Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения

Рисунок 3.1.4. Анзерин и L-гистидин-в-аланин замедляют прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин. Клетки РС-12 инкубировали с карнозином и его производными в течение 48 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с 50 мМ карнозина, анзерина, ацетил-карнозина (А) или 1 - 10 мМ L-гистидин-в-аланина (Б). Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.

Синтетическое производное карнозина L-гистидин-в-аланин, представляющий собой последовательность аминокислот карнозина в обратном порядке (т.н. “Карнозин наоборот”) эффективнее, чем карнозин индуцировал накопление клеток в S и G₂/М фазах клеточного цикла (Рис. 3.1.4.Б). Клетки обрабатывали L-гистидин-в-аланином в концентрации 1 - 10 мМ в течении 48 ч, затем с помощью проточного цитометра изучали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК. Достоверно отличимый от контроля результат наблюдали при концентрации 5 - 10 мМ, то есть в 5 раз ниже, чем для карнозина. Причем, под действием 10 мМ L-гистидин-в-аланина количество S и G₂/М клеток возрастало на 80% и 60% соответственно, что превышало значения, полученные под действием 50 мМ карнозина. В концентрации выше 10 мМ L-гистидин-в-аланин проявлял токсическое действие, поскольку приводил к гибели более 90% клеток. Таким образом, L-гистидин-в-аланин замедлял прогрессию клеточного цикла эффективнее, чем карнозин, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом.

3.1.4 Изучение воздействия синтетического трипептида пинеалона на клеточный цикл

Пинеалон представляет собой синтетический трипептид (Glu-Asp-Arg), синтезированный на основе анализа экстракта коры головного мозга крупного рогатого скота и проявляющий эффективные антиоксидантные свойства [244-246]. Для изучения эффекта пинеалона на внутриклеточный уровень АФК клетки РС-12 обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 1 ч, а затем индуцировали окислительный стресс добавлением 1 мМ пероксида водорода (Н₂О₂) на 20 мин. Уровень АФК измеряли с помощью проточного цитометра по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH₂-DA. Процент погибших клеток определяли по количеству клеток окрашенных PI. Результаты измерения внутриклеточного уровня АФК и процента погибших клеток представлены на Рис. 3.1.5. Как видно из Рис. 3.1.5.А. обработка клеток РС-12 пинеалоном 50 - 500 нМ приводила к снижению внутриклеточного уровня АФК на 40% по сравнению с контролем. Добавление Н₂О₂ индуцировало рост АФК. Уровень АФК в пробах обработанных 1 мМ Н₂О₂ в 5 раз превышал значение в контроле. Инкубация клеток с пинеалоном частично препятствовала увеличению уровня АФК под действием Н₂О₂. Клетки, обработанные пинеалоном (50 - 500 нМ) перед добавлением Н₂О₂, демонстрировали в 2 раза меньший уровень АФК, чем клетки обработанные только Н₂О₂. Параллельно с повышением уровня АФК под действием Н₂О₂ происходило увеличение клеточной гибели. В пробах обработанных Н₂О₂ количество погибших клеток составляло 42,5% по сравнению с 5% в контроле. Пинеалон (50 - 500 нМ) снижал количество погибших клеток до 32,5 - 20% (Рис. 3.1.5.Б). Таким образом, было продемонстрировано, что пинеалон снижает внутриклеточный уровень АФК, предотвращает развитие окислительного стресса индуцированного действием Н₂О₂ и защищает клетки РС-12 от гибели.

Рисунок 3.1.5. Пинеалон снижает уровень АФК в клетках РС-12 и уменьшает клеточную гибель. Клетки обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ), через 1 час добавляли 1 мМ пероксида водорода (Н₂О₂), инкубировали 20 мин и анализировали на проточном цитометре. (А) Уровень АФК в контроле и в клетках обработанных пинеалоном и Н₂О₂ измеренный по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH₂-DA. (Б) Процент погибших клеток определенный по количеству клеток окрашенных PI. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от количества клеток в контроле (*) или в присутствии 1 мМ Н₂О₂ (**); n=3, p<0.05.

Для того чтобы выяснить, способен ли пинеалон ввиду своих антиоксидантных свойств модифицировать прогрессию клеточного цикла клетки РС-12 обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 24 ч и с помощью проточного цитометра анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла согласно содержанию ДНК.

Рисунок 3.1.6. Пинеалон индуцирует накопление клеток в S и G₂/М фазах клеточного цикла. Клетки обрабатывали пинеалоном (50 - 500 нМ) в течение 24 часов. Распределение клеток по фазам клеточного цикла анализировали на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки пинеалоном. (В) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.1.6.А. представлен пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после обработки пинеалоном 100 нМ. Процентное распределение клеток между G₀/G₁, S и G₂/М фазами в контроле и в пробах обработанных пинеалоном (50 - 500 нМ) показано на Рис. 3.1.6.Б. Как следует из Рис. 3.1.6.Б, пинеалон приводил к дозо-зависимому увеличению количества клеток в S и G₂/М фазах и снижению количества клеток в G₀/G₁ фазе. Распределение в контроле составляло: G₀/G₁ - 70%, S - 14%, G₂/М - 16%. Достоверно отличимый от контроля результат был получен в клетках, обработанных 100 нМ и 500 нМ пинеалона и составлял, соответственно: G₀/G₁ - 55%, S - 21%, G₂/М -24% и G₀/G₁ - 50%, S - 24%, G₂/М - 26%. Существенного влияния пинеалона на количество апоптотических клеток выявлено не было (Рис. 3.1.6.Б). Исходя из полученных, данных был сделано предположение о том, что пинеалон проявляет антиоксидантные свойства в клетках РС-12, а также индуцирует накопление клеток в G₂/М фазе клеточного цикла.

