Роль эндоцитоза в защите полиморфноядерных лейкоцитов белком теплового шока БТШ70 от активации эндотоксинами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Роль эндоцитоза в защите полиморфноядерных лейкоцитов белком теплового шока БТШ70 от активации эндотоксинами

Юринская М.М.

Сусликов А.В.

Евгеньев М.Б.

Винокуров М.Г.

Эндотоксины (ЭТ) грамотрицательных энтеробактерий, поступая в кровяное русло, участвуют в патогенезе различных болезней, в числе которых сепсис (часто отягощенный эндотоксиновым шоком), атеросклероз, метаболический синдром, почечная недостаточность, ожирение, процессы нейродегенерации и другие [1, С. 687], [2, С. 233]. Эндотоксины вызывают сборку и активацию NOX2 в клеточной мембране ПМЯЛ. Основной механизм активации ПМЯЛ ЭТ включает перенос ЭТ из мицелл к рецептору CD14 и последующее образование гетеродимерного рецепторного комплекса с TLR4 и цитоплазматическими адаптерными белками. После этого активирующий сигнал передается по различным TLR4-зависимым внутриклеточным сигнальным путям в ядро клеток [3, С. 55]. Помимо TLR4-зависимого пути поступления, ЭТ проникает в клетки клатринзависимым эндоцитозом [4, С. 1].

Важную роль в различных патологиях в организме млекопитающих играет главный стрессовый высококонсервативный белок теплового шока Бтш70. Этот белок поддерживает (регулирует) клеточный гомеостаз, участвует в фолдинге, сборке и транслокации белков через мембраны [5, С. 379].

Мы установили, что индуцибельный Бтш70 при его внеклеточном применении эффективно защищает ПМЯЛ от активирующего действия эндотоксинов [6, С. 97], [7, С. 163]. Однако механизмы защиты ПМЯЛ белком Бтш70 были недостаточно исследованы. Ранее было выявлено, что конститутивный Hsc70 может взаимодействовать с клатрином - основным компонентом оболочки окаймлённых пузырьков, образующихся при рецепторном эндоцитозе, однако в опухолевых клетках Бтш70 поддерживает клатрин-независимый эндоцитоз [8, С. 2747]. Мы установили, что Бтш70, взаимодействуя с TLR4, может поступать в клетки (рецепторзависимый эндоцитоз) [9, С. 524].

Целью исследования было выяснение роли рецепторзависимого и клатринзависимого эндоцитоза в механизме защиты ПМЯЛ белком Бтш70 от активации ЭТ.

Материалы и методы

ПМЯЛ получали согласно [6, С. 96]. Чистота выделенных ПМЯЛ составляла 98-99% (определяли окрашиванием по Романовскому-Гимзе). Жизнеспособность ПМЯЛ определяли с использованием propidium iodide (Sigma-Aldrich) [9, С. 524]. Погибших клеток было не более 2-4%.

После выделения и определения жизнеспособности ПМЯЛ рассевали в 24-луночные планшеты (Sarstedt) с повышенной адгезией по 2,0•10⁶ клеток на лунку в 1 мл раствора Хенкса (HBSS) и оставляли на 2 часа в стандартных условиях культивирования (при 37° C и 5% CO₂), затем заменяли HBSS на культуральную среду RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) (CM), с 10%-ной термоинактивированной эмбриональной сывороткой телят, сертифицированной на содержание эндотоксина (HyClone, Logan, UT, USA), 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, вносили ингибиторы эндоцитоза и культивировали ПМЯЛ в течение 30 мин в стандартных условиях культивирования. После чего добавляли 1 мкг/мл Бтш70 (полученного согласно [6, С. 95]), инкубировали 10 мин и затем добавляли 100 нг/мл ЭТ (Sigma-Aldrich) и культивировали ПМЯЛ 12 ч в стандартных условиях культивирования.

Образование активных форм кислорода (ROS) в ПМЯЛ определяли с использованием нитросинего тетразолия (НСТ) [10, С. 119]. Специфичность генерации ROS подтверждали с помощью Diphenyleneiodonium chloride (DPI). По окончании культивирования к клеткам на 2 ч в стандартных условиях культивирования добавляли 0,1% НСТ. Далее образование ROS определяли согласно [10, С. 121]. Оптическую плотность контрольных ПМЯЛ принимали за 100%.

