордантности, но самое главное - больше уровень расхождения между моно- и дизиготными близнецами. Количественной оценкой доли наследственной обусловленности признака является коэффициент наследуемости (H), рассчитываемый по следующей формуле, предложенной Хольцингером:

Н = (КМБ - КДБ)/(100- КДБ),

где КМБ и КДБ - выраженная в процентах конкордантность признака для моно- и дизиготных близнецов соответственно. Если Н>70%, решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам. При H<30% - средовые факторы являются основными в формировании признака. При промежуточных значениях Н предполагается примерно равное участие в контроле признака как генетических, так и средовых факторов.

Например, при заболевании корью или коклюшем одного из партнеров близнецовой пары вероятность заболевания второго (конкордантность пары) в группах моно и дизиготных близнецов практически одинаковая: 98% и 94% и 97% и 93%, соответственно. Преобладающая роль инфекционного фактора в данном случае очевидна. При туберкулезе вероятность заболевания второго близнеца в монозиготной паре почти в 3 раза больше, чем в дизиготной - 67% и 23 %. То есть при идентичном генотипе сходная реакция на туберкулезную инфекцию наступает чаще, чем при разных генотипах. Этот факт показывает значительную роль наследственной предрасположенности ребенка к туберкулезу, что в настоящее время очень важно иметь в виду в связи с данными об увеличении распространенности туберкулеза.

ГЛАВА 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ

Биохимические методы направлены на выявление биохимического фенотипа организма. Эти методы позволяют диагностировать наследственные болезни, обусловленные генными мутациями. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки) отражают сущность болезни более адекватно, чем клинические симптомы.

Предметом биохимической диагностики могут быть различные классы органических и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металлов и др.) и их метаболиты, концентрация и отклонения в активности ферментов. Универсальность биохимической диагностики состоит в том, что исследовать этими методами можно любую ткань или секрет организма (мочу, пот, кровь, слюну, мышцы и др.). Это обуславливает многообразие биохимических методов и необходимость их непрерывного совершенствования.

Биохимические методы играют первоочередную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ (НБО). Универсальность этих методов позволяет использовать их в дифференциальной диагностике и для выявления гетерозиготного носительства другой моногенной патологии, при которой изменение биохимических показателей является вторичным: например, при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера (ПМДД/Б) повышается уровень креатин-фосфокиназы (фермент мышц) в крови больных при начальной и развернутой стадии заболевания, а также и у 30% носительниц гена ПМДД/Б.

С каждым годом совершенствуясь, биохимические методы становятся все более сложными, многоступенчатыми, а, следовательно, и дорогими. Использовать их для программ массового скрининга наследственных болезней, многие из которых встречаются в популяциях со сравнительно низкой частотой, невыгодно. Необходимо предварительное «просеивание» популяции.

Биохимические методы подразделяют на качественные, количественные и полуколичественные.

Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, накапливающихся при НБО. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная с их помощью, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить НБО у пациента. Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекарственных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Качественные пробы бывают универсальными (выделяется группа заболеваний, класс веществ; например, ЦПХ-тест для мукополисахаридов) и специфическими (на цистин-гомоцистин, метилмалоновую кислоту и др,). Наиболее распространены качественные тесты с мочой, вследствие доступности и простоты получения материала для исследования.

Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочой (тест с цианид-нитропруссидом - гомоцистинурия, цистинурия; ЦПХ-тест -- мукополисахаридозы), так и с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, молочная кислота, кетоновые тела, пировиноградная кислота, холестерин, триглицериды) и могут иметь различную степень сложности. Наиболее простые из них, такие как измерение концентрации лактата, пирувата, кетоновых тел, ионов аммония, а также определение кислотно-щелочного равновесия, позволяют планировать дальнейшую тактику диагностики: так метаболический ацидоз служит показанием для проведения газовой хроматографии с целью исключения органических ацидурий, а повышение концентрации ионов аммония -- для исключения дефектов цикла мочевины; определение концентрации кетоновых тел и соотношения концентраций лактат/пируват в крови является первым этапом для дифференциальной диагностики митохондриальных болезней.