Заключение I: Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы РС-12 сопровождалось модификацией клеточного цикла и накоплением клеток в S и G₂/М фазах. Метилирование карнозина приводило к усилению формирования G₂-блока, а ацетилирование молекулы этот эффект ослабляло. L-гистидин-в-аланин (т.н. “карнозин наоборот”) демонстрировал в 5 раз большую эффективность по сравнению с карнозином, однако обладал сильным цитотоксическим эффектом. Синтетический трипептид пениалон также демонстрировал антиоксидантные свойства и индуцировал накопление клеток в S и G₂/М фазах. Однако концентрации пинеалона были на несколько порядков ниже, чем для карнозина. Поскольку изменениям в прогрессии клеточного цикла под действием карнозина предшествовало снижение внутриклеточного уровня АФК, было предположено, что существует взаимосвязь между антипролиферативным и антиоксидантным эффектами карнозина.

РАЗДЕЛ 3.2 Изучение механизма регуляции клеточного цикла под действием карнозина

Исследования механизма антипролиферативного эффекта карнозина были продолжены с использованием культур опухолевых клеток человека, так как именно они представляют собой первостепенную важность и имеют перспективу применения полученных данных на практике.

3.2.1 Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы

Для изучения характера влияния карнозина на пролиферацию опухолевых клеток человека были выбраны четыре клеточные культуры: карцинома горла и рта (FaDu, Cal27), карцинома молочной железы (MB231), глиобластома (U-118-MG). Клетки всех четырех культур обрабатывали карнозином (40 мМ) и оставляли инкубироваться. Каждые два дня в течение 6 дней клетки подсчитывали и вычисляли время удвоения популяции (Td). Результаты действия карнозина (40 мМ) на пролиферацию исследуемых линий опухолевых клеток представлены на Рис. 3.2.1. Как следует из Рис. 3.2.1. карнозин приводил к увеличению Td всех исследованных клеточных линий. Для интактных клеток Td составляло: 18 ч (FaDu), 16 ч (Cal27), 22 ч (MB231) и 24 ч (U-118-MG). После инкубации с карнозином Td возрастало до: 19 ч (FaDu), 18 ч (Cal27), 26 ч (MB231) и 32 ч (U-118-MG). Увеличение Td под действием карнозина свидетельствовало о замедлении процессов клеточной пролиферации. Наибольшее увеличение Td было отмечено в клетках глиобластомы (Рис. 3.2.1).

Рисунок 3.2.1. Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы. Клетки обрабатывали карнозином (40 мМ) Время удвоения популяций (Td) вычисляли по формуле: Td=0.693t/ln(N_t/N₀), где t - время (дни), N₀ - начальное количество клеток, N_t - количество клеток ко дню t.

Различия в эффективности действия карнозина на опухолевые клетки могут быть связаны с различиями в экспрессии внутриклеточных ферментов, отвечающих за синтез и разрушение карнозина. В организме человека карнозин синтезируется с помощь фермента карнозинсинтетазы из в-аланина и L-гистидина с использованием энергии молекулы АТФ [6, 258]. Гидролиз карнозина на исходные аминокислоты осуществляется в основном с помощью сывороточной карнозиназы [9, 195].

Рисунок 3.2.2. Избирательность действия карнозина сочеталась с различиями в уровнях мРНК карнозин-синтезирующих (А) и карнозин-разрушающих (Б) ферментов в исследуемых клеточных культурах. Результаты ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК в клетках U-118-MG; n=3, p<0.05.

На Рис 3.2.2. представлены результаты измерения экспрессии генов карнозин-синтетазы и карнозиназы в исследуемых клеточных линиях, с помощью метода ПЦР в реальном времени. Из Рис. 3.2.2. видно, что в клетках U-118-MG уровень мРНК карнозин-синтазы был в 3,5 - 5 раз ниже, чем в клетках карцином (Рис. 3.2.2.А), а уровень мРНК карнозиназы, наоборот, был 4 - 6 раз выше (Рис. 3.2.2.Б). На основании этих данных можно предположить, что уровень эндогенного карнозина в клетках глиобластомы изначально ниже, чем в клетках карцином. Изначально низкий уровень карнозина в клетках глиобластомы, вероятно, обуславливает их большую чувствительность к антипролиферативному эффекту карнозина, в то время как высокий уровень карнозина в клетках карцином способствует развитию в них толерантности рост-ингибирующему действию карнозина. Поскольку наиболее выраженный антипролиферативный эффект карнозина был получен на клетках глиобластомы человека U-118-MG, эти клетки были использованы в дальнейших исследованиях.

Для более подробного изучения антипролифативного действия карнозина, клетки U-118-MG инкубировали в среде, в которую добавляли 20-100 мМ карнозина и измеряли Td. На Рис. 3.2.3. представлены результаты подробного анализа влияния карнозина на пролиферацию клеток глиобластомы. Было выяснено, что карнозин приводит к дозо-зависимому увеличению Td клеток U-118-MG, что согласовывалось с полученными ранее данными (Рис. 3.2.1). Td в контроле составляло 35 ч, в присутствии 50 мМ карнозина Td снижалось до 66 ч. Пролиферация была полностью подавлена в пробах обработанных 80 мМ и 100 мМ карнозина (Рис. 3.2.3.А).

Ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию клеток U-118-MG был подтвержден результатами измерения способностей клеток формировать колонии, то есть делиться. Результаты анализа выживаемости представлены на Рис. 3.2.3.Б. Из полученных дынных видно, что инкубация клеток глиобластомы с карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч приводила к снижению их выживаемости. Выживаемость клеток U-118-MG, обработанных 100 мМ карнозина, снижалась до 60% по сравнению с контролем (Рис. 3.2.3.Б).