Для оценки специфичности ответа ПМЯЛ на ЭТ использовали специфический ингибитор TLR4-зависимого сигнального пути активации клеток - TAK-242 [11, С. 40]. В работе были использованы ингибиторы эндоцитоза: динасор (ингибитор клатринзависимого эндоцитоза) и метил-в-циклодекстрин (ингибитор образования липидных микродоменов) [12, С. 203].

Статистический анализ

Данные по анализу продукции ROS ПМЯЛ представлены как средние значения ± стандартное отклонение как минимум шести независимых экспериментов в четырех повторностях. Различия между группами анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа One Way ANOVA (тест Tukey's), *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005.

Результаты

Ранее мы установили, что защита ПМЯЛ от ЭТ-индуцированной продукции ROS экзогенным белком Бтш70 реализуется в течение 5-10 мин [6, С. 97]. Поэтому в данной работе мы инкубировали клетки с Бтш70 до добавления ЭТ в течение 10 мин. Полученные результаты показали (Рис. 1), что ЭТ вызывал значительное увеличение продукции ROS ПМЯЛ (650%) по сравнению с контролем (СМ). Ингибиторы DPI и TAK-242 снижали ЭТ-индуцированную продукцию ROS клетками, что подтверждает специфичность увеличения ЭТ-активированной продукции ROS NOX2 ПМЯЛ. Внеклеточный Бтш70, добавляемый к клеткам, значительно снижал ЭТ-индуцированную продукцию ROS ПМЯЛ (Рис. 1, “Бтш70+ЭТ” по сравнению с “ЭТ”).

В отсутствии ЭТ Бтш70 несколько увеличивал продукцию ROS клетками, что характеризует некоторое провоспалительное действие этого белка [6, С. 95], что проявляется в неполной защите клеток белком от действия ЭТ. Т.к. соотношение ЭТ/контроль = 6,5, а ЭТ/(Бтш70+ЭТ) = 3,25

Ранее было показано, что в механизме взаимодействия ЭТ с клетками важная роль принадлежит клатринзависимому эндоцитозу. Конститутивный Бтш70 может поступать в клетки с помощью клатринзависимого эндоцитоза [13, С. 2763], [14, С. 42]. Поэтому мы предположили, что используемый нами индуцибельный Бтш70 также может поступать в клетки с помощью клатрина.

Рис. 1. Влияние 1 мкг/мл Бтш70 на продукцию ROS ПМЯЛ, индуцированную 100 нг/мл ЭТ в присутствии и отсутствии 1 мкг/мл TAK-242, 10 мкМ DPI. СМ-контроль. Результаты представлены как M ± SD; n = 6 для каждой группы. Сравнивали ЭТ с каждой из остальных проб. ^***p < 0,005; сравнивали пробы Бтш70 с Бтш70+ЭТ ** p <0,05

Наши результаты показали, что динасор снижал продукцию ROS клетками в присутствии ЭТ (рис. 2, Dyn, а), а в присутствии Бтш70 и ЭТ повышал продукцию ROS (сравнение рис. 2, Dyn, в с рис. 2, CM, в). Кроме того, соотношение ЭТ/(Бтш70+ЭТ) в присутствии динасора уменьшается до величины, равной ~ 0,87 (по сравнению с рис. 2, СМ, в). Это свидетельствует об участии клатринзависимого пути поступления Бтш70 в клетки, т.к. ингибирование этого пути приводит к снижению защитного действия Бтш70.

Исследование влияния метил-в-циклодекстрина показало, что данный ингибитор снижает продукцию ROS клетками в присутствии ЭТ (рис. 2, а) и практически не влияет на продукцию ROS в присутствии Бтш70 (рис. 2, б). Анализ результатов при предварительном добавлении к клеткам Бтш70, а затем ЭТ (рис. 2, в) показал, что в пробе с ингибитором клатринзависимого эндоцитоза (рис. 2, Dyn, в) продукция ROS увеличивается по сравнению с пробой (рис. 2, СМ, в), а в пробе с метил-в-циклодекстрином (ингибитор рецепторзависимого эндоцитоза) - уменьшается (рис. 2, MbCD, в).

