Из народной медицины известно, что некоторые представители рода ряска (Lemna L., семейство рясковых Lemnaceae S. F. Gray) являются лекарственными растениями. Настои из травы ряски издавна использовались в качестве жаропонижающего, мочегонного, желчегонного, противоглистного и антимикробного средства [1]. Особый интерес представляет ряска малая (Lemna minor L.). Этот вид достаточно широко распространен в Западной Сибири, в том числе и в Томской области, а сведения о лекарственных свойствах этого растения встречаются в литературе наиболее часто [2, 3].

Кроме того, изучен химический и минеральный состав этого растения в сравнении с другим распространенным в нашем регионе видом ряской трехдольной (L. trisulca) [4]. Установлено, что в растениях рода ряска присутствуют в разных количествах флавоноиды, полисахариды, аминокислоты, алифатические кислоты, фенилкарбоновые кислоты, антоцианы, тритерпеновые соединения [5]. Ряска малая отличается значительно большим содержанием железа, цинка, меди, марганца, магния, кобальта, кремния и йода, чем ряска тройчатая [4].

Результаты изучения химического и минерального состава растений рода ряска позволяют предполагать широкий спектр биологической активности суммарных извлечений из лекарственного сырья. Однако в ранее проведенных исследованиях изучена только противогрибковая активность водных и спиртовых экстрактов в отношении дерматофитов и показаны сорбционные свойства измельченного сырья, сравнимые с активированным углем [6]. Цель настоящего исследования - изучение биологической активности спиртовых извлечений из ряски малой в отношении воспаления разного генеза.

Материалы и методики исследования. Исследование проведено в зимний период в одинаковом диапазоне температур на самцах мышей и крыс массой 20-23 и 200-250 г соответственно. Высушенный спиртовой экстракт ряски малой на физиологическом растворе вводили перорально с помощью зонда в течение 5 дней до эксперимента однократно в сутки в дозе 100 или 200 мг/кг в утренние часы. В контрольных экспериментах вводили в эквиобъемных количествах физиологический раствор (0,2 мл на 100 г массы тела). Сухой экстракт ряски малой представляет собой твердую хрупкую массу темно-коричневого цвета, полученную путем экстракции из травы ряски 40% -ным раствором этанола (методом реперколяции) и дальнейшего высушивания полученного экстракта до сухого состояния.

Изучение влияния экстракта ряски на процесс воспаления изучали на мышах и крысах на моделях каррагенинового экссудативного отека, острых стрессорных и пептических повреждений стенки желудка (в виде язв).

Острый экссудативный отек вызывали с помощью флогогена каррагенина, который вводили субплантарно в одну из лапок животного (0,05 мл 1% -ного раствора) через 1 ч после последнего введения экстракта ряски [7]. Величину отека определяли через 3,5 ч после введения флогогена по разности масс воспаленной и здоровой конечностей животного, которые определяли после его декапитации под эфирным наркозом. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражали в процентах к контролю. Об интенсивности воспаления судили по процентным показателям прироста и угнетения отека, которые рассчитывали по формулам:

1) % прироста отека = {масса больной конечности - масса здоровой конечности / масса здоровой конечности} Ч 100%;

2) % угнетения отека = [% прироста массы конечности (контроль) - % прироста массы конечности (опыт) / % прироста массы конечности (контроль)] Ч 100% [7]. В качестве препарата сравнения использовали официнальное нестероидное противовоспалительное средство с выраженным противовоспалительным эффектом - индометацин в дозе 50 мг/кг внутрь.

биологическая активность спиртовое извлечение ряска малая

Деструктивные повреждения стенки желудка мышей стрессорного характера вызывали длительной иммобилизацией животных по методу Ю.И. Добрякова [8]. Иммобилизация мышей осуществлялась на протяжении 18 ч после последнего введения экстракта в дозах 100 или 200 мг/кг, затем проводилась декапитация животных под эфирным наркозом. Желудки извлекали, вскрывали по малой кривизне, промывали холодным физиологическим раствором и макроскопически с помощью лупы при ярком освещении определяли число и площадь деструкций, которые дифференцировали на точечные (менее 1 мм), крупные (более 1 мм) и полосовидные. Подсчитывали среднее количество изъязвлений на одно животное в группе, процент животных с язвами. Индекс Паулса (ИП) определяли как интегральный показатель количества деструкций по формуле: ИП = (среднее количество язв Ч % животных с язвами) /100%. Противоязвенную активность (ПА) препаратов определяли как отношение индекса Паулса в контрольной группе к индексу Паулса в опытной группе. Исследуемое средство считали активным, если ПА составляло 2 и более единиц [8].

Острые деструктивные повреждения в стенке желудка в виде пептических язв моделировали по методу H. Shay [9]. В эксперименте были использованы крысы. Моделирование острой пептической язвы проводили в утренние часы после 18 ч голодания при свободном доступе к воде и через 24 ч после последнего введения экстракта ряски в дозе 200 мг/кг. Под эфирным наркозом осуществляли полную перевязку лигатурой пилорического отдела желудка на 18 ч до момента декапитации. После этого извлекали желудок и оценивали состояние его стенки по количеству деструктивных поражений и индексу Паулса, а содержимое желудка подвергали биохимическому анализу, определяя кислотность и протеолитическую активность желудочного сока.

