Спектрофотометрия в анализе двух видов подснежника (Galanthus L.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Спектрофотометрия в анализе двух видов подснежника (Galanthus L.)

Введение

В последнее время в нашей стране и за рубежом наблюдается растущий интерес по отношению к гомеопатическому методу лечения, а также значительное повышение объемов регистрации новых гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС). Подобные тенденции привели к появлению нового раздела в отечественной фармации - гомеопатической фармации, к объектам исследования которого относятся ГомЛС, используемые в здравоохранении согласно принципам гомеопатии. Основными приоритетными направлениями гомеопатической фармации являются: формирование и совершенствование нормативной документальной базы, которая регламентирует производство и контроль качества ГомЛС, увеличение ассортимента отечественных ГомЛС, а также разработка и совершенствование современных методов анализа, контроля качества и стандартизации [1,2].

Обеспечение качества ГомЛС в значительной степени зависит от применения стандартных гомеопатических субстанций, изготовленных согласно правилам GMP. Настойки матричные гомеопатические (НГМ) - исходное сырьё для большинства ГомЛС. НГМ представляют собой жидкие водно-спиртовые извлечения из сырья растительного (или животного) происхождения. Чаще всего НГМ получают методом мацерации (возможна также перколяция). Контроль качества НГМ заключается в определении биологически активных соединений (БАС), определении подлинности, а также других показателей, которые определены частной нормативной документацией [3].

Наши исследования проводились на кафедре фармакогнозии фармацевтического факультета и НИИ Фармации ПМГМУ им. И.М. Сеченова, на базе которых целенаправленно разрабатывается нормативная документация по стандартизации гомеопатическим матричных настоек и препаратов на протяжении последних десятилетий.

Гомеопатические препараты подснежников нашли широкое применение за рубежом при лечении головных болей, миокaрдите, заболеваниях сердечно-сосудистой системы [4]. Для производства НГМ используют сырьё подснежника белоснежного (Galanthus nivalis L.) [5], в нашей стране разрешён также подснежник Воронова (Galanthus woronowii Losinsk) [6]. Общий вид производящих растений представлен на рис. 1.

Актуальность данного исследования обусловлена, прежде всего, отсутствием в отечественной гомеопатической фармации методов стандартизации НГМ подснежников, получаемых из свежих цветущих растений подснежника Воронова и подснежника белоснежного, семейства Амариллисовые - Amaryllidaceae J.St.-Hil.) [7]. На основе анализа научно-исследовательских работ можно предположить, что данный вопрос остаётся недостаточно изученным. В частности, не указан метод приготовления НГМ подснежников, не определены качественные реакции на присутствие алкалоидов и флавоноидов (и других групп БАС) в НГМ, а также отсутствует фармакопейные статьи на гомеопатическое лекарственное растительное сырьё (ГомЛРС) НГМ подснежника Воронова и подснежника белоснежного.

Метод спектрофотомерии наиболее часто применяется в фармакогностической практике при анализе ЛРС и препаратов на его основе, когда требуется исследование суммы БАС. Следует сказать, что спектрофотометрический анализ достаточно прост в проведении, точен и экономически малозатратный, что обусловливает его успешное применение в целях стандартизации [8]. Он применим для анализа целого ряда соединений, обладающих хромофорными группировками (флавоноидов, алкалоидов и других соединений).

Флавоноидные соединения, содержащиеся в растительных и фармацевтических объектах, представлены в основном смесями множества гликозидов, которые относятся к различным классам полифенолов, что значительно затрудняет подбор методики их определения и требует проведения дополнительных системных исследований химического состава. До сих пор не была проведена подробная спектрофотометрическая характеристика полифенольных соединений, встречающихся в подснежниках. Тем не менее, в настоящей работе мы постарались учесть все нюансы, которые могут возникнуть при анализе таких сложных многокомпонентных систем, которыми являются НГМ подснежников [9].

Экспериментальная часть

Объектами исследования служили образцы подснежника Воронова (Galanthus woronowii Losinsk) и подснежника белоснежного (Galanthus nivalis L.) заготовленные в марте 2015 г. в Москве на территории Ботанического сада Первого МГМУ им. Сеченова в фазе цветения.

Фармакопейные НГМ получали согласно методу 3а ОФС «Настойки гомеопатические матричные и жидкие разведения» [10] из целых цветущих растений (Planta tota). Выбор этого метода основан, прежде всего, из-за того, что в растениях рода Galanthus L. содержится значительное количество слизи. Для аналитических целей, также была приготовлена серия настоек на основе подземных органов (луковицы с корнями), без надземной части. Полученные настойки из целых растений представляли собой прозрачные водно-спиртовые извлечения желто-коричневого цвета с зеленоватым оттенком и специфическим запахом. НГМ полученные из подземных органов - прозрачные с коричневатым оттенком жидкости, обладающие также специфическим запахом.

С полученными НГМ проводили качественные реакции на основные группы БАС, включенные в ГФ ХI издания [11], [12], а также широко применяемые в научно-исследовательских работах.

