Изучение токсичности некоторых производных бензимидазола

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение токсичности некоторых производных бензимидазола

Введение

бензимидазол фармакологический токсичность

Среди многочисленных фармакологических препаратов, способных повысить устойчивость организма к различным заболеваниям, обнаружены соединения, содержащие фрагмент бензимидазола. Одним из них является 2-бензилбензимидазол (дибазол) и используемый как иммуностимулятор, ускоряющий синтез интерферонов [1]. В связи с ростом грибковых заболеваний и устойчивости возбудителей грибковых инфекций ко многим имеющимся лекарственным препаратам осуществлен синтез фенольных производных бензимидазола, в том числе дибазола, и их гликозидов [2]. Из литературных данных известно о способности фенольных производных бензимидазола взаимодействовать с ферментами, участвующими в метаболизме фитогормонов [3]. Обнаружено антифугальное действие 4-(2-метил-1Н-бензими-дазол-1-илметил)фенола на показатели роста грибов Aspergillus niger и Cladosporium herba-rum. [4].

Необходимым условием применения химических соединений в фармакологии является отсутствие у них токсичности.

В качестве объектов исследования были выбраны производные бензимидазола, использованные ранее в качестве структурных фрагментов в синтезе более сложных соединений и изученных в биологическом эксперименте.

Целью данного исследования является синтез и изучение токсичности бензимидазола (I), 2-метилбензимидазола (II), 2-бензилбензимидазола (III) и 1,2-дибензилбензимидазола (IV).

Экспериментальная часть

Объектом исследования служили инфузории Paramecium caudatum и семена лука Allium cepa. Исследовали токсичность водных растворов I-IV в концентрациях: 0.000001; 0.00001; 0.0001; 0.001; 0.01; 0.1; 1 мг/мл. Токсичность оценивали по количеству погибших инфузорий и способности ингибировать прорастание семян [5].

Эксперимент был проведен в три этапа: изучение токсичности I-IV для Paramecium caudatum и Allium cepa; и изучение мутагенности I-IV для Allium cepa.

При определении токсичности исследуемых веществ для инфузорий в чашку Петри отбирали определенный объем культуры, в которую затем вносили раствор исследуемого вещества для получения необходимой концентрации. С помощью микропипетки из культуры отбирали клетки и по 10 штук вносили в лунки планшета для исследования. Объем среды в лунке доводили до 100 мкл путем добавления чистого раствора исследуемого вещества рабочей концентрации. Затем через 1 и 3 часа проводили подсчет погибших клеток. Каждый эксперимент проводили в трех повторах, не менее чем по 100 клеток в каждом. Токсичность бензимидазола и его производных также оценили по их способности ингибировать прорастание семян репчатого лука. Для этого в чашках Петри проращивали семена Allium cepa в течение 5 дней в термостате в растворах исследуемых соединений. Определяли всхожесть для 90 семян в контроле и эксперименте. Микроскопические препараты для цитогенетических исследований готовили по стандартной методике окраски ацетокармином.

Изучение токсичности I-IV для Paramecium caudatum

Обнаружили, что токсический эффект исследуемых веществ носит дозозависимый характер, и смертность инфузорий возрастает с ростом концентрации соединений. В концентрации 0.000001 мг/мл вещества не оказывают влияния на состояние инфузорий. При концентрации 0.00001 мг/мл исследуемые вещества проявляют слабый токсический эффект. С повышением концентрации веществ до 0.0001 мг/мл токсичность I-III изменилась незначительно, в то время как процент смертности инфузорий в этой же концентрации для IV резко возрос. В концентрациях 0.01 мг/мл 0.1 мг/мл токсичность III и IV статистически значимо токсичнее I и II. В концентрации 1 мг/мл все исследуемые соединения вызывают 100%-ную гибель инфузорий.

Результаты исследования токсичности I-IV при времени экспозиции 1 и 3 ч представлены на рис. 1 и 2.

Рис. 1. Токсичность I-IV при экспозиции 1 час

Рис. 2. Токсичность I-IV при экспозиции 3 часа

Из полученных результатов можно сделать вывод, что изменение времени экспозиции влияет на диапазон токсичности исследуемых соединений, так при экспозиции 1 час растворы соединений в концентрации 0.000001 мг/мл нетоксичны, а при 3-х часовой экспозиции при этих концентрациях наблюдается гибель инфузорий. Однако при исследованных экспозициях тенденция более высокой токсичности IV относительно других веществ сохраняется, но при данной схеме эксперимента не во всех концентрациях она носит статистически значимый характер. Большое различие в токсичности I-IV при некоторых равных концентрациях указывает на разную эффективность их влияния на биохимические процессы в клетках инфузорий. Возможно, это свидетельствует о более эффективной защите от токсического действия бензимидазола. Известно, что бензимидазол в норме встречается в клетках животных, так как он может являться продуктом разложения N-рибозил-5,6-диметилбензимидазола, входящего в состав витамина B₁₂. Отсутствие разницы токсичного эффекта I-IV при высоких концентрациях можно объяснить тем, что физиологические механизмы защиты клетки в этих условиях являются неэффективными. Можно сделать вывод, что присутствие заместителя во втором положении бензимидазола повышает его токсичность для инфузорий, а замена метильной группы на более объемную бензильную значительно повышает его токсичность.

Изучение токсичности I-IV для Allium cepa

Токсичность соединений для растений складывается из ряда параметров, в том числе, способности ингибировать прорастание семян. Для того чтобы выбрать минимальную токсичную дозу, воздействовали растворами соединений на клетки эпителия лука.

