Разработка новых антиагрегационных гетеромерных пептидов с имидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c’]дифуроксановым фрагментом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Разработка новых антиагрегационных гетеромерных пептидов с имидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксановым фрагментом

Алексеев Алексей Анатольевич, Брылев Максим Игоревич, Королев Вячеслав Леонидович, Лоторев Дмитрий Сергеевич, Зайцева Наталья Ивановна, Павлова Людмила Анатольевна, Лаборатория биологически активных соединений НИИ фармации. Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова; Лизунов Антон Юрьевич, Кафедра высшей математики. Московский физико-технический институт; Ившин Виктор Павлович ГБОУ ВПО Марийский государственный университет; Домашева Ольга Юрьевна Курский государственный университет

Аннотация

С применением программы Алгокомб выполнено математическое моделирование гетеромерных пептидов, включающих имидазо[4,5-e]бензо [1,2-c;3,4-c']дифуроксановый фрагмент и подтверждена эффективность их связывания с GP IIb/IIIa-рецепторами тромбоцитов. Сгенерированные соединения были синтезированы в условиях автоматического пептидного синтезатора Applied Biosys-tems 433А с использованием Fmoc-стратегии. Оценка антиагрегационной активности смоделированных гетеро-мерных пептидов показала наличие доззависимого ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Ключевые слова: GPIIb/IIIa рецепторы тромбоцитов, ингибирование агрегации тромбоцитов, компьютерное моделирование, имидазо[4,5-e]бензо [1,2-c;3,4-c']дифуроксаны, гетеромерные пептиды.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности населения в России [7]. Основное место в этой группе заболеваний имеет артериальная недостаточность сердца и мозга, причиной которой является тромбоз сосудов.

Большинство современных подходов к разработке лекарственных средств включают в себя компьютерное моделирование. Одной из задач, решаемых с помощью компьютерного моделирования, является поиск веществ, связывающихся с заданным белком-мишенью. Оценка связывания используется для решения важной задачи моделирования взаимодействия белок/ лиганд - виртуального скрининга, то есть поиска с помощью расчетов веществ, образующих прочный комплекс с белком-мишенью, среди большого массива химических соединений.

Известно, что агрегация тромбоцитов происходит за счет связывания фибриногена с GPIIb/IIIa (интегрин бIIb/в3) рецепторами [4, 9]. Ингибиторы IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов являются мощными антитромбоцитарными препаратами [1, 3], так как они блокируют образование мостиков между соседними активированными тромбоцитами. Антагонисты GPIIb/IIIa рецепторов тромбоцитов представлены разными классами химических соединений, однако, существенный интерес среди антиагрегантов представляют антагонисты GPIIb/IIIa рецепторов, имеющие пептидную природу.

Известно также, что в результате взаимодействия оксида азота (NO) с тромбоцитами и лейкоцитами снижается их агрегация и адгезия на стенках кровеносных сосудов, что приводит к ингибированию процессов тромбообразования [5]. Один из классов гетероциклических соединений, производные которых являются донорами оксида азота - это фуроксаны. Фуроксаны рассматриваются как пролекарства, реализующие свою биологическую активность через рГЦ - цГМФ - путь [6].

Целью настоящей работы явилось получение новых химических соединений (гетеро-мерных пептидов), сочетающих пептидные фрагменты (ингибиторы IIb/IIIa-рецепторов тром-боцитов) с фрагментом имидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксана (экзогенного донора ок-сида азота) и оценка их антитромбоцитарной активности. Ранее такие исследования не проводились.

гетеромерный пептид тромбоцит

1. Экспериментальная часть

Моделирование взаимодействия белка интегрин бIIb/в3 с гетеромерными пептидными лигандами проводилось с помощью программного комплекса Алгокомб. Пептиды были синтезированы на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433А с использованием стратегии FastMoc 0.25.

Строение синтезированных соединений подтверждали методами хроматомасс-, ЯМР ¹Н-спект-роскопии (в том числе с привлечением двумерных методик ¹Н/¹Н-спектров COSY). Хромато-массспектрометрический анализ проводили на приборе Waters MSD SQD-ESI с УФ- и масс-спектрометри-ческими детекторами. Спектры ЯМР регистрировали на приборе Bruсker Avance 600 mhz.

Оценку специфической активности антиагрегационного действия соединений проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров. Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметрического метода Борна (Born, 1962) с использованием аденозиндифосфата (АДФ) в качестве индуктора агрегации тромбоцитов. Для проведения исследования применяли двухканальный лазерный анализатор агрегации тромбоцитов /счетчик 230LA-2 (НПФ Биола).

2. Результаты и их обсуждение

1. Компьютерное моделирование гетеромерных пептидных ингибиторов агрегации тромбоцитов

С помощью программы «Алгокомб» [8] нами было выполнено компьютерное моделирование для гетеромерных пептидов с имидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксановым фраг-ментом на N-конце. Расчет оценки связывания с белком интегрин бIIb/в3 проводился для соединений вида Fur-А-В-C-Asp-D, где «Fur» - имидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксан; «A», «B», «С», «D» - L-аминокислотные остатки, структура которых варьировалась в процессе моделирования; в качестве аминокислоты «С» рассматривались глицин или аланин. Всего сгенерировано 48000 молекул.

Для докинга из базы данных PDB был выбран комплекс белка интегрин бIIb/в3 с идентификатором 2vdp. Ранее мы проводили расчет оценки связывания и докинг пептидов, пост-роенных из стандартных аминокислот, с таким же комплексом белка интегрин бIIb/в3.