Рисунок 3.2.3. Карнозин дозо-зависимо подавляет пролиферацию клеток глиобластомы. (А) Кривые роста клеток U-118-MG в контроле и при добавлении к среде культивирования 20 - 100 мМ карнозина. Td рассчитывали, как описано на Рис. 3.2.1. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05. (Б) Выживаемость клеток оценивали по способности формировать колонии. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от выживаемости в контроле; n=3, p<0.05.

Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин оказывает ингибирующее действие на пролиферацию клеток глиобластомы (U-118-MG), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231). Наиболее выраженный эффект наблюдали в клетках глиобластомы. Избирательность действия карнозина может быть связана с пониженным уровнем экспрессии карнозин-синтетазы и повышенным уровнем экспрессии карнозиназы в клетках глиобластомы по сравнению с клетками карцином.

3.2.2 Карнозин снижает уровень АФК и индуцирует экспрессию MnСОД

АФК принимают активное участие в регуляции клеточной пролиферации. Изменения внутриклеточного уровня АФК часто приводит к нарушениям пролиферативных процессов [24, 25, 67, 174]. Карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, то есть способен влиять на внутриклеточный уровень АФК [15, 207, 215, 259]. Для того чтобы выяснить, связано ли замедление пролиферации глиобластомы под действием карнозина с изменениями внутриклеточного уровня АФК, клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч и измеряли уровень АФК с помощью проточного цитометра по степени окисления флуоресцентного красителя DCFH₂-DA.

Рисунок 3.2.4. Карнозин снижает уровень АФК в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. Уровень АФК измеряли, как с описано на Рис. I.2. Результаты представлены в виде среднего значения флуоресценции, рассчитанного относительно контроля. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня АФК в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.2.4. показано влияние карнозина на уровень АФК в клетках U-118-MG. Как следует из Рис. 3.2.4, карнозин приводил к дозо-зависимому понижению уровня АФК в клетках U-118-MG. Клетки, обработанные 50 - 100 мМ карнозина, содержали на 15 - 20% меньше АФК, чем клетки в контроле.

Уровень внутриклеточных АФК контролируется антиоксидантной системой клетки. Снижение уровня АФК возможно как в результате прямого эффекта карнозина, так и при активации антиоксидантных ферментов под действием карнозина. На сегодняшний день прямой антиоксидантный эффект карнозина установлен и хорошо описан в литературе [14, 16, 18, 19]. Для изучения действия карнозина на антиоксидантные ферменты клеток U-118-MG были выбраны два основных антиоксидантных фермента - митохондриальная супероксиддисмутаза (MnСОД) и каталаза. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч, затем измеряли активность и экспрессию MnСОД и каталазы.

Рисунок 3.2.5. Карнозин индуцирует экспрессию MnСОД в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (25 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А) Активность MnСОД, измеренная с помощью метода белкового электрофореза в неденатурирующем геле. (Б, В) Уровень белка MnСОД измеряли методом иммуноблоттинга, актин использовали для нормирования количества белка. (Г) Уровень мРНК MnСОД, измеренный с помощью метода ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК MnСОД в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.2.5.А. представлены результаты измерения активности MnСОД с помощью метода электрофореза в неденатурирующем геле. В данной работе было впервые показано, что инкубация клеток глиобластомы с карнозином усиливает активность MnСОД. Активность MnСОД в клетках обработанных карнозином (50 - 100 мМ) была в 3,3 - 3,6 раз выше, чем в контроле (Рис. 3.2.5.А). Отсутствие изменений в активности цитозольной супероксиддисмутазы (CuZnСОД) (Рис. 3.2.5.А) позволяет предположить, что антипролиферативный эффект карнозина связан со снижением уровня АФК, генерируемых в митохондриях. С помощью метода иммуноблоттинга было выявлено, что повышение активности MnСОД сопровождалось увеличением уровня белка MnСОД. Клетки обработанные карнозином (50 и 100 мМ) содержали в 1,4 - 1,6 раз больше белка MnСОД, чем клетки в контроле (Рис. 3.2.5.Б). Исследование временной зависимости увеличения уровня MnСОД под действием карнозина выявило, что добавление карнозина в концентрации 50 мМ индуцирует увеличение уровня белка MnСОД через 16 ч (Рис. 3.2.5.В). Измерение уровня мРНК MnСОД методом ПЦР в реальном времени показало, что увеличение количества белка MnСОД сопровождалось увеличением мРНК MnСОД. Уровень мРНК MnСОД в клетках обработанных 50 и 100 мМ карнозина был в 1,5 - 2,5 раза выше, чем в контроле (Рис. 3.2.5.Г).

На Рис. 3.2.6. представлены результаты исследования действия карнозина на активность и экспрессию каталазы. Активность каталазы измеряли с помощью биохимического метода на спектрофотометре. Уровень белка определяли с помощью метода иммуноблоттинга. Активность каталазы в контроле составляла 4 мк ед/мг. Клетки обработанные 50 мМ карнозина не демонстрировали каких-либо изменений активности каталазы по сравнению с контролем. В то время как в клетках обработанных 100 мМ карнозина активность каталазы снижалась до 1,5 мк ед/мг (Рис. 3.2.6.А). Снижение активности каталазы сопровождалось соответствующим уменьшением уровня белка. В клетках обработанных 100 мМ карнозина уровень белка каталазы составлял 60% от контрольного уровня (Рис. 3.2.6). Снижение активности каталазы часто приводит к росту прооксидантного уровня, главным образом Н₂О₂. Поскольку роста Н₂О₂ под действием карнозина не происходило, было предположено, что исходное содержание каталазы в клетках U-118-MG настолько мало, что снижение ее активности не оказывает значительного влияния на антиоксидантный эффект карнозина.

