Разработка противомикробного препарата для птицеводства "Трифлон"

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Контроль заболеваемости птицы, вызванной патогенными штаммами E. сoli, а также другими микроорганизмами, является очень актуальным в промышленном птицеводстве. Препараты, предназначенные для этих целей, должны иметь следующие свойства:

1. Высокая противомикробная активность.

2. Медленное развитие резистентности у микроорганизмов.

3. Высокая технологичность применения (легкость введения с питьевой водой, высокая растворимость в воде, возможность комбинирования с другими медикаментозными и иммунобиологическими препаратами).

4. Отсутствие токсичности.

5. Отсутствие отрицательного действия на продуктивность птицы.

6. Отсутствие отрицательного влияния на качество мяса.

7. Отсутствие отрицательного действия на сапрофитную и полезную микрофлору.

8. Короткий период выведения из организма птицы с целью недопущения попадания остаточных количеств препарата в пищу человеку.

Вследствие регулярного использования антибиотиков и других антимикробных препаратов в промышленном птицеводстве микроорганизмы выработали к ним разную степень устойчивости, из-за чего эффективность традиционных противомикробных средств в большинстве случаев не удовлетворяет практических ветеринарных врачей.

Перед научным подразделением АО «Биофарм» была поставлена задача разработать противомикробный препарат, который отвечает всем вышеперечисленным качествам. В результате теоретической проработки было установлено, что наивысшей антимикробной активностью против кишечных патогенов у птиц обладает энрофлоксацин, а также ко-тримоксазол (комбинация триметоприма с сульфаниламидом) [1]:

Рис. 1. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для E. сoli противомикробных препаратов (мкг/мл, 1204 изолятов)

Ко-тримоксазол и энрофлоксацин давно с успехом применяются как противомикробные средства в гуманной и ветеринарной медицине. Оба препарата имеют широкий спектр действия, подобные фармакокинетические особенности, низкую токсичность и медленное образование резистентности к ним у микроорганизмов.

Ко-тримоксазол давно известен, как химиотерапевтическое средство с широким спектром бактериостатического действия, обусловленного блокированием биосинтеза фолатов в микробных клетках: сульфаниламид блокирует синтез дигидрофолиевой кислоты, а триметоприм препятствует преобразованию дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую. В последние годы пришло новое понимание роли триметоприма и сульфаниламидов в этом комбинированном препарате [2]. Установлено, что эффективность комбинации триметоприма с сульфаниламидом, которая выявлена in vitro, не является такой же in vivo, т.е. в организме человека или животных. В опытах in vitro наиболее эффективным было сочетание 1 части триметоприма и 20 частей сульфаниламида [3]. При этом для достижения такого же соотношения концентраций в плазме крови, количество триметоприма и сульфаниламида в препаратах, предназначенных для введения внутрь, должно было быть равным 1:5. Это соотношение было выбрано в качестве своеобразного стандарта. Однако бактериемия встречается редко. В большинстве клинических случаев имеет значение концентрация противомикробных средств не в крови, а в органах и тканях, в месте локализации микроорганизмов. В связи с высокой липофильностью, концентрация триметоприма в органах и тканях, а также моче, значительно превосходит концентрацию в плазме крови. Для сульфаниламидов такая разница отсутствует. Вследствие высокой липофильности, кажущийся объем распределения триметоприма (около 100 л для человека) более чем в 12 раз превосходит объем распределения сульфаметоксазола (около 8 л), поэтому соотношение концентраций препаратов в тканях значительно отличается от 1:20. В моче, например, оно может достигать 1:1; при этом какой-либо синергизм отсутствует. Таким образом, сульфаниламидный компонент в местах нахождения микроорганизмов не может достичь концентрации, достаточной для выраженного противомикробного действия и представляет собой балласт. Кроме того, сульфаниламиды вносят значительный вклад в развитие побочных реакций, которые возникают после применения комбинированных препаратов [3].

В результате было принято решение исключить из разрабатываемого препарата сульфаниламидный компонент, как неэффективный и токсичный.

Энрофлоксацин продолжает оставаться одним из основных противомикробных средств в ветеринарной медицине. Несмотря на продолжительное применение, резистентность к нему у микроорганизмов вырабатывается достаточно медленно. Он имеет низкую токсичность и широкий спектр действия. Практически не вызывает кишечного дисбактериоза. Имеет относительно низкую цену.

Комбинация энрофлоксацина и триметоприма была признана нами очень перспективной для создания нового препарата, предназначенного для применения в птицеводстве. Основные трудности заключались в том, что из энрофлоксацина можно легко изготовить пероральный раствор, а триметоприм существует только в виде порошка и суспензии для перорального применения. В результате исследований, направленных на получение растворимой в воде формы триметоприма, нами впервые в мировой практике был получен раствор триметоприма, пригодный для перорального применения в виде водного раствора, совместимого с раствором энрофлоксацина. Комбинированный раствор триметоприма (5%) и энрофлоксацина (10%) носит название «Трифлон». Трифлон сохраняет стабильность в воде любой жесткости, любой концентрации и полностью пригоден для применения через системы поения в промышленном птицеводстве.