Рис. 2. Влияние ингибиторов эндоцитоза на продукцию ROS ПМЯЛ при действии ЭТ (100 нг/мл) и Бтш70 (1 мкг/мл). CM - культуральная среда; Dyn - 40 мкМ динасора; MbCD - 2,5 мМ метил-в-циклодекстрина. а - клетки + ЭТ, б - клетки + Бтш70, в - клетки + Бтш70 (10 мин) + ЭТ. Сравнивали все пробы с пробой ЭТ - ^***p <0,005. Сравнивали пробы между собой - * p <0,05, ** p <0,01

Увеличение продукции ROS в пробе (рис. 2, Dyn, в) свидетельствует о том, что в присутствии ингибитора снижается защитное действие Бтш70. Кроме того, в пробе (рис. 2, Dyn, в) уменьшается соотношение величин ROS.

Обсуждение

За последнее время было показано, что Бтш70 может выходить из клеток в кровь и специфически связываться Toll-подобными рецепторами TLR2 и TLR 4 на антигенпрезентативных клетках и оказывать иммуномодулирующее действие на другие клетки [1, С. 687], [15, С. 251]. Кроме TLR2 и TLR4, внеклеточный Бтш70 также может связываться с рецепторами TNFRSF5 суперсемейства TNFб-рецепторов [5, С. 379]. Ранее мы показали, что внеклеточный Бтш70 не оказывал существенного влияния на уровни мембранных TLR2 и TLR-4 клеток RAW264.7, а также уровни мРНК этих рецепторов [9, С. 524]. Как известно, TLR2, TLR4 и TNFRSF5 в клеточной мембране находятся в составе липидных микродоменов [13, С. 2763]. При разрушении липидных микродоменов функционирование таких рецепторов будет нарушено. Мы выявили, что метил-в-циклодекстрин значительно уменьшал образование ROS во всех трех пробах (рис. 2, а, б, в). При этом величина продукции ROS в пробах клеток с ЭТ (рис. 2, а) и Hsp+ЭТ (рис. 2, в) практически одинакова. Это может говорить о значительном ингибировании рецептор-зависимых сигнальных путей активации клеток под действием ЭТ и о снижении поступления Бтш70 в клетки. Кроме того, известно, что липидные микродомены нужны для сборки НАДФН-оксидазы [16, С. 1043] и действие метил-в-циклодекстрина значительно снижает работу этого фермента.

Установлено, что индуцибельный рекомбинантный Бтш70 при внеклеточном применении уменьшает образование ROS полиморфноядерными лейкоцитами, вызываемыми эндотоксинами. В данном исследовании выявлено, что в механизме защиты ПМЯЛ Бтш70 от активации клеток ЭТ участвуют клатринзависимый и рецепторзависимым путям эндоцитоза Бтш70.

Список литературы

эндотоксин белок тепловой шок

1. Munford S. Endotoxemia-menace, marker, or mistake? / R.S. Munford // J Leukoc Biol. - 2016. - Vol. 100. - № 4. - P. 687-698. doi: 10.1189/jlb.3RU0316-151R.

2. Wang Y.W. Mild endoplasmic reticulum stress ameliorates lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and cognitive impairment via regulation of microglial polarization. / Y.W. Wang, Q. Zhou, X. Zhang and others // Neuroinflammation. - 2017. - Vol. 14. - № 1. - P. 233-250. doi: 10.1186/s12974-017-1002-7.

3. Kim S.J. Dynamic lipopolysaccharide transfer cascade to TLR4/MD2 complex via LBP and CD14. / S.J. Kim, H.M. Kim // BMB Rep. - 2017. - Vol. 50. - № 2. - P. 55-57. doi: 5483/BMBRep.2017.50.2.011

4. Shim D.W. Anti-Inflammatory Action of an Antimicrobial Model Peptide That Suppresses the TRIF-DependentSignaling Pathway via Inhibition of Toll-Like Receptor 4 Endocytosis in Lipopolysaccharide-Stimulated Macrophages / D. W. Shim, K.H. Heo, Y.K. Kim and others // PLoS One. - 2015. - Vol. 10. - № 5. P. 1-13. doi: 1371/journal.pone.0126871.