Рисунок 3.2.6. Карнозин ингибирует экспрессию каталазы в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А) Активность каталазы измеряли с помощью биохимического метода. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от активности каталазы в контроле; n=3, p<0.05. (Б) Уровень белка каталазы измеряли методом иммуноблоттинга, актин использовали для нормирования количества белка.

Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин проявляет антиоксидантные свойства в клетках глиобластомы U-118-MG. Карнозин снижал внутриклеточный уровень АФК и усиливал активность и экспрессию антиоксидантного фермента MnСОД.

3.2.3 Карнозин индуцирует G₂ блок и усиливает экспрессию циклина В1

Для того чтобы выяснить, является ли антипролиферативный эффект карнозина результатом изменений в прогрессии клеточного цикла, клетки U-118-MG обрабатывали карнозином (20 - 100 мМ) в течение 24 ч и измеряли количество клеток в G₁, S и G₂ фазах с помощью двухпараметрического анализа.

Рисунок 3.2.7. Карнозин индуцирует G₂ блок в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (20 - 100 мМ) в течение 24 ч, метили БДУ и измеряли количество БДУ-положительных (S фаза) и БДУ-отрицательных (G₁ и G₂ фазы) клеток с помощью проточного цитометра. (А) Пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла. (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.2.7.А. представлен типичный пример распределения клеток U-118-MG по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с карнозином. Как видно из Рис. 3.2.7.Б. инкубация с карнозином (20 - 100 мМ) приводила к дозо-зависимому увеличению количества клеток в G₂ фазе и сопровождалась уменьшением числа клеток в S фазе. Распределение в контроле составляло: G₁ - 39%, S - 44% и G₂ - 17% клеток. Карнозин в концентрации от 20 до 50 мМ не приводил к значительным изменениям в распределении клеток. Достоверно отличимый от контроля результат был получен в пробах обработанных карнозином в концентрации 80 - 100 мМ. Количество клеток в G₂ фазе увеличивалось до 39% относительно 17% в контроле, количество клеток в S фазе уменьшалось до 22% относительно 44% в контроле (Рис. 3.2.7.Б). Таким образом, было показано, что инкубация клеток U-118-MG с карнозином приводит к формированию G₂ блока в прогрессии клеточного цикла. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что карнозин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы за счет модификации прогрессии клеточного цикла через G₂ фазу.

Прохождение клетки через фазы клеточного цикла регулируется последовательной экспрессией циклинов. Циклин В1 специфически экспрессируется во время G₂ фазы [81]. Было показано, что индукция G₂ блока в присутствии некоторых антиоксидантов, например, витамина С, сопровождается усилением экспрессии циклина В1 [181]. Для того чтобы определить, сопровождается ли индуцированное карнозином накопление клеток в G₂ фазе с изменениями экспрессии циклина В1, клетки U-118-MG обрабатывали 50 и 100 мМ карнозина в течение 24 ч и измеряли уровень белка и мРНК циклина В1. Результаты иммуноблоттинга и ПЦР в реальном времени представлены на Рис. 3.2.8. Было показано, что инкубация с карнозином (50 и 100 мМ) индуцирует увеличение уровня белка циклина В1 в 2,5 - 4 раза (Рис. 3.2.8.А). Интересно отметить, что увеличение уровня белка циклина В1 по времени совпадало с ростом уровня MnСОД и происходило спустя 16 часов после добавления 50 мМ карнозина (Рис. 3.2.8.Б и 3.2.5.В). Данное наблюдение позволяет предположить существование взаимосвязи между антипролиферативным и антиоксидантным эффектами карнозина. Повышение уровня белка циклина В1 было сопряжено с небольшим увеличением уровня мРНК. В клетках обработанных 50 и 100 мМ карнозина уровень мРНК циклина В1 в 1,25 - 2 раза превышал значение в контроле (Рис. 3.2.8.В). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что антипролиферативный эффект карнозина является следствием активации экспрессии циклина В1 и остановки клеток в G₂ фазе клеточного цикла.

Рисунок 3.2.8. Карнозин усиливает экспрессию циклина B1 в клетках U-118-MG. Клетки инкубировали с карнозином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч. (А, Б) Уровень белка циклина В1 измеряли методом иммуноблоттинга, актин и НАДФН использовали для нормирования количества белка. (В) Уровень мРНК циклина В1 измеряли с помощью метода ПЦР в реальном времени. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от уровня мРНК циклина В1 в контроле; n=3, p<0.05.

Заключение II: Карнозин ингибировал пролиферацию опухолевых клеток человека, что согласовывалось с данными, полученными на клетках РС-12. Наиболее выраженный ингибирующий эффект карнозина наблюдали в культуре клеток глиобластомы, что возможно было связано с изначально низким уровнем эндогенного карнозина в этих клетках. В данной работе было впервые показано, что замедление пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного уровня АФК, усилением экспрессии MnСОД и циклина В1, а также накоплением клеток в G₂ фазе клеточного цикла. Полученные данные подкрепляют наше предположение о том, что карнозин ингибирует рост опухолевых клеток за счет усиления антиоксидантной защиты клетки и модификации клеточного цикла.

РАЗДЕЛ 3.3 Сравнение антипролиферативного эффекта карнозина с действием его производных

У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил-в-аланил-L-гистидин), анзерин (в-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Для оценки вовлеченности отдельных групп молекулы карнозина в антипролиферативный эффект, действие карнозина сравнивали с эффектом его производных. К среде культивирования клеток U-118-MG добавляли исследуемые соединения в концентрации 40 мМ и оставляли на инкубацию. Каждые два дня в течение 6 дней клетки считали и вычисляли Td, результаты подсчета представлены на Рис. 3.3.1.

Рисунок 3.3.1. Анзерин ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы U-118-MG эффективнее, чем другие производные карнозина. К среде культивирования добавляли дипептиды в концентрации 40 мМ и оставляли инкубироваться. Td рассчитывали как описано на Рис 3.2.1. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от Td в контроле; n=3, p<0.05.