Конечно, решающее значение в диагностике нарушений обмена играют более сложные и высокоточные количественные методы, такие, как флуориметрические, хромато-спектрометрия, спектрофотометрия, различные виды хроматографии и электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ). Все эти методы можно условно разделить на две группы: методы, позволяющие получить спектр какого-либо класса веществ, например, аминокислот, и методы для определения концентрации конкретного вещества, например, фенилаланина или тирозина (флуориметрический метод). Хроматографические методы, как правило, дают информацию о спектре и количестве веществ.

С помощью биохимических методов описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Наиболее распространенными среди таких заболеваний являются болезни, связанные с дефектами ферментов, структурных и транспортных белков. Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в биологических средах (например, моче и крови) продуктов метаболизма, являющихся продуктом функционирования данного белка.

Дефицит конечного продукта, сопровождающийся накоплением промежуточных и продуктов нарушенного метаболизма, свидетельствует о дефекте фермента или его дефиците в организме.

Биохимические методы многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Объектами могут быть моча, пот, плазма и форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты). В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, для эффективного их использования применяется определенная система. Биохимическую диагностику проводят в два этапа.

На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором - более точными и сложными методами уточняют диагноз заболевания. Первый этап включает качественные и количественные тесты с мочой и кровью на белок, кетокислоты, цистин и гомоцистин, креатинин и другие показатели. Фактически такие исследования можно проводить в каждой больнице. Показания их применения достаточно широкие, стоимость каждого анализа невысокая. Второй этап основан на более точных методах, позволяющих обнаружить большие группы биохимических аномалий. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий.

Несмотря на сложность и дороговизну, биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственных болезней. Современные высокоточные технологии (жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитная резонансная спектроскопия, бомбардировка быстрыми нейтронами) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни. Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, нарушения кислотно-основного состояния, остановка роста. Например, в случае фенилкетонурии применение биохимических исследований позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо болезни клиническая картина). Биохимические методы применяются для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).

ГЛАВА 3. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЮЩИЕСЯ В МЕДИЦИНЕ

В совокупности с вышеперечисленными методами используются ещё несколько, более специфичных методик.

3.1 Дерматоглифика

Основное внимание в дерматоглифике уделяется папиллярным узорам так называемой гребешковой кожи ладоней и стоп человека. Как правило, особо выделяются узоры, расположенные на подушечках пальцев рук, к ним относятся следующие описательные понятия[5]:

· Трирадиус или дельта. Место схождения трёх групп параллельных папилярных линий.

· Гребешковый счёт. Количество папилярных линий от центра пальцевого узора до трирадуса.

· Дуга, петля, завиток. Виды пальцевых узоров. Дуге соответствует отсутствие трирадуса в узоре, петле -- один трирадиус, завитку -- два трирадиуса.

· Дельтовый индекс. Общее количество трирадусов на всех пальцах.

При описании признаков остальной ладони выделяются:

· Межпальцевый трирадиус. Признак, аналогичный пальцевым дельтам, расположенный между основаниями пальцев.

· Направление ладонных линий. Учитывается, на каком поле ладони заканчиваются папиллярные линии, начинающиеся от межпальцевых трирадиусов.

· Тенар (thenar) -- возвышение в основании большого пальца.

· Гипотенар (hypothenar) -- второе возвышение ладони, расположенное ниже основания мизинца.

· Осевой проксимальный ладонный трирадиус (t). Расположен близко к медиальной линии ладони.

При этом, при различных целях исследования, выделяются и описываются разные группы признаков.

Расоводиагностические признаки

Для исследования в области расоведения имеют значения пять основных признаков, перечисленных по мере снижения их важности:

· Индекс Каминса (Ic). Определяется по направлениям главной ладонной линии (начинающейся от основания указательного пальца) и линии, начинающейся от мизинца;

· Дельтовый индекс (Dl10);

· Осевой проксимальный ладонный трирадиус (t);

· Частота истинных узоров на гипотенаре (Hy);

· Процент добавочных межпальцевых трирадиусов (ДМТ);

Также ограниченно значим признак частоты истинных узоров на тенаре/первой межпальцевой подушечке (Th/I), дифференцирующий американских индейцев. Анализ родства человеческих популяций, как правило, производят сравнением комплексов упомянутых признаков^[2].