Докинг начинали с правильного расположения кислотного фрагмента гетеромерного пептида для учета наличия ионной связи лиганда с ионом магния в активном сайте. Также в процессе докинга учитывали наличие двух молекул воды в активном сайте белка. Молекулы воды образуют водородные связи с С-концевым остатком и с кислородом третьего с С-конца остатка нативного лиганда.

2. Синтез пептида с вероятной антиагрегационной активностью и анализ структуры и чистоты соединения

Лучшие расчетные соединения были получены с использованием Fmoc-стратегии на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433А. Общая схема синтеза гетеромерных пептидов представлена на рис. 1.

Стратегия FastMoc 0.25 подразумевает последовательное присоединение остатков амии-нокислот к нерастворимой полимерной подложке. В качестве активатора первой аминокис-лоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступал дициклогексилкарбодиимид. Реакция протекала в присутствии 4-диметиламинопиридина, который играл роль катализатора процесса.

В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступал 1-гидроксибензотриазол в диметилформамиде.

По окончании синтеза проводили снятие пептида с твердой подложки и удаляли защитные группы боковых цепей, обрабатывая смолу 90%-ой трифторуксусной кислотой (ТФУ). Далее пептид из смеси высаживали диэтиловым эфиром и лиофилизировали.

Рис. 1. Схема синтеза гетеромерных пептидов, где R = радикалы аминокислот, Pr. group (protected group) = защитные группы аминокислот

Очистку пептидов осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматогрофа PuriFlash 450 (InterChim).

3. Определение специфической активности соединения

Оценку специфической активности антиагрегационного действия соединений проводили in vitro с использованием турбидиметрического метода Борна (Born, 1962) с использованием аденозиндифосфата (АДФ) в качестве индуктора агре-гации тромбоцитов [2]. Структуры соединений и полумаксимальное ингибирование для гетеромерных пептидов представлены в табл. 1.

Выявлено, что наиболее активным ингибитором среди гетеромерных соединений оказалось соедине-ние Fur-Lys-His-Ala-Asp-Asp (2), что хорошо соответствует результатам прогноза выполненного математического моделирования.

Табл. 1. Структуры и полумаксимальное ингибирование исследуемых соединений

Полумаксимальное ингибирование (IC₅₀) достигалось при концентрации соединения равной 1.52 мкМ (табл. 2, рис. 2).

Рис. 2. Зависимость агрегации тромбоцитов от концентрации Fur-Lys-His-Ala-Asp-Asp (2)

Табл. 2. Результаты исследования специфической антиагрегационной активности соединения Fur-Lys-His-Ala-Asp-Asp (2) in vitro

Выводы

1. С применением программного комплекса Алгокомб выполнено математическое моделирование молекул гетеромерных пептидов - антагонистов GPIIb/IIIa рецепторов тромбоцитов.

2. Синтез смоделированных соединений выполнен твердофазным способом на автоматическом пептидном синтезаторе по стратегии FastMoc 0.25. Очистка произведена на препаративном хроматографе. Строение синтезированных соединений подтвержден методами хромато-масс-, ЯМР ¹Н спектроскопии (в том числе с привлечением двумерных методик ¹Н/¹Н спектров COSY).

3. Выполнена оценка специфичности действия синтезированных соединений in vitro на крови здоровых доноров и показано доз-зависимое снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Выявлено, что наиболее активным ингибитором среди гетеромерных соединений оказалось соединение Fur-Lys-His-Ala-Asp-Asp (IC₅₀ 1.52 мкМ), что хорошо соответствует результатам прогноза выполненного математического моделирования.

Литература

1. Алексеев А.А., Брылев М.И., Королев В.Л., Лоторев Д.С., Лизунов А.Ю., Батуев Е.А. Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов. Ч. 1. Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов: математическое моделирование, синтез и оценка специфической активности новых соединений в условиях in vitro. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.32. №11. С.96-100.

2. G.V. Born. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 1962. Vol.194. P.927-929.

3. J.B. Bussel, T.J. Kunicki, A.D. Michelson. Platelets: new understanding of platelet glycoproteins and their role in disease. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program). 2000. P.222-240.

4. B.S. Coller. Blockade of platelet GP IIb/IIIa receptors as an antithrombotic strategy. Circulation. 1995. No.9. P.2373-2380.

5. C. Dessy, O. Ferron. Pathophysiological Roles of Nitric Oxide: In the Heart and the Coronary Vasculature. Current Medical Chemistry - Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 2004. Vol.3. P.207-216.

6. M.K. Feelisch Schonafinger, E. Noack. Thiol-mediated generation of nitric oxide accounts for vasodilator action of furoxan. Biochem. Pharmacol. 1992. Vol.44. No.6. P.1149-1157.

7. Global atlas on cardiovascular disease prevention and control. Geneva: World Health Organization. 2011. P.164.

8. V. Ramensky, A. Sobol, N. Zaitseva, A. Rubinov, V. Zosimov. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results. Proteins. 2007. Vol.69(2). P.349-573.

9. E.N. Voronina, M.L. Filipenko, D.S. Sergeyevichev, I.V. Pikalov. Platelet membrane glycoprotein receptors: functions and polymorphism. Bulletin of Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine. 2006. Vol.10. No.3. P.553-564.

Размещено на Allbest.ru