Как следует из Рис. 3.3.1. все исследованные дипептиды приводили к удлинению Td, однако в разной степени, что свидетельствует о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Ацетил-карнозин обладал наименее выраженным эффектом, увеличивая Td клеток глиобластомы лишь на 3 ч по сравнению с контролем. Td клеток обработанных гомокарнозином и карнозином было примерно одинаковым и превышало контрольное значение на 6 - 7,5 ч. Анзерин ингибировал пролиферацию сильнее, чем остальные соединения. Td клеток обработанных анзерином было на 12 ч длиннее по сравнению с контролем. Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи между структурой дипептида и эффективностью ингибирования пролиферации. Метилирование молекулы карнозина в положении 1N имидазольного кольца (анзерин) повышает эффективность действия молекулы на процессы клеточной пролиферации. Ацетилирование молекулы по свободной в-аминогруппе карнозина (ацетил-карнозин) приводит к снижению ее эффективности.

Для того чтобы выяснить, связано ли антипролиферативное действие анзерина с изменениями в прогрессии клеточного цикла, клетки обрабатывали 50 - 100 мМ анзерина в течение 24 ч, метили БДУ и измеряли распределение клеток по фазам клеточного цикла на проточном цитометре. На Рис. 3.3.2. продемонстрировано действие 50 - 100 мМ анзерина на прогрессию клеточного цикла клеток U-118-MG. Пример распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с анзерином показан на Рис. 3.3.2.А. результаты анализа процентного распределения представлены на Рис. 3.3.2.Б. Как следует из Рис. 3.3.2.Б, инкубация с анзерином приводила к перераспределению клеток по фазам клеточного цикла. Распределение в контроле составляло: 38% - G₁ фаза, 50% - S фаза и 12% - G₂ фаза, в пробах обработанных 100 мМ анзерина: 48% - G₁ фаза, 27% - S фаза и 25% - G₂ фаза. Клетки, обработанные 50 мМ анзерина, не демонстрировали каких либо отличий прогрессии клеточного цикла по сравнению с контролем. Кроме того, было отмечено достоверное увеличение количества клеток в G₁ фазе, с 38% в контроле до 48% в присутствии 100 мМ анзерина, что, возможно, является причиной более сильного эффекта анзерина по сравнению с карнозином. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что характер действия анзерина на клеточный цикл сходен с эффектом карнозина. Дополнительное понижение клеток в G₁ фазе под действием анзерина, возможно, является причиной более сильного эффекта анзерина по сравнению с карнозином.

Рисунок 3.3.2. Анзерин индуцирует G₂ блок в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали анзерином (50 - 100 мМ) в течение 24 ч, метили БДУ и анализировали с помощью проточного цитометра. (А) Пример распределения БДУ-положительных (S-фаза) и БДУ-отрицательных (G₁ и G₂ фазы) клеток в контроле и после инкубации с анзерином (100 мМ). (Б) Процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от количества клеток в контроле; n=3, p<0.05.

На Рис. 3.3.3. показано влияние гомокарнозина на прогрессию клеточного цикла клеток глиобластомы. Клетки обрабатывали гомокарнозином (100 мМ) в течение 24 ч и измеряли распределение клеток по фазам клеточного цикла на проточном цитометре согласно содержанию ДНК. Результаты измерений представлены на Рис. 3.3.3. Пример распределения клеток между G₀/G₁, S и G₂/М фазами показан на Рис. 3.3.3.А. Согласно результатам анализа процентного распределения клеток представленным на Рис. 3.3.3.Б, распределение в контроле составляло: 48% - G₀/G₁ фаза, 30,5% - S фаза и 22,5% - G₂/М фаза, после инкубации с гомокарнозином: 40% - G₀/G₁ фаза, 23% - S фаза и 37% - G₂/М фаза. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что гомокарнозин индуцирует G₂ блок в клетках U-118-MG. Ингибирующее действие гомокарнозина на пролиферацию клеток глиобластомы, вероятно, связано с изменениями в прогрессии клеточного цикла.

Рисунок 3.3.3. Гомокарнозин индуцирует G₂ блок в клетках U-118-MG. Клетки обрабатывали 100 мМ гомокарнозина в течение 24 ч. Содержание ДНК измеряли на проточном цитометре по интенсивности флуоресценции PI. (А) Пример распределения и (Б) процентное распределение клеток по фазам клеточного цикла в контроле и после инкубации с гомокарнозином. Звездочка обозначает статистически значимое отличие от контроля; n=3, p<0.05.

Заключение III: производные карнозина (ацетил-карнозин, анзерин и гомокарнозин) оказывают ингибирующее действие на пролиферацию клеток глиобластомы, однако с разной эффективностью. Метилирование карнозина повышало его антипролиферативные свойства, ацетилирование молекулы, наоборот, приводило к снижению эффективности действия карнозина. Снижение пролиферации глиобластомы под действием анзерина и гомокарнозина, сопровождалось изменениями в прогрессии клеточного цикла и формированием G₂ блока.

РАЗДЕЛ 3.4 Возможности применения карнозина в радиотерапии

На сегодняшний день лучевая терапия - один из наиболее эффективных способов лечения глиобластомы. Для того чтобы исследовать, последствия совместного применения карнозина и ионизирующего излучения, клетки обрабатывали карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассаживали в низких разведениях чашки Петри для формирования колоний.