Редкие признаки дерматоглифики

У человека насчитывается более 30 редких признаков дерматоглифики, которые используются в дисморфологии как информативные морфогенетические варианты, указывающие на возможность хромосомного дисбаланса, менделирующих мутаций или тератогенного эффекта у пробанда.

Метод наиболее информативен при хромосомных синдромах, когда выявляются дистальный осевой трирадиус, избыток дуг на пальцах, отсутствие дистальной межфаланговой складки, радиальные петли на I, IV и V пальцах, четырехпальцевая (обезьянья) складка (при болезни Дауна на коже ладоней у ребенка отмечается в 40-60% случаев.

В настоящее время метод применяется в основном в судебной медицине.

3.2 Метод выявления гетерозиготного носительства

Для человека, чье гетерозиготное состояние по тому или иному заболеванию установлено, чрезмерно важно не встретиться в браке с носителем подобного рецессивного гена, т.к. риск рождения у них больного ребенка составляет 25% как при первой, так и последующих беременностях.

Предположения о гетерозиготности женщины:

1) если у женщины поражен отец наследственной болезнью;

2) если женщина родила двух или нескольких пораженных сыновей;

3) если у женщины поражен брат (или братья), и, кроме того, она имеет пораженного сына или внука (от дочери);

4) если женщина имеет двух дочерей, причем у каждой из них родился пораженный сын (или сыновья).

Пути исследования:

1. Клиническое изучение микросимптомов заболевания с выявлением аномалий развития.

2. Использование нагрузочных тестов (прием фенилаланина выявляет повышение его содержания в крови - предположение о гетерозиготности по фенилкетонурии).

3. Микроскопическое исследование клеток крови и тканей.

4. Биологическое определение активности того или иного фермента, пострадавшего в результате мутации гена.

3.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе)[4].

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

ПЦР является одним из методов, который позволяет установить кариотип ребенка при использовании одной-единственной клетки. Биопсия материала для диагностики в сочетании с технологиями ПЦР проводится на 3-й день после оплодотворения, когда эмбрион содержит от 6 до 10 бластомеров. На этой стадии бластомеры являются полипотентными, и процедура биопсии не оказывает отрицательного влияния на жизнеспособность эмбриона. Оптимальным является анализ 1 - 2 бластомеров. В настоящее время биопсия бластомеров является современным подходом для пренатальной диагностики и может использоваться в клинической практике.

Эффективность ПЦР единственной клетки значительно ниже, чем обычной ПЦР, в которой количество ДНК-матрицы может быть в несколько раз больше. Снижение эффективности метода может происходить в результате разнообразных причин, касающихся как образца, так и самой процедуры ПЦР. К операционным проблемам относят потерю материала во время переноса клетки в пробирку или внезапный лизис до помещения клетки в пробирку, что снижает эффективность амплификации или приводит к ее отсутствию. Внутренние факторы заключаются в отсутствии ядра, дегенерации клетки с потерей или деградацией ДНК. Эти факторы контролировать значительно сложнее. На эффективность ПЦР, кроме процедуры переноса высококачественной ядросодержащей клетки, также влияет качественный лизис клетки с целью получения ДНК-матрицы.

Стратегии ПЦР, применяемые в ПГД

ПЦР с вложенными призерами

Для того, чтобы четко выявить ПЦР-продукт в геле с помощью окраски бромидом этидия или нитратом серебра, необходимо примерно 50 - 60 циклов ПЦР с уникальной последовательностью, хотя Taq-полимераза может начать "ошибаться" примерно после 40 циклов, в результате чего появляется неспецифический продукт. Решить эту проблему можно при использовании ПЦР с вложенными праймерами для увеличения чувствительности и специфичности ПЦР с единственной молекулы ДНК. Первый раунд ПЦР увеличивает количество анализируемого фрагмента ДНК, содержащего возможную мутацию. ПЦР-продукт (полученный в первом раунде) используется как матрица для второго раунда амплификации с другим набором праймеров, расположенным внутри первого фрагмента. Таким образом, увеличивается специфичность ПЦР. Использование двух различных наборов праймеров значительно снижает риск контаминации.

