Исследование молекулярно-генетических маркеров риска развития вибрационной болезни у шахтеров-угольщиков Кузбасса

Размещено на http://allbest.ru

Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний

УДК 575:613.644

Исследование молекулярно-генетических маркеров риска развития вибрационной болезни у шахтеров-угольщиков Кузбасса

Ядыкина Т.К., Захаренков В.В., Гафаров Н.И.,

Казицкая А.С., Гуляева О.Н., Панев Н.И.,

Жукова А.Г., Лузина Ф.А., Зинина М.В., Семенова Е.А.

Новокузнецк

Введение

Наследственная предрасположенность определяется комбинацией аллелей ряда генов, сочетание которых с внешними средовыми факторами может приводить к развитию заболевания. В структуре профессиональной заболеваемости Кузбасса - региона с развитой угледобывающей и металлургической промышленностью - большая доля патологий у шахтёров-угольщиков приходится на профессиональные заболевания опорно-двигательного аппарата, нейросенсорную тугоухость, болезни органов дыхания. Развитию этих патологий способствуют неблагоприятные факторы при добыче полезных ископаемых, в частности воздействие вибрации, шума, пыли различного химического состава, а также физическое перенапряжение и статические нагрузки в условиях охлаждающего микроклимата. Сочетанное действие факторов при стаже работы от 10-15 лет в данных условиях производственной среды приводит к развитию нейроортопедической патологии и болезней органов дыхания [1, 4, 7]. Следует отметить, что вибрационная болезнь (ВБ) очень редко встречается изолированно среди всех представленных нозологий у шахтёров-угольщиков и носит специфический характер. Это касается в первую очередь работников, занимающихся не только подземной добычей угля в шахтах, но и на разрезах.

В основе формирования ВБ лежит сложный механизм нервно-рефлекторных и нейрогуморальных нарушений, приводящих к появлению очагов застойного возбуждения в различных отделах центральной нервной системы и симпатических ганглиях, изменениям периферического кровообращения и иннервации, развитию гипоксии и дистрофических поражений внутренних органов [1, 7]. ВБ характеризуется полиморфностью клинической симптоматики и своеобразием течения. Снижается вибрационная чувствительность, кожная температура кистей (ниже 25 °С), часто развивается цианоз, а также дистрофические нарушения в мышцах и астено-невротические реакции в виде головной боли, общей слабости, повышенной утомляемости, раздражительности. При этом клиника и характер течения ВБ определяются основными физическими параметрами вибрации, суммарным временем её воздействия, местом и площадью соприкосновения с вибрирующим источником, положением тела, а также сопутствующими гигиеническими факторами - шумом, физическим напряжением, микроклиматом и другими.

Исследования, посвящённые ассоциации полиморфных вариантов генов, связанных с риском развития ВБ, единичны [4, 5]. Однако известно, что у лиц, работающих на одном и том же предприятии в однотипных условиях труда, ВБ может существенно различаться по срокам развития, степени тяжести и характеру своего течения [7]. Вероятно, это зависит от биологических особенностей организма, определяющих неодинаковую чувствительность людей к действию производственной вибрации. Такое предположение подкрепляется известным фактом, что различия в течении ВБ могут быть обусловлены особенностями анатомической конституции человека.

Наряду с таким способом снижения профессиональной заболеваемости, как исключение неблагоприятного производственного фактора, провоцирующего развитие болезни, важное место занимают разработка методов ранней диагностики начальных стадий профессиональных заболеваний и своевременная профилактика, основанная на изучении наследственной предрасположенности к профессиональным заболеваниям. Это направление является приоритетным в современной медицине труда [7].

Изучение генетических маркеров, наиболее часто встречающихся у больных лиц, дает возможность судить об участии наследственных факторов в развитии того или иного заболевания и выявлять среди населения группы лиц с генотипами повышенного риска и определять меры своевременной профилактики. Гены ферментов биотрансформации чрезвычайно полиморфны и полифункциональны, их роль не ограничивается защитной функцией в активном метаболизме экзогенных и эндогенных веществ прежде всего токсичного генеза. Разные аллели этих генов могут кодировать белки, различающиеся по уровню ферментативной активности, что обуславливает индивидуальную метаболическую специфичность и может выступать в качестве основы индивидуальной предрасположенности к некоторым нозологиям [10, 11].