На Рис. 3.4.1. показаны результаты совместного действия карнозина и ионизирующего облучения на гибель клеток глиобластомы. Примеры чашек Петри с колониями клеток сформированных в контроле, после инкубации с 100 мМ карнозина, облучения (4 Гр) и совместного действия карнозина и облучения показаны на Рис. 3.4.1.А. Результаты анализа выживаемости представлены на Рис. 3.4.1.Б. Как следует из Рис. 3.4.1.Б, подсчет количества колоний и расчет выживаемости показали, что инкубация клеток с 100 мМ карнозина приводит к снижению выживаемости клеток глиобластомы до 53% по сравнению с контролем (Рис. VI.Б). Облучение клеток при 4 Гр снижало выживаемость на 67%. Выживаемость клеток, подвергнутых совместному действию карнозина и ионизирующего излучения, составляло 17% от контроля. Таким образом, было продемонстрировано, что предварительная инкубация с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.

Рисунок 3.4.1. Предварительная инкубация с карнозином усиливает гибель клеток глиобластомы под действием ионизирующего облучения. Клетки инкубировали с карнозином (100 мМ) в течение 24 ч, облучали (4 Гр) и рассеивали в низких разведениях для формирования колоний. (А) Пример колоний, сформированных в контроле, после обработки карнозином, облучения или после совместного действия карнозина и облучения. (Б) Выживаемость рассчитывали, как описано на рисунке 3.2.3.Б. Звездочки обозначают статистически значимое отличие от выживаемости в контроле (*) или от проб, облученных при 4 Гр (**); n=3, p<0.05.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Карнозин представляет собой природный дипептид встречающийся в высокой концентрации в мышцах и мозге. Антипролиферативный эффект карнозина на трансформированнные и опухолевые клетки был впервые описан порядка 30 лет назад. Однако, механизм ингибирующего действия карнозина на пролиферацию опухолевых клеток до сих пор до конца не понятен. Целью данной работы было исследование механизма ингибирующего действия карнозина на пролиферацию опухолевых клеток. На сегодняшний день в литературе накоплено множество данных об участии про- и антиоксидантов в регуляции клеточной пролиферации. Поскольку, карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства мы предположили, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток является следствием его антиоксидантной активности. Мы обнаружили, что карнозин ингибирует пролиферацию клеток феохромоцитомы крысы (РС-12), глиобластомы человека (U-118-MG), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231) человека. Наиболее эффективно карнозин ингибировал пролиферацию клеток глиобластомы человека U-118-MG. В данной работе было впервые показано, что снижение пролиферации под действием карнозина сопровождается снижением уровня внутриклеточных АФК, усилением экспрессии MnСОД и циклина В1, а также накоплением клеток в G₂ фазе клеточного цикла. Метилированное производное карнозина, анзерин, ингибировал пролиферацию опухолевых клеток эффективнее, чем карнозин. В работе впервые было показано, что обработка клеток глиобластомы карнозином перед облучением приводит к снижению их выживаемости. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что карнозин ингибирует пролиферацию опухолевых клеток за счет активации антиоксидантной системы и модификации клеточного цикла. Метилирование карнозина приводит к усилению антипролиферирующего эффекта. Усиление гибели опухолевых клеток при совместном использовании карнозина и ионизирующего излучения открывает перспективы применения карнозина в терапии опухолевых заболеваний.

Подсчет общего количества клеток феохромоцитомы крысы РС-12 с помощью камеры Горяева выявил снижение количества клеток в пробах обработанных карнозином по сравнению с контролем (Рис. 3.1.1.A). Уменьшение количества клеток не сопровождалось увеличением количества некротических или апоптотических клеток (Рис. 3.1.1.A, 3.1.3.A), указывая на то, что снижение количества клеток происходит в результате замедления пролиферации, а не усиления клеточной гибели. Ингибирующее действие карнозина на пролиферацию клеток было подтверждено результатами измерения времени удвоения популяции. Карнозин увеличивал Td четырех исследованных культур опухолевых клеток человека (карциномы горла и рта (FaDu, Cal27), карцином молочной железы (MB-231), глиобластомы (U-118-MG)). Наибольшее удлинение Td наблюдали в клетках культуры глиобластомы (Рис. 3.2.1). Анализ воздействия разных концентраций карнозина на пролиферацию клеток глиобластомы выявил, что карнозин дозо-зависимо ингибирует рост клеток глиобластомы. Полученные данные подтверждались результатами измерения клеточной выживаемости (Рис. 3.2.3). Наши наблюдения согласовывались с результатами предыдущих работ, демонстрирующими антипролиферативное действие карнозина на клетки, изолированные из мозга больных мультиформной глиобластомой [21, 208]. Снижение количества клеток глиобластомы под действием карнозина не сопровождалось усилением некроза или апоптоза. В пробах, обработанных карнозином, процент клеток включивших БДУ был значительно меньше, чем в контроле, что свидетельствовало о замедление пролиферативных процессов под действием карнозина [208]. Кроме того, инъекции карнозина мышам с ксенографами HER2/neu NIH3T3 фибробластов снижали количество митозов в опухолях и существенно подавляли опухолевый рост [21]. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, был сделан вывод о том, что противоопухолевый эффект карнозина обусловлен ингибирующим действием карнозина на пролиферацию опухолевых клеток.

Причины повышенной чувствительности клеток глиобластомы к карнозину до конца не понятны и требуют дальнейшего изучения. Полученные нами данные позволяют предположить, что одной из причин могут быть различия в уровне эндогенного карнозина в исследованных клеточных культурах. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени обнаружено, что в клетках глиобластомы уровень мРНК карнозин-синтетазы ниже, чем в клетках карцином, а уровень мРНК карнозиназы, наоборот, выше (Рис. 3.2.2). Мы полагаем, что изначально низкий уровень эндогенного карнозина в клетках глиобластомы вследствие повышенного уровня карнозиназы и сниженного уровня карнозин-синтетазы, делает клетки U-118-MG более чувствительными к добавлению карнозина извне. Клетки карцином с изначально повышенным уровнем карнозина обладают своего рода резистентностью. Из данного предположения можно также сделать вывод о том, что антипролиферативный эффект карнозина обоснован присутствием молекулы целиком, а не составляющими ее аминокислотами. Результаты более ранних работ подтверждают данное предположение. Показано, что в-аланин сам по себе не проявляет неопластического эффекта, в то время как L-гистидин токсичен для всех типов клеток в концентрации выше 5 мМ [23, 260].