5. Radons J. The human БТШ70 family of chaperones: where do we stand? / J. Radons // Cell Stress - 2016. - Vol. 21. - № 3. P. 379-404. doi: 10.1007/s12192-016-0676-6.

6. Rozhkova E. Exogenous mammalian extracellular БТШ70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels / Rozhkova, M. Yurinskaya, O. Zatsepina and others // Ann N Y Acad Sci. - 2010. - Vol. 1197. - P. 94-107. doi: 10.1111/j.1749-6632.2009.05375.x.

7. Yurinskaya M.M. Encapsulated Бтш70 decreases endotoxin-induced production of ROS and TNFб in humanphagocytes / M. Yurinskaya, O.Y. Kochetkova, L.I. Shabarchina and others // Cell Stress Chaperones. - 2017. - Vol. 22. - № 1. - P. 163-171. doi: 10.1007/s12192-016-0743-z. Epub 2016 Oct 26.

8. Nimmervoll B. Cell surface localised Бтш70 is a cancer specific regulator of clathrin-independent endocytosis / Nimmervoll, L.A. Chtcheglova, K. Juhasz and others // FEBS Lett. - 2015. - Vol. 589. - № 19. - Pt. B. - P. 2747-2753. doi: 10.1016/j.febslet.2015.07.037.

9. Yurinskaya M. The Fate of Exogenous Human БТШ70 Introduced into Animal Cells by Different Means / M. Yurinskaya, O.G. Zatsepina, M.G. Vinokurov and others // Curr Drug Deliv. - 2015. - Vol. 12. - № 5. - P. 524-32.

10. Wang X. Gomisin A inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in N9 microglia via blocking the NF-кB/MAPKs pathway / Wang, D. Hu, L. Zhang and others // Food Chem Toxicol. - 2014. - Vol. 63. -P. 119-127. doi: 10.1016/j.fct.2013.10.048.

11. Kawamoto T. TAK-242 selectively suppresses Toll-like receptor 4-signaling mediated by the intracellular domain / T. Kawamoto, M. Ii, T. Kitazaki and others // Eur J Pharmacol. - 2008. - Vol. 584. - № 1 - P. 40-48. doi: 10.1016/j.ejphar.2008.01.026.

12. Dutta D. Search for inhibitors of endocytosis: Intended specificity and unintended consequences / D. Dutta, J.G. Donaldson // Cell Logist. - 2012. - Vol. 2. - № 4. - P. 203-208. doi: 4161/cl.23967.

13. Cho H.J. Probing the effect of an inhibitor of an ATPase domain of Hsc70 on clathrin-mediated endocytosis / J. Cho, G.H. Kim, S.H. Park and others // Mol Biosyst. - 2015. - Vol. 11. - № 10. - P 2763-2769. doi: 10.1039/c4mb00695j.

14. Jуzefowski S. Lipid raft-dependent endocytosis negatively regulates responsiveness of J774 macrophage-like cells to ЭТ by down regulating the cell surface expression of ЭТ receptors / S. Jуzefowski, M. Њrуttek // Cell Immunol. - 2017. - Vol. 312. - P. 42-50. doi: 1016/j.cellimm.2016.11.008.

15. Multhoff G. Distinguishing integral and receptor-bound heat shock protein 70 (Бтш70) on the cell surface by Бтш70-specific antibodies / G. Multhoff, L.E. Hightower // Cell Stress Chaperones. - 2011. - Vol. 16 - № 3. P. 251-255. doi: 10.1007/s12192-010-0247-1.

16. Jin S. Lipid raft redox signaling: molecular mechanisms in health and disease. / S. Jin, F. Zhou, F. Katirai, P.L. Li // Antioxid Redox Signal. - 2011. - Vol. 15. - № 4. - P. 1043-1083. doi: 10.1089/ars.2010.3619.

Размещено на Allbest.ru