Протеолитическую активность желудочного сока крыс определяли по методу Ансона и Мирского в модификации А.М. Уголева [10]. Принцип метода основан на спектрофотометрическом определении выделившихся в ходе исследования аминокислот тирозина и триптофана, которые при взаимодействии с реактивом Фолина-Чокалтеу окрашивают пробы в синий цвет различной интенсивности. Исследуемый желудочный сок доводили до стандартных условий pH (1,4-2,4) соляно-кислым буфером. Эта величина pH создает оптимальные условия для проявления протеолитической активности пепсинов. Желудочный сок разбавляли буфером в 50 раз. В качестве субстрата для протеолитических ферментов использовали бычий сывороточный лиофилизированный белок альбумин.

К разведенному желудочному соку добавляли раствор альбумина и для лучшего протекания реакции пробирки ставили в баню в штативе при 37 - 38єС. Через 30 мин процесс переваривания останавливали 0,3N трихлоруксусной кислотой. Белок, который не подвергался гидролизу, выпадал в осадок. Затем к надосадку добавляли 0,5N NaOH, способствующей проявлению интенсивности окраски. К полученным пробам приливали фенольный реактив Фолина-Чокалтеу. Их оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46 "Ломо" в красной области светового спектра при длине волны 620 нм. Активность пепсинов определяли по калибровочному коэффициенту с учетом разведения проб желудочного сока. Калибровочный коэффициент представляет собой среднюю величину отношения концентрации тирозина в мкмоль/мл к соответствующей оптической плотности.

Активность протеолитических ферментов выражали в мкмоль/мл желудочного сока крыс. Пересчет производился по формуле С = Е Ч 600 Ч k, где С - количество тирозина, характеризующее протеолитическую активность пепсинов желудочного сока; Е - экстинция пробы на данной длине волны; k - коэффициент калибровки; 600 - стандартный коэффициент пересчета для желудочного сока. Для определения калибровочного коэффициента использовали различные разведения исходного раствора кристаллического тирозина в 0,1N HCI [10].

Кислотность желудочного сока оценивалась способом П.А. Канищева и Л.Г. Коваленко по активности ионов водорода, определяемой с помощью pH желудочного сока, с последующим вычислением по таблице антилогарифмов и выражалась в мкмоль/мл [11].

Статистическая обработка полученных результатов выполнена в программе StatSoft Statistica 6.0. Рассчитывали среднее арифметическое значение показателя (М), стандартную ошибку среднего арифметического (m). Статистическую значимость различий между сравниваемыми выборками показателей проводили с помощью непараметрического U-кри-терия Манна-Уитни с уровнем значимости p ? 0,05 [12].

Результаты исследования и обсуждение. Воспаление является универсальной патологической реакцией ткани на местное повреждающее воздействие любого происхождения. Оно протекает стереотипно в три фазы, запускается и поддерживается медиаторами воспаления, которые освобождаются из тучных клеток при повреждении. Тучные клетки наиболее плотно располагаются в соединительной ткани [13]. Подкожная соединительная ткань грызунов имеет самую высокую плотность тучных клеток на единицу поверхности [14], поэтому подкожное введение провоспалительных агентов, например каррагенина, сопровождается выраженным отеком [7].

Каррагенин представляет собой полисахарид, выделенный из ирландского морского мха. Это соединение является одним из самых мощных флогогенов и используется для моделирования экссудативного воспаления в эксперименте [7, 14]. Интенсивность каррагенинового отека коррелирует с возрастанием тучноклеточных медиаторов воспаления - гистамина, серотонина, брадикинина, простагландинов, а также резким повышением активности провоспалительных ферментов - кислой фосфатазы, циклоксигеназы, липоксигеназы [7, 13].

У контрольных и опытных животных отек лапки интенсивно развивался в течение 3-4 ч после субплантарного введения флогогена (в подошвенный апоневроз), достигая к этому времени максимального пика экссудации. У контрольных животных поврежденная лапка с каррагенином увеличивалась на 60% в сравнении с интактной лапкой (табл.1), что достоверно выше (в 3 раза, р < 0,05), чем у животных, получавших инъекцию физиологического раствора вместо каррагенина. Введение экстракта ряски опытным мышам в течение 5 дней существенно (в 1,5 раза) уменьшало величину каррагенинового отека в сравнении с контрольными исследованиями (р < 0,05), о чем свидетельствуют показатели прироста и угнетения отека (табл.1). Следует подчеркнуть, что противоотечное действие препарата сравнения индометацина было более выраженным, чем у экстракта ряски, и достоверно не отличалось от контрольных животных, получавших физиологический раствор. Однако достоверных отличий между приростом и угнетением отека под влиянием экстракта ряски и индометацина не было обнаружено. Полученные результаты указывают на то, что на модели каррагенинового отека у экстракта ряски проявились противовоспалительные свойства.