Изучение полиморфных вариантов генов ферментов, задействованных в первой фазе биотрансформации ксенобиотиков - CYP1A1, а также генов второй фазы - семейства глутатион-S-трансфераз (GST), выявление генетических маркёров (сывороточных белков и эритроцитарных изоферментов) повышенной чувствительности к изменяющимся внешнесредовым условиям будут способствовать дальнейшему развитию модели формирования адаптации и генетической предрасположенности к профессиональным заболеваниям органов дыхания в сочетании с вибрационной патологией при воздействии вредных факторов производственной среды.

В связи с вышесказанным, исследование индивидуальных генетических систем у больных ВБ является чрезвычайно актуальным.

Цель настоящей работы - изучить связь биохимического и молекулярно-генетического полиморфизма с предрасположенностью к ВБ - профессиональному заболеванию работников угледобывающих шахт Кузбасса.

Материал и методы

Исследование проходило на базе клиники НИИ КПГПЗ. Основную группу больных составили шахтёры, работающие в контакте с вибрацией, имеющие диагностированную вибрационную патологию различной степени выраженности. Контрольную группу составили работники шахт, не страдающие ВБ. Возраст обследованных - от 30 до 60 лет (преобладающий возраст представленной выборки составил 40-50 лет), пол мужской.

Материалом для исследования служили образцы венозной крови. Белки и изоферменты разделяли методом электрофореза в полиакриламидном (ПААГ) и крахмальном геле [3, 6]. Ингибитор протеаз б-I-антитрипсин разделяли методом изоэлектрофокусирования в ПААГ [8]. По этой системе регистрировали 6 генотипов ММ, а также редкие генотипы MS и M и Z, объединенные в один класс MR. Разделение изоферментов кислой фосфатазы АсР эритроцитов проводилось в крахмальном геле, в трис-цитратной системе, рН - 6,8 [9].

Ген GSTT1 кодирует глутатион-S-трансферазу класса и, которая локализована в эритроцитах и связана со II-й фазой биотрансформации. «Нуль-аллель», или делеция, в этом гене в гомозиготном состоянии обуславливает нулевую активность его продукта. Частота «нуль-аллеля» у европеоидов достигает 38%.

Полиморфизм GSTT1 может приводить к индивидуальным различиям в восприимчивости к различным факторам среды. Ген GSTM1 кодирует фермент глутатион-S-трансферазу класса м, который, в частности, метаболизирует ксенобиотики совместно с цитохромами Р450. «Нулевой» аллель GSTM1 (-) обусловлен делецией гена GSTM1, его частота в некоторых популяциях достигает 45-50%. Отсутствие активности продукта GSTM1 может быть фактором риска развития сочетанных патологий различных органов и систем [11].

Выделение ДНК проводилось стандартным фенол-хлороформным методом. Для проведения молекулярно-генетических исследований образцы ДНК растворяли в 100 мкл Н₂О и хранили при t -20 °С. Типирование генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 проводили методом полимеразной цепной реакции (RealTime) на приборе ДТпрайм 4 ООО «НПО ДНК-Технология».

Тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфных локусов rs 4646903 гена CYP1A1, а также полиморфизмов генов GSTT1 и GSTM1 были разработаны в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук и синтезированы ООО «СибДНК».

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью классических алгоритмов биометрии.

Достоверность различий в распределении ассоциаций полиморфных вариантов между больными лицами и контролем оценивали по критерию ² с поправкой Йетса на непрерывность и величину относительных шансов OR (oddis ratio) при уровне значимости р?0,05, которая показывает, во сколько раз чаще болезнь развивается у лиц с наличием данного генотипа по сравнению с теми, у кого он отсутствует [3]: OR?1 рассматривали как отрицательную ассоциацию аллеля с заболеванием, а OR?1 - как положительную ассоциацию при ²?3,841.

Результаты

Распределение частот генотипов HP, GC, EsD, AcP, PI в группе шахтеров-угольщиков, страдающих ВБ, и в группе здоровых лиц по большинству изученных маркеров (НР, GC, EsD) соответствовало наблюдаемому и ожидаемому распределению генотипов исходя из равновесия Харди-Вайнберга, за исключением локусов АСР и PI, по которым показано статистически значимое отклонение в обеих изученных группах.

В то же время по всем изученным маркерам в обследованных выборках частоты аллелей и генотипов находились в границах значений, показанных для европеоидного русского населения РФ и Сибири [2, 3, 8].

К генотипам риска относится НР 1-1. С возрастом (от 40 лет до 60 лет и старше) частота этого генотипа снижается с 17,6% до 11,1%. С увеличением возраста и стажа работы частота развития ВБ возрастает [4, 5].