Для определения алкалоидов применялась прямая спектрофотометрия - для НГМ, полученных из подземных органов; экстракционно-спектрофотометрический метод - для НГМ, полученных из целых растений. Схема экстрационно-спектрофотометрического метода представлена ниже:

Ш Получение комплекса «тропеолин 000-II-алкалоид». К аликвоте НГМ добавляют 1% раствор соляной кислоты, перемешивают и помещают в делительную воронку, добавляют 1% раствор тропеолина 000-II. Строение ионного ассоциата галантамина и тропеолина 000-II может быть представлено следующим образом:

Ш Экстракция полученного комплекса в органическую фазу (трехкратная экстракция хлороформом) и измерение оптической плотности, полученного хлороформного извлечения (окрашенного в оранжевый цвет).

Для анализа флавоноидов проводили кислотный гидролиз флавоноидных гликозидов в НГМ. Для этого 5 мл НГМ подснежника Воронова и подснежника белоснежного упаривали на водяной бане, остаток высушивали в сушильном шкафу при 105 °С в течение 10 минут, затем растворяли в 15 мл 10% серной кислоты. Гидролиз проводили в колбе со шлифом, объёмом 100 мл, подсоединенной к обратному холодильнику, при нагревании на кипящей водяной бане в течение 2.5 часов. В данных условиях происходит гидролиз преимущественно 3-О-гликозидов, поскольку 7-О-гликозиды более устойчивы и подвергаются гидролизу в более жестких условиях. Далее колбу охлаждали до комнатной температуры под струёй холодной воды, содержимое фильтровали через бумажный фильтр. Осадок, оставшийся на фильтре, промывали водой очищенной и растворяли в 25 мл горячего 96% этанола с добавлением 3 мл 2% раствора алюминия хлорида, полученный раствор подвергали спектрофотометрическому анализу.

Исследование электронных спектров НГМ проводили на приборе «Cary 50 Scan» фирмы Agilent Technologies (ранее - Varian, США) с последующей компьютерной обработкой результатов в программе «Cary WinUV Analysis Pack ver. 3.1» для «Windows». В качестве стандартов в работе использовались: стандартный образец кверцетина, CAS №117-39-5 (ООО «Фитопанацея», Россия, серия 130213, чистота ? 99.5%), стандартные образцы галантамина CAS №357-70-0 и ликорина CAS №476-28-8 (Nanjing Spring & Autumn Biological Engineering Co., Ltd, Jiang Su, China, HPLC ? 98%).

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных реакций в НГМ двух видов подснежников нами было подтверждено наличие двух интересующих групп БАС - флавоноидов и алкалоидов в НГМ, изготовленных из целых растений. Поскольку биосинтез флавоноидов и других соединений полифенольной природы происходит в надземной части растений, в настойках, полученных из подземных органов, данная группа БАС отсутствовала. Результаты качественных реакций приведены в табл. 1.

В ходе анализа электронных спектров стандартных образцов галантамина, ликорина и НГМ подснежника Воронова и белоснежного (рис. 2), полученных из подземных органов было установлено наличие двух максимумов примерно одинаковой средней ширины при 210 нм и 285 нм.

Табл. 1. Результаты качественных реакций на основные группы БАС в НГМ подснежника Воронова и подснежника белоснежного

Для первого наиболее высокого максимума при 210±3 нм (2б), характерен гладкий левый склон и небольшой перегиб на правом склоне, второй максимум при 285±3 нм значительно меньше первого по высоте. В целом максимумы поглощения двух соединений с приведенной ниже структурой совпадают:

Можно предположить, что зарегистрированные формы абсорбционных спектральных кривых галантамина и ликорина, относящихся к производным изохинолина, являются следствием наличия в их молекулах циклических хромофоров, которые связаны с группой =N-C.

Электронные спектры поглощения НГМ подснежника Воронова и подснежника белоснежного, полученные из подземных органов, имеют аналогичные максимумы поглощения, что и анализируемые стандартные образцы (рис. 2в). Спектры поглощения НГМ, полученных из целых растений, в области длин волн имеют множество максимумов поглощения в области от 200-320 нм, обусловленных наличием целого ряда полифенольных соединений и других примесей. Поглощения в коротковолновой области спектра сложно интерпретировать из-за наличия большого числа максимумов поглощения, перекрывающихся между собой в значительной степени. Это затрудняет и делает невозможным анализ алкалоидов, поэтому нами была использована экстрационно-спектрофотометрическая методика, описанная в нормативной документации и научной литературе. Образование комплекса галантамина с тропеолином 000-II используется при количественном определении галантамина в субстанции галантамина гидробромида [13] и в фармакопейной статье на сырьё унгернии Виктора [14]. Данная методика позволяет анали-зировать НГМ подснежников, полученных из целых растений, поскольку избирательная экстракция комплекса «тропеолин-алкалоид» позволяет избавиться от нежелательных примесей. Спектры галантамина, ликорина, НГМ подснежника белоснежного и подснежника Воронова представлены на рис. 3а. Следует отметить, что поскольку указанный максимум поглощения при 480±3 нм характерен, как для галантамина, так и для ликорина, то в НГМ представлена сумма указанных алкалоидов, что следует учитывать при стандартизации сырья и НГМ. Возможно введение суммарного показателя содержания алкалоидов в пересчете на галантамин или ликорин.