Измерение уровня АФК на проточном цитометре по степени окисления DCFH₂-DA выявило, что ингибирование пролиферации клеток РС-12 и U-118-MG под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного уровня АФК (Рис. 3.1.2 и 3.2.4). Наши наблюдения согласуются с опубликованными ранее данными, демонстрирующими корреляцию между снижением внутриклеточного уровня АФК и уменьшением количества клеток карциномы толстой кишки человека HCT116 под действием карнозина [209]. Показано, что внутриклеточный уровень АФК повышается по мере прогрессии клеток через клеточный цикл, позволяя предположить, что быстро пролиферирующие клетки находятся в более окисленном состоянии по сравнению с клетками, делящимися медленно [32, 33]. Высокий уровень АФК в опухолевых клетках, вероятно, является одной из причин их активной пролиферации [69]. Исходя из данных литературы и наших результатов, мы предполагаем, что снижение внутриклеточного уровня АФК в клетках РС-12 и U-118-MG под действием карнозина, способствует замедлению пролиферации клеток глиобластомы.

Интересно отметить, что усиление экспрессии карнозиназы (CN1) в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y приводило к снижению защитного действия карнозина от цитотоксического эффекта известного индуктора окислительного стресса, малонового диальдегида [9]. Таким образом, прослеживается параллель между ослаблением антипролиферативного эффекта и антиоксидантных свойств карнозина при усилении экспрессии карнозиназы, указывая на существование взаимосвязи между способностью карнозина снижать уровень АФК и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток.

При дальнейшем исследовании действия карнозина на антиоксидантную систему клеток глиобластомы было обнаружено, что карнозин изменяет активность, основных ферментов антиоксидантной системы клетки, MnСОД и каталазы. С помощью метода электорофореза в неденатурирующем геле было выявлено усиление активности MnСОД в клетках глиобластомы обработанных карнозином (Рис. 3.2.5.А). С помощью методов иммуноблоттинга и ПЦР в реальном времени было установлено, что усиление активности MnСОД сопровождается повышением уровня белка и мРНК MnСОД (Рис. 3.2.5.Б-Г). MnСОД представляет собой антиоксидантный фермент, локализованый в митохондриях и катализирующий реакцию дисмутации супероксида в пероксид водорода [50]. Ранее мы показали, что прогрессия клеточного цикла зависит от активности MnСОД: повышение активности MnСОД ингибировало клеточный рост, в то время как понижение активности MnСОД усиливало пролиферацию [27, 151, 261]. Более того, в нескольких исследованиях было продемонстрировано значительное снижение активности MnСОД в опухолевых клетках, что совпадало с повышенным внутриклеточным уровнем АФК и активной пролиферацией. Усиление экспрессии MnСОД ингибировало пролиферацию многих линий опухолевых клеток, в том числе клеток глиобастомы человека U-118 [30, 74, 75, 256, 262, 263]. В нашей работе, увеличение активности MnСОД при инкубации клеток глиобластомы с карнозином сопровождалось значительным удлинением времени удвоения популяции. Следовательно, можно предположить, что антипролиферативный эффект карнозина обусловлен его способностью усиливать экспрессию MnСОД и приводить к снижению уровня АФК.

Измерение активности цитозольной формы СОД (CuZnСОД) в контроле и после инкубации с карнозином не выявило каких-либо различий. Поскольку MnСОД представляет собой антиоксидантный фермент расположенный в матриксе митохондрий, исходя из полученных данных можно предположить, что антипролиферативный эффект карнозина является результатом изменения уровня АФК, генерируемых в митохондриях.

Интересно отметить работу Renner et al., которые показали, что уменьшение количества клеток глиобластомы в культуре под действием карнозина сопровождается снижением внутриклеточного количества АТФ и активности ЛДГ, что, по мнению авторов, являлось причиной замедления пролиферации опухолевых клеток [21, 208]. Ингибирование окислительного фосфорилирования с помощью KCN не влияло на выработку АТФ или выживаемость клеток глиобластомы, исходя из этого было предположено, что карнозин работает на уровне гликолиза, а не окислительного фосфорилирования [225]. Недавно Sarsour et al. продемонстрировали существование взаимосвязи между гликолизом и активностью MnСОД. Понижение активности MnСОД сопровождалось усилением интенсивности поглощения глюкозы, а усиление активности MnСОД, наоборот ингибировало гликолитические процессы [27]. Таким образом, можно предположить, что обнаруженное нами повышение активности MnСОД под действием карнозина является одним из механизмов ингибирующего действия карнозина на гликолиз, приводя к замедлению пролиферации опухолевых клеток.

Измерение активности каталазы в пробах обработанных карнозином выявило снижение ее активности в клетках глиобластомы обработанных карнозином по сравнению с контролем (Рис. 3.2.6). Снижение активности каталазы сопровождалось понижением уровня белка. Каталаза является важным участником антиоксидантной системы клетки, который катализирует реакцию разложения Н₂О₂ до воды и молекулярного кислорода. Таким образом, снижение активности каталазы должно приводить к повышению концентрации Н₂О₂, однако в нашей работе этого не наблюдалось. Более того, уровень АФК, наоборот, снижался. Возможно, это происходило потому, что изначальная активность каталазы была невелика (4 мк ед/мг). В то время как средняя активность каталазы в нормальных клетках на несколько порядков выше (примерно 5 ед/мг белка) [148]. Понижение активности каталазы в клетках глиобластомы с 4 до 2 мк ед/мг, вероятно, не вносило значительного вклада в повышение уровня Н₂О₂. Кроме того, снижение уровня АФК может объясняться включением компенсаторных механизмов, например усилением активности GPx, пероксиредоксинов и т.п.