Таким образом, в данной ситуации наблюдается сопряжённый процесс. С одной стороны, с возрастом возрастает число больных ВБ, и при этом наиболее подвержены ВБ обладатели генотипов НР 1-1. С другой стороны, по мере увеличения возраста (и, соответственно, стажа работы) убывает число обладателей таких генотипов именно в силу их большей подверженности ВБ и более быстрому выбыванию с производства.

Изучение генетических прогностических факторов в комплексе с клиническими исследованиями позволит разработать на их основе новые прогностические модели, что является чрезвычайно актуальным направлением современной медицины труда и профпатологии.

В результате метаболизма токсикантов, а также сочетанного воздействия на организм факторов среды, особенно негативных (в том числе курения, повышенных/пониженных температур, запылённости, шума, вибрации и многих других), зачастую развивается окислительный стресс. Нарушение антиоксидантной защиты приводит к дестабилизации биологических мембран, активации процессов липопероксидации, расстройствам оксигенации, трофики тканей и стойким нарушениям гемостаза. шахта вибрационный биохимический симптоматика

Гаптоглобин - специфический острофазовый транспротеин, участвующий в связывании с гемоглобином. Основной физиологической функцией гаптоглобина является сохранение железа в организме, кроме того, комплекс гемоглобин-гаптоглобин обладает высокой пероксидазной активностью, оказывая тормозящий эффект на процессы перекисного окисления липидов.

Концентрация белка гаптоглобина (НР) в выборке обследованных лиц колебалась от 90 до 360 мг%, но в основном её значения составляли 150-200 мг%, т.е. в пределах нормы. Соотношение концентраций гаптоглобина по генотипам НР1-1/НР1-2/НР 2-2 в изученной нами выборке (табл. 1) составляет 183:185:161 мг%.

Таблица 1

Распределение генотипов гаптоглобина (НР) и его концентрация (мг%) у здоровых и больных лиц

Полученные результаты чрезвычайно важны для прогнозирования риска развития ВБ и для коррекции соответствующих этапов лечения. В таблице 2 представлены данные по концентрации НР и Hb в 3-х возрастных группах больных лиц.

Таблица 2

Концентрация белка гаптоглобина (НР) и гемоглобина (Hb) у больных ВБ разного возраста

По мере уменьшения количества Hb в крови возрастает количество НР, который связывает свободный Hb, таким образом частично компенсируя потерю организмом железа. Это тем более важно, так как с возрастом интенсивность гемопоэза снижается, уменьшается количество как связанного, так и свободного Hb. Такой компенсаторный механизм может играть определённую роль при ВБ, когда нарушается микроциркуляция и ухудшается трофика и газообмен в тканях конечностей и соединительной ткани. Это не единственное объяснение этого феномена. Нельзя исключать возрастание концентрации НР как белка «острой фазы» при воспалительных процессах, которые, как правило, сопровождают ВБ. Наконец, это может быть и чисто возрастным процессом, не связанным с ВБ. Для выяснения этого необходимы исследования на больших выборках здоровых людей.

По системе GC не обнаружено каких-либо значимых различий по частотам отдельных генотипов между здоровыми и больными лицами ни по отдельным выборкам, ни суммарно (табл. 3).

Таблица 3

Частоты генотипов и аллелей биохимических маркеров генов в группе больных вибрационной болезнью и в контроле

Примечания: N - объём выборки; ² - тест для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому исходя из равновесия Харди-Вайнберга; OR - отношение шансов; р - уровень значимости значения ² при сравнении различий в распределении генотипов между больными и контролем.

В целом распределение генотипов характерно для русского и европеоидного населения. В дальнейшем анализе в качестве контроля использовались данные, полученные для практически здорового взрослого населения г. Новокузнецка.

Среди генотипов флуоресцентной эстеразы самым распространённым оказался EsD 1-1, который достоверно чаще (р<0,001) встречается в выборке населения города по сравнению с больными ВБ. Следует отметить, что генетическая гетерогенность больных ВБ в комплексе с факторами окружающей среды определяет особенности распространённости и клинического течения заболевания. Показана положительная ассоциативная связь EsD 1-2 с ВБ. Третий полиморфный вариант этой системы (EsD 2-2) достоверно чаще встречается и у больных лиц и может рассматриваться как генотип риска. По системе АсР были обнаружены все возможные полиморфные варианты (табл. 3).

По системе ингибитора протеаз (табл. 4) к генотипам риска относятся редкие варианты, главным образом M1S и M2S, связанные с пониженной ингибиторной емкостью крови.