Учитывая тот факт, что в НГМ, полученных из целых растений, присутствует множество полифенольных соединений, нами была предпринята попытка охарактеризовать некоторые наиболее интерпретируемые максимумы поглощения. Один из таких максимумов наблюдается при 330±5 нм, также наблюдается небольшой перегиб при 400 нм (пик не фиксируется). Электронные абсорбционные спектры НГМ подснежника Воронова и подснежника белоснежного представлены на рис. 3б. Необходимо особо отметить, что спектры, приведённые на рис. 3б, могут служить характеристикой подлинности официнальных НГМ подснежников и их разведений.

На основании полученных промежуточных экспериментальных и литературных данных нами был выбран кверцетин в качестве стандартного образца, поскольку при гидролизе НГМ подснежников и последующей обработке 2% раствором алюминия хлорида наблюдается максимум поглощения при 430±5 нм. Очевидно, что при гидролизе гликозиды кверцетина, преобладающие в НГМ подснежника Воронова и белоснежного, разрушаются, высвобождая свободный кверцетин. Кверцетин с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида образует окрашенное соединение, имеющее желто-зеленую флуоресценцию при длине волны около 430 нм (батохромный сдвиг).

Структурные формулы кверцетина и его наиболее часто встречающихся гликозидов представлены ниже:

Выводы

1. Проведён качественный анализ основных групп биологически активных веществ настоек матричных гомеопатических подснежника Воронова и подснежника белоснежного, определяемых спектрофотометрическим методом: алкалоидов и флавоноидов.

2. На основе изучения спектральных характеристик флавоноидов и алкалоидов настоек гомеопатических матричных подснежника Воронова и подснежника белоснежного обоснована целесообразность использования при разработке методик анализа государственных стандартных образцов галантамина, ликорина, кверцетина и его гликозидов (гиперозида и др.).

3. Подтверждена возможность применения экстракционно-фотометрической методики определения галантамина и ликорина при стандартизации гомеопатического лекарственного растительного сырья и настоек матричных гомеопатических подснежников Воронова и белоснежного.

4. Подлинность настоек матричных гомеопатических подснежников Воронова и белоснежного может быть подтверждена электронными спектрами поглощения с максимумом при 330±5 нм, также перегибом при 400 нм.

Литература

подснежник спектр поглощение лекарственный

1. Самылина И.А. и др. Научные подходы к разработке общих фармакопейных статей на гомеопатические лекарственные формы. Фармация. 2010. №3. С.53-56.

2. Ших Е.В. и др. О гомеопатических лекарственных средствах, разрешенных для медицинского применения в Российской Федерации. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2014. №4. С.50-54.

3. Копытько Я.Ф., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Регламентация качества настоек гомеопатических матричных и сырья для их изготовления в России и за рубежом. Традиционная медицина. 2010. №23. С.53-56.

4. Боков Д.О., Самылина И.А. Современные аспекты применения в гомеопатии некоторых лекарственных растений (сем. Amaryllidaceae, Trilliaceae) средней полосы России при лечении неврологических расстройств. Гомеопатический ежегодник. Сборник материалов XXV Московс-кой международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в совре-менной медицине» (23-24 янв. 2015 г). М.: Московский гомеопатический центр. 2015. С.180-183.

5. Homoepathic Pharmacopoeia of the United States. Revision Service. T. 1: December 1988 - December 1990; T. 2: December 1989 - June 1990.

6. Приказ МЗ МП РФ № 335 от 29.11.95 «Об использовании метода гомеопатии в практическом здравоохранении». URL: http://www.andriana.ru/article3.html (дата обращения 19.03.2015).

7. Артюшенко З.Т. Амариллисовые СССР. Морфология, систематика и использование. АН СССР. Ботан. ин-т им. В.Л. Комарова. Л.: Наука. 1970. C.41-83.

8. Колдаев В.М. Абсорбционная оптическая спектрофотометрия в фармации. Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. №1(55). С.19-23.

9. D.O. Bokov, I.A. Samylina. Homeopathic remedies of snowdrops: key aspects for standardization procedures. Proceedings of the V International scientific-practical conference “Fundamental science and technology - promising developments” (24-25 February 2015). Pharmaceutical sciences. North Charleston, USA. 2015. Vol.2. P.184-186.

10. ОФС «Настойки гомеопатические матричные». Tincturae homoeopathicae maternae. Министерство здравоохранения РФ [Офиц. сайт]. URL: http://www.rosminzdrav.ru (дата обращения: 20.03.2015).

11. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Общие методы анализа. М.: Медицина. 1987. Bып.1. 336с.

12. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. М.: Медицина. 1989. Вып.2. 400с.

13. Государственная Фармакопея СССР X издания. М.: Медицина. 1968. 1079с.

14. ФС 42-1520-80 «Листья унгернии Виктора» («Folia Ungerniae victoris»). Лекарственные растения Государственной фармакопеи. Фармакогнозия (под ред. И.А. Самылиной, В.А. Северцева). М.: «АНМИ». 2003. С.456-458.

Размещено на Allbest.ru