Минимальную плазмолитическую активность проявили растворы I-IV 0.001 мг/мл. Все соединения в этой концентрации вызывали плазмолиз только у 1% из 100 проанализированных клеток, причем сам плазмолиз был весьма незначительным, то есть уголковым. Результаты изучения токсичности водных растворов I-IV в концентрации 0.001 мг/мл представлены на рис. 3.

Все вещества в той или иной степени ингибировали прорастание семян, слабо различаясь по токсичности. Самая высокая токсичность выявлена для I. Cлабую токсичность проявили II-IV.

Рис. 3. Способность I-IV подавлять прорастание семян Allium cepa

Изучение мутагенности I-IV для Allium cepa

Известно, что соединения, способные воздействовать на митотическую активность, часто проявляют мутагенную активность. С помощью метода Allium-теста мы протестировали соединения на мутагенность. Результаты анателофазного анализа мутагенности I-IV представлены на рис. 4.

Рис. 4. Мутагенность I-IV для семян Allium cepa

Все исследуемые соединения вызывали все типы хромосомных патологий («мосты» - простые и двойные, «отставания», «обломки»). Это указывает на то, что I-IV способны вмешиваться в метаболизм пуринов, что приводит к росту хромосомных аномалий и, как следствие этого, к остановке клеточного деления. Мутагенность убывает в ряду: IV > III > > II > I.

Известно, что вмешательство в метаболизм пуринов приводит к развитию мутагенного ответа [6]. Рассматривая бензимидазол как аналог пурина, можно допустить возможность его взаимодействия с активным центром рецепторов цитокинина у растений [7], в то же время при замене пуринового фрагмента на бензимидазольный цитокининовая активность сохра-няется [6]. Так как некоторые производные бензимидазола способны взаимодействовать с ДНК и неспецифически ингибировать ДНК-гиразу и ДНК-полимеразу у прокариот [6, 8], можно предположить, что рассмотренные соединения действуют подобным образом. Кроме того возможно их вмешательство в синтез тубулина - белка основного положения ветвей веретена деления. Это описано в работах по изучению влияния производных бензимидазола на синтез тубулина у некоторых паразитов [9]. На этом основании можно предположить как общий механизм мутагенного действия для всех 2-замещенных производных бензимидазола, так и специфический.

Рассчитанные физико-химические параметры изученных соединений, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что токсичность и мутагенность I-IV коррелируют с лиофильностью и объемом их молекул. Вероятно, что возрастание липофильности от I к IV приводит к соответствующему увеличению степени их мутагенности, так как большее количество молекул I-IV может связываться с ДНК по механизму интеркаляции.

Таблица. Физико-химические параметры изученных соединений,рассчитанные с использованием программ Gaussian 98 и ALOGPS 2.1

Выводы

1. Токсичность и мутагенность бензимидазола, 2-метилбензимидазола, 2-бензилбензимидазола и 1,2-дибензилбензимидазола для Paramecium caudatum и Allium cepa носят дозозависимый характер. Рассчитанные физико-химические параметры изученных соединений свидетельствуют о том, что токсичность и мутагенность коррелируют с липофильностью и объемом их молекул.

2. Возрастание липофильности в ряду бензимидазол - 2-метилбензимидазол - 2_бензилбен-зимидазол - 1,2-дибензилбензимидазол способствует прохождению этих соединений через биомембраны и возрастанию сродства к рецепторным белкам мембраны.

3. Вероятно, что возрастание объема молекул в ряду бензимидазол - 2_метилбензимидазол - 2_бензилбензимидазол - 1,2-дибензилбензимидазол приводит к соответствующему увеличению степени их мутагенности, так как большее количество этих молекул может связываться с ДНК по механизму интеркаляции.

Литература

1. Розин М.А. Производные бензимидазола и неспецифическая сопротивляемость. Производные бензимидазола и клеточная резистентность. Л.: Наука. 1972. С.5-32.

2. Мещерякова Н.В., Бобровский С.И., Белоусова З.П., Зарубин Ю.П., Пурыгин П.П. Синтез производных дибазола. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №5. С.11-15.

3. Белоусова З.П., Селезнева Е.С., Моисеева Л.М. Генотоксичность синтетических фенольных производных бензимидазола. Вестник Оренбургского государственного университета №5 (111). 2010. С.111-114.

4. Атлашова Е.Ю., Белоусова З.П., Кленова Н.А., Овчинникова Т.А. Действие 4-(2-метил-1Н-бензмидазол-1-ил-метил)фенола на показатели роста грибов видов Aspergillus niger и Cladosporium herbarum. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010. №9. С.33-36.

5. Кадыров Ч.Ш. Химия и пестицидная активность бензимидазолов. Регуляторы роста растений и гербициды. Ташкент: Фан. 1978. С.65-123.

6. Умаров А.А. Бензимидазолы, их регуляторные свойства и функции. Ташкент: Фан. 1990. 132с.

7. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция биологических процессов у растений на уровне РНК и белка. М.: Наука. 1982. С.14-84.

8. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Куроедов В.А. Влияние цитокинина на синтез РНК и на активность связанной с хроматином РНК- полимеразы в срезанных листьях ячменя. Физиология растений. М.: Наука. 1978. Т.25. Вып.6. С.199-205.

9. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина. 1988. Т.1. 967с.

Размещено на Allbest.ru