Исследование влияния карнозина на прогрессию клеточного цикла клеток РС-12 и U-118-MG выявило, что замедление пролиферации под действием карнозина сопровождается увеличением количества клеток в G₂ фазе (Рис. 3.2.7). На сегодняшний день накоплен большой объем экспериментальных данных, указывающий на важность роли АФК в регуляции прогрессии клеточного цикла. Показано, что по мере прогрессии клеточного цикла от G₁ к митозу происходит увеличение уровня АФК и снижение активности MnСОД. Концентрация АФК максимальна в поздней S фазе и в G₂/M [26]. Активность MnСОД, наоборот, была максимальна в G₁ фазе и постепенно снижалась по мере прогрессии через S, G₂ и М фазы [27, 148, 150]. Повышение экспрессии MnСОД усиливало формирование G₂ блока индуцированное действием радиации в клетках карциномы [180]. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, мы предполагаем, что индуцированное карнозином снижение АФК и увеличение активности MnСОД приводят к нарушению внутриклеточного редокс-баланса, необходимого для прогрессии через G₂ фазу (повышенный уровень АФК и низкая активность MnСОД). В результате не происходит активации редокс-зависимых регуляторов G₂ фазы, что приводит к нарушению прогрессии клеточного цикла через G₂ фазу.

В нашей лаборатории было также показано, что карнозин замедляет рост уровня активной формы МАР-киназы ERK1/2 в условиях окислительного стресса индуцированного активацией глутаматных рецепторов [234, 236]. Активация ERK1/2 необходима для пролиферации клеток, ингибирование ERK1/2 приводило к остановке пролиферации и накоплению клеток в одной из фаз клеточного цикла [106]. Есть данные о том, что активность ERK1/2 изменяется в зависимости от состояния редокс. Например, усиление экспрессия MnСОД подавляло активацию ERK1/2 в клетках глиобластомы человека U87, указывая на возможность регуляции активности ERK1/2 с помощью антиоксидантов [28, 160]. Несмотря на то, что для проверки данной гипотезы, необходимо проведение множества дополнительных экспериментов, мы полагаем, что ингибирование ERK1/2 при активации MnСОД и снижении уровня АФК под действием карнозина, может быть одним из механизмов его антипролифативного эффекта.

Увеличение количества G₂ клеток сопровождалось усилением экспрессии циклина В1. Циклин В1 представляет собой функциональную субъединицу комплекса циклин В1/CDK1, который регулирует прогрессию клетки через G₂ фазу (Рис. 3.2.8) [131]. Экспрессия циклина В1 усиливается в поздней S-фазе, достигает максимума в G₂, и резко снижается в середине митоза. В G₁-фазе циклин В1 не детектируется [81]. Таким образом, увеличение уровня циклина В1 в пробах обработанных карнозином может быть следствием повышенного содержания клеток в G₂-фазе. С другой стороны, карнозин может напрямую активировать экспрессию циклина В1 независимо от индукции G₂-блока. Дополнительные исследования необходимы для изучения механизма активации экспрессии циклина В1 в ответ на действие карнозина.

Мы полагаем, что индукция G₂ блока под действием карнозина может быть также опосредована через фосфатазу Cdc25C, которая является редокс-чувствительным ферментом и играет важную роль в регуляции работы комплекса циклин В1/CDK1 [138, 177]. Thomas et al. показали, что низкомолекулярный антиоксидант витамин С индуцирует G₂ блок в клетках HeLa и T98G. При более подробном исследовании механизма данного явления было выявлено, что витамин С препятствует перемещению Cdc25C в ядро, а следовательно и активации комплекса циклин В1/CDK1 [181]. В результате, несмотря на наличие комплекса циклин В1/CDK1 в клетке прогрессии клеточного цикла не происходило. Нами также было замечено, что рост уровня циклина В1 начинался одновременно с ростом уровня белка MnСОД, подтверждая наше предположение о том, что увеличение активности MnСОД приводит к изменениям в прогрессии клеточного цикла и формированию G₂ блока. Исходя из наших данных, сопоставленных с данными литературы, был сделан вывод о том, что индуцированные карнозином изменения в соотношении внутриклеточных про- и антиоксидантов индуцирует G₂ блок и увеличивают уровень циклина В1.

У карнозина существует несколько природных производных, среди них: ацетил-карнозин (N-ацетил-в-аланил-L-гистидин), анзерин (в-аланил-3-метил-L-гистидин), гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин). Изучение структурно-функциональных особенностей карнозина и его производных в отношении подавления пролиферации опухолевых клеток может помочь оценить степень вовлеченности отдельных частей молекулы в исследуемый эффект карнозина. Исследование антипролиферативых свойств производных карнозина выявило, что все исследованные производные карнозина ингибировали пролиферацию опухолевых клеток. Эффективность действия исследованных дипептидов возрастала в следующем порядке: ацетил-карнозин < карнозин ? гомокарнозин < анзерин (Рис. 3.1.4.А, 3.3.1, 3.3.2, 3.3.3). Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в контроле и пробах обработанных дипептидами показал, что все исследованные вещества индуцируют накопление клеток в G₂ фазе клеточного цикла. Клетки U-118-MG обработанные анзерином также демонстрирововали небольшое увеличение количества клеток в G₁ фазе, что, возможно, было причиной более сильного антипролиферативного эффекта анзерина. Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что ацетилирование карнозина снижает его антипролиферативные способности, в то время как метилирование, наоборот, усиливает антипролиферативный эффект.