Фармацевтическая совместимость.

Изучение фармацевтической совместимости триметоприма и энрофлоксацина проводилось путем изучения основных физико-химических свойств растворов этих синтетических противомикробных средств. Для этого были изготовлены растворы триметоприма и энрофлоксацина разных концентраций в разных растворителях при разных условиях температуры и рН. Были определены оптимальные условия, при которых энрофлоксацин и триметоприм содержатся в дисперсной системе в виде истинных растворов, что достигнуто впервые.

Стабильность.

Стабильность препарата определяли с помощью метода ускоренного старения в трех сериях препарата.

Препарат “Трифлон” помещали в термостат при температуре 40±20С и относительной влажности 75±5%, выдерживали определенное время и анализировали с целью количественного определения триметоприма и энрофлоксацина. При каждом анализе определялась концентрация триметоприма и энрофлоксацина в 3 сериях препарата. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Концентрация триметоприма и энрофлоксацина в препарате “Трифлон”, подвергнутому ускоренному старению

В результате проведенных исследований установлено, что на протяжении 36 месяцев эксперимента концентрация триметоприма и энрофлоксацина в готовой лекарственной форме препарата “Трифлон” была в пределах нормы и отвечала требованиям нормативно-технической документации.

Таким образом, препарат годен для использования на протяжении 3 лет с момента изготовления.

Токсичность.

Исследование токсичности препарата «Трифлон» проводили на птице в условиях ООО «Балагропромсервис», Балаклеевского района, Харьковской области. В опытах использовали цыплят возрастом 90 суток и живым весом 950-1000 г. Из отобранных цыплят было сформировано 5 групп (по 20 голов) - 4 подопытные и 1 контрольная. С целью определения токсичности препарата «Трифлон», цыплятам подопытных групп задавали препарат с питьевой водой в следующих дозах:

- группа 1 - 1 мл препарата на 1 л питьевой воды (терапевтическая доза);

- группа 2 - 3 мл препарата на 1 л питьевой воды (трехкратная терапевтическая доза, 3Х);

- группа 3 - 5 мл препарата на 1 л питьевой воды (пятикратная терапевтическая доза, 5Х)

- группа 4 - 10 мл препарата на 1 л питьевой воды (десятикратная терапевтическая доза. 10Х);

Контрольной группе выпаивали чистую питьевую воду. Всех животных содержали в одинаковых условиях с одинаковым рационом.

На протяжении всего периода исследований (10 суток) за поголовьем цыплят вели наблюдение. При этом учитывали: общее состояние птицы, состояние кожи и слизистых оболочек, состояние аппетита (поедаемость кормов), количество выпитой воды, температуру тела, пульс, количество дыхательных движений.

По результатам наблюдений за цыплятами подопытных групп 1X, 3X и 5X на протяжении 10 суток не установлено никаких изменений в общем состоянии, аппетите, потреблении воды. Температура тела, пульс, дыхание находились в пределах физиологической нормы.

В дозе 10X были отмечены случаи диареи. Эти эффекты исчезли после окончания опыта.

Фармакодинамика.

Энрофлоксацин - противомикробное средство широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Механизм действия связан с угнетением бактериальной ДНК-гиразы, что приводит к нарушению репликации ДНК бактерий.

Триметоприм - противомикробное средство широкого спектра действия из группы диаминопиримидинов. Механизм действия связан с угнетением бактериальной редуктазы дигидрофолиевой кислоты. Бактериальная дигидрофолатредуктаза в 50-100 тысяч раз чувствительнее к триметоприму, чем у животных и человека. Триметоприм блокирует один из этапов синтеза нуклеиновых кислот - образование тетрагидрофолиевой кислоты из дигидрофолиевой, которая является субстратом для синтеза нуклеиновых кислот бактерий.

Таким образом, оба препарата у микробов действуют на разные звенья одного и того же процесса - синтеза нуклеиновых кислот, что является предпосылкой для проявления потенцированного синергизма.

Фармакокинетика.

Энрофлоксацин хорошо и быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта и распределяется в органах и тканях. Терапевтические концентрации достигаются через 1-1,5 часа после введения и сохраняются 24 часа. Присутствие корма в желудке не влияет на степень адсорбции препарата. Связывание энрофлоксацина с белками составляет 24±2%. Наивысшие концентрации энрофлоксацина достигаются в желчи, почках, печени, легких, репродуктивных органах. Экскреция энрофлоксацина происходит преимущественно почками. Период полувыведения составляет 3 - 5 часов. Метаболиты выводятся с мочой и калом.