ПЦР с использованием флюоресцентно-меченных праймеров

ПЦР с использованием флюоресцентно-меченных праймеров (ПЦР ФП) по многим причинам в последнее время стала методом выбора, который широко используют в лабораториях для анализа ДНК единственной клетки. Использование лазерных систем автоматического анализа фрагмента, меченного различными флюоресцентными молекулами, во много раз увеличивает чувствительность выявления ПЦР-продукта по сравнению с окраской бромидом этидия или нитратом серебра, а также снижает риск контаминации. Автоматическая система четко фиксирует изменения размера полученного продукта даже в один нуклеотид. Кроме того, отпадает необходимость в долговременном электрофорезе фрагментов ДНК в полиакриламидном геле, поэтому анализ может быть проведен в кратчайшее время.

Полногеномная амплификация

В последнее время основным методом увеличения количества ДНК при анализе единственной клетки в ПГД является полногеномная амплификация (ПА). Использование этого метода позволяет значительно увеличить количество ДНК-матрицы, необходимой для проведения ПЦР. Наиболее часто используемый метод полногеномной амплификации - добавочная предамплификация (ДПА). При использовании этого метода случайные последовательности 15-нуклеотидных праймеров инициируют синтез геномной ДНК.

Недостатком ПА является то, что амплифицируется большое количество повторяющейся ДНК (короткие тандемные повторы), что дает некий "фон", который может приводить к ошибкам специфической ПЦР. Эти ошибки возникают в результате скольжения цепи ДНК во время полимеризации продукта, особенно при низких температурах, необходимых для этого метода. В связи с этим не рекомендуется использование полногеномной амплификации при клинической диагностике заболеваний, связанных с экспансией тринуклеотидных повторов, или при диагностике, основанной на анализе сцепления с высокополиморфными микросаттелитными повторами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проделанной работы можно сделать вывод, что в настоящее время методы клинической генетики сложны и разнообразны. С их помощью можно диагностировать многие заболевания генного аппарата, выявить различные мутации на самых ранних сроках беременности и вовремя поставить вопрос о её прерывании, если диагностированная болезнь является серьёзной. Кроме того, при помощи клинической генетики можно не только диагностировать болезнь у одного конкретного человека, но и составить прогноз о появлении в его роду каких-либо наследственных болезней и дать некоторые рекомендации.

К сожалению, вынуждены признать, что у всех вышеперечисленных методов есть один существенный недостаток - их дороговизна. Биохимические методы чрезвычайно дороги в использовании, проводить ПЦР могут себе позволить лишь самые лучшие центры пренатальной диагностики. Существенная цена методов клинической генетики очень сильно влияет на их распространенность - и на политику государства в их отношении.

В нашей стране очень немногие люди могут себе позволить сделать какие-либо анализы, подобные вышеперечисленным. Поэтому часто для будущей матери оказывается сюрпризом, что её ребенок имеет серьёзное наследственное заболевание - и хорошо, если это выясняется во время беременности, а не уже после рождения ребенка.

Чтобы избежать таких ситуаций, нужно делать все, что возможно, чтобы снизить цену дорогостоящего генетического анализа. Тогда мы сможем с уверенностью сказать, что в нашей стране люди получают хорошую, а самое главное - современную, медицинскую помощь.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Е.К. Гинтер. Медицинская генетика. Учебник для студентов мед. вузов. Изд.: Медицина, 2003, с. 40-47.

2. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д., Биология в 3-х томах. Москва, изд. Мир, 1990г.

3. Н.Н. Приходченко, Т.П. Шкурат. Основы генетики человека. Изд. Феникс, 1997г., с. 59-71.

4. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. Биохимия. 1980. T. 45. с. 644-651.

5. Хить Г. Л., Долинова Н. А. Расовая дифференциация человечества (дерматоглифические данные). Москва, «Наука». 1990. с. 115-118.

Размещено на Allbest.ru