Таблица 4

Частоты генотипов PI и аллелей биохимических маркеров генов в группе больных ВБ и в контроле

Примечания: N - объём выборки; ² - тест для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому исходя из равновесия Харди-Вайнберга; OR - отношение шансов; р. - уровень значимости значения ² при сравнении различий в распределении генотипов между больными и контролем.

К генотипам резистентности можно отнести наиболее распространённый вариант М1М1. Генотип М1М2 показывает положительную ассоциативную связь с ВБ. Генотипами риска оказались гомозиготные варианты АсР bb и AcP cc, генотипами резистентности - AcP aa, AcP ab, AcP ac. По распределению генотипов население Новокузнецка в основном сходно с населением других регионов Сибири и России.

Анализ полиморфизма гена СYP1A1 выявил статистически значимые различия между группой больных ВБ и здоровыми индивидами (табл. 5).

В частности, обладатели полиморфного варианта АА резистентны к развитию болезни, тогда как для генотипа АG полиморфного локуса гена СYP1A1 получена статистически достоверная связь с болезнью (²=4,09; OR=8,0). Полученные данные могут свидетельствовать о возможной предрасположенности лиц с гетерозиготным генотипом АG к развитию вибрационной патологии у работников угольной промышленности.

Таблица 5

Распределение частот полиморфного варианта гена СYP1A1 в группе больных ВБ и здоровых лиц

Возможно, полиморфный вариант G гена CYP1A1 полиморфизма (А1506G), увеличивая активность фермента, приводит к образованию большого количества токсичных интермедиатов, ускорению протекания свободнорадикальных процессов в нервно-мышечном волокне, обуславливая развитие соответствующей патологии у лиц обладателей гетерозиготного варианта генотипа.

Полиморфизм гена CYP1A1 AG приводит к продукции энзима с повышенной активностью. Известно, что «высокоактивные» аллели генов прооксидантов связаны с повышенным риском развития окислительного стресса, приводящего к продукции активных форм кислорода (АФК), способных повреждать структуры клеток.

Полученные результаты согласуются с исследованиями ряда авторов о тератогенном эффекте и возможной ассоциативной связи гетерозиготного генотипа гена CYP1A1 и повышением частоты хромосомных аберраций [12].

Из проанализированных двух изоформ глутатион-S-трансфераз (GSTM1 и GSTT1) для генотипа GSTT1(-) и GSTМ1(-) была выявлена ассоциация с развитием ВБ (²=4,4241). Высокая степень ассоциативной связи, вероятно, обусловлена патологическим изменением органов респираторной, нервной и опорно-двигательной систем.

Функциональные полиморфизмы гена глутатионтрансфераз (+/+) определяют нормальную активность фермента, в то время как лица обладатели гомозиготного генотипа (-/-) в результате недостаточной экспрессии ферментов АО защиты способны потенцировать развитие соответствующей патологии.

Логично предположить, что делеции гена будут приводить к снижению активности ферментов и ухудшать прогноз течения ВБ. В связи с этим необходимо проведение дальнейшего детального изучения и увеличение выборки по данной проблеме.

Таким образом, полученные результаты о генетическом полиморфизме генов в условиях вибрации и угольно-породного запыления могут быть особо ценны при проведении профилактических осмотров и формировании групп повышенного риска развития соответствующей патологии у шахтёров-угольщиков. Исследование продолжается.

Наблюдаемая дифференциальная чувствительность к вибрационной патологии определяется наследственной компонентой, проявляющейся адаптивным процессом или дезадаптацией, сопровождающейся проявлением профессионального заболевания.

Проведенное исследование выявило статистическую сопряжённость некоторых сывороточных и эритроцитарных генотипических маркеров с ВБ.

К статистически значимым генотипам, связанным с риском развития ВБ, относятся: НР 1-1, EsD 2-2, АсР bb и AcP cc, MS и MZ ингибитора протеаз PI; полиморфизм AG гена CYP1A1 и сочетание GSTT1(-)/GSTМ1(-). В ходе проведённого исследования определены генотипы, которые, наоборот, реже встречаются у больных лиц, чем у здоровых. Это EsD 1-1, М1М1 ингибитора протеаз PI, изоферменты кислой фосфатазы AcP aa, AcP ab, AcP ac; полиморфизм AA гена CYP1A1.

Список литературы

1. Артамонова В.Г., Шаталова В.Н. Профессиональные болезни. М.: Медицина, 1996.

2. Балановская Е.В. Генофонд и геногеография населения СССР // Генетика. 1992. Т. 28, № 1. С. 52-75.

3. Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир, 1995.