Триметоприм быстро всасывается из кишечного тракта, хорошо распределяется по всем тканям и жидкостям. Концентрации триметоприма в тканях выше, чем в крови. Высокие уровни триметоприма наблюдаются в легких, почках и печени. Концентрация триметоприма в сыворотке крови достигает максимума через 1,5 часа после введения. Метаболизируется в печени и выделяется, главным образом, почками путем клубочковой фильтрации и активной канальцевой секреции. Концентрация в моче значительно выше, чем в крови. Период полувыведения составляет 8 - 10 часов.

Сходство фармакокинетических параметров энрофлоксацина и триметоприма (биодоступность, период полувыведения) позволяет комбинировать их в одном препарате.

Противомикробная активность и спектр действия.

Энрофлоксацин обладает противомикробным действием на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы (E. сoli, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium spp., Listeria monocytogenes, Corinebacterium spp., Pseudomonas, Haemophilus spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Pasteurella spp. и прочие), а также действует на микоплазмы и хламидии.

Триметоприм имеет противомикробное действие относительно грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (E. coli, Klebsiella spp., Salmonella spp., Pasteurella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Haemophilus spp., Chlamidia), а также действует на токсоплазмы и кокцидии.

Противомикробную активность трифлона in vitro изучали двумя методами.

В первом опыте методом микроразведений сравнивали трифлон с двумя импортными препаратами, содержащими энрофлоксацин в концентрации 10%. Результаты опыта представлены в таблице 2 (минимальная ингибирующая концентрация, МИК, мкг/мл) и в таблице 3 (минимальная бактерицидная концентрация, МБК, мкг/мл). В опыте использовали Staphylococcus aureus P 209 и полевой штамм E. сoli. Расчет МИК и МБК велся по энрофлоксацину [5].

Таблица 2. Минимальная ингибирующая концентрация трифлона и препаратов сравнения, мкг/мл (n=5)

Таблица 3. Минимальная бактерицидная концентрация трифлона и препаратов сравнения, мкг/мл

Во втором опыте с помощью диско-диффузного метода изучали противомикробную активность трифлона в сравнении с другими антибиотиками (таблица 5). В качестве тест-культур использовали штамм E. coli О78 и Salmonella typhimurium.

Таблица 4. Чувствительность бактериальных культур к трифлону и различным антибиотикам (диско-диффузный метод)

Из приведенных данных видно, что трифлон имеет выраженное преимущество в антимикробной активности по сравнению с другими антибиотиками.

С целью изучения профилактической эффективности трифлона при выращивании бройлеров, в одном из крупных хозяйств был поставлен опыт на 560500 головах цыплят. Трифлон задавался с питьевой водой в дозе 1 л на 1000 л питьевой воды с 1 по 5 день жизни. Забой цыплят в подопытной и контрольной группах осуществлялся на 43 день.

Препаратом сравнения был импортный препарат, содержащий 10% энрофлоксацина.

Результаты опыта представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты применения трифлона и препарата сравнения с профилактической целью на цыплятах бройлерах

фармацевтический трифлон бройлер

Выводы:

1. Создан новый, высокоэффективный комбинированный противомикробный препарат - Трифлон, содержащий 10% энрофлоксацина и 5% триметоприма.

2. Трифлон является стабильным препаратом, легко растворяющимся в воде любой жесткости, пригодным для введения в систему поения с помощью медикаторов.

3. Противомикробная активность трифлона на всех испытанных культурах микроорганизмов была выше традиционно применяемых препаратов.

4. Комбинация энрофлоксацина и триметоприма в препарате Трифлон обладает синергизмом.

5. В терапевтических и увеличенных в 5 раз дозах трифлон не оказал отрицательного влияния на подопытных цыплят.

6. Производственные испытания Трифлона показали его преимущество над препаратами, содержащими только энрофлоксацин.

Список литературы

1. http://www.octagon-services.co.uk/articles/poultry_pathogens.htm

2. Страчунский Л.С., Козлов Р.С. Современные взгляды на применение ко-тримоксазола. - Клиническая фармакология и терапия. - 1997; т.6, №2, стр.27-31.

3. Bushby S.R.M., Hitchings G.H. Trimetoprim, a sulphonamide potentiator. - Br. J. Pharmacol., 1968, 33, 72-90.

4. Brumfitt W., Hamilton-Miller J.M.T. - Limitations of and indications for the use of co-trimoxazole. J. Chemother., 1994, 6, 3-11.

5. Экспертное заключение Института ветеринарной медицины УААН, №211 от 26.06.2009.

Размещено на Allbest.ru