4. Гафаров Н.И., Захаренков В.В., Панев Н.И., Казицкая А.С., Ядыкина Т.К., Замятина Г.С., Зинина М.В. Распределение сывороточных белков и эритроцитарных изоферментов у шахтёров-угольщиков, страдающих вибрационной болезнью // Реализация Глобального плана действий по здоровью работающих в Российской Федерации. Проблемы и перспективы / тезисы докладов / под ред. Н.Ф. Измерова. М., 2009. С. 35-37.

5. Гафаров Н.И., Захаренков В.В., Панев Н.И., Казицкая А.С., Ядыкина Т.К., Лузина Ф.А., Замятина Г.С., Зинина М.В. Биохимическая изменчивость населения крупного промышленного города Кузбасса // Современные проблемы медицины труда, гигиены и экологии человека / материалы XLVI научно-практической конференции с международным участием «Гигиена, организация здравоохранения и профпатология» и семинара «Актуальные вопросы современной профпатологии». Кемерово: ООО «Примула», 2011. С. 96-99.

6. Дранник Г.Н., Дизик Г.М. Генетические системы крови человека и болезни. Киев: Здоровье, 1990.

7. Измеров Н.Ф., Каспаров А.А. Медицина труда. Введение в специальность. М.: Медицина, 2002.

8. Спицын В.А. Биохимический полиморфизм человека (антропологические аспекты). М.: МГУ, 1985. 216 с.

9. Троицкий Г.В., Ажицкий Г.В. Изоэлектрофокусирование белков в самоорганизующихся и искусственных рН-градиентах. Киев: Наукова Думка, 1984.

10. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пузырев В.П. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз (GSTT1 и GSTM1) у больных атопической бронхиальной астмой в Западно-Сибирском регионе // Молекулярная биология. 2002. Т. 36, № 4. С. 1-5.

11. Целоусова О.С., Кочетова О.В., Ахмадишина Л.З., Корытина Г.Ф., Викторова Т.В. Полиморфные варианты генов цитохрома Р450 (CYP1A1, CYP2E1, CYP2D6) в развитии предрасположенности к профессиональному токсическому поражению печени // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2009. № 1 (65). С. 136-140.

12. Thier R., Brьning T., Roos P.H. et al. Markers of genetic susceptibility in human environmental hygiene and toxicology: the role of selected CYP, NAT and GST genes // Int. J. Hyg. Environ. Health. 2003. Vol. 206, N 3. Р. 149-171.

Резюме

УДК 575:613.644

Исследование молекулярно-генетических маркеров риска развития вибрационной болезни у шахтеров-угольщиков Кузбасса. Ядыкина Т.К., Захаренков В.В., Гафаров Н.И., Казицкая А.С., Гуляева О.Н., Панев Н.И., Жукова А.Г., Лузина Ф.А., Зинина М.В., Семенова Е.А. Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний, Новокузнецк

Изучено распределение сывороточных и эритроцитарных генетических маркеров у шахтеров, страдающих вибрационной болезнью. Выявлены типы белков и ферментов, достоверно чаще встречающихся у больных лиц по сравнению со здоровыми. Изучены концентрации НР и Hb у лиц разного возраста с разными генотипами. Распределение частот аллелей и генотипов гена CYP1A1 между выборкой больных и в контроле существенно различается. Генотип AG проявляет статистически достоверную связь с болезнью. Делеция («нулевой» генотип) генов GSTT1/GSTM1 ассоциируется с риском развития вибрационной патологии.

Ключевые слова: вибрационная болезнь, генетические маркеры, генотип, генетическая предрасположенность, резистентность.

Summary

Study on molecular genetic markers of risk for the development of vibration disease in kuzbass coal miners. Yadykina T.K., Zakharenkov V.V., Gafarov N.I., Kazitskaya A.S., Gulyaeva O.N., Panev N.I., Zhukova A.G., Luzina F.A., Zinina M.V., Semenova E.A. Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk

The distribution of serum and erythrocyte genetic markers among the miners suffering from vibration disease has been studied. The types of proteins and enzymes that significantly more frequently occur in the patients than in healthy individuals have been revealed. The concentrations of HP and Hb in the subjects of different ages with diverse genotypes have been studied. The distribution of allele frequencies and genotypes of CYP1A1 gene between the sample of the patients and in the control varies considerably. AG genotype shows statistically valid connection with the disease. The deletion (“null” genotype) of GSTT1/GSTM1 genes is associated with the risk of developing vibration pathology.

Key words: vibration disease, genetic markers, genotype, genetic predisposition, resistance.

Размещено на Allbest.ru