Вплив автокриотромболізата на ультраструктуру кон’юнктиви та склери кролів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив автокриотромболізата на ультраструктуру кон'юнктиви та склери кролів

Головними патогенетичними ланками, що сприяють формуванню міопії, згідно з даними літератури, є вплив внутрішньоочного тиску та різноманітні форми сполучнотканинної диспла - зії, які призводять до розтягнення послабленої склери. Протягом останніх років автори [1-3] ретельно вивчали роль пружно-пластичних властивостей фіброзної оболонки ока в процесі рефрактогенезу та вплив структурних морфологічних особливостей тканин, гідродинаміки і регіонарної гемодинаміки на патогенез міопії.

Відповідно до сучасної метаболічної теорії розвитку міопічного процесу, розлад трофіки задньої частини склери є наслідком порушення увеосклерального шляху відтоку в оці, яке акомодує, що з часом призводить до необоротної деформації задньої частини склери та, як наслідок, до збільшення аксіального розміру ока [4; 5].

З метою впливу на дану ланку патогенезу було запропоновано різноманітні склерозміцнювальні методики шляхом введення різних речовин, компонентів сполучної тканини, інгібіторів і проферментів, а також розроблено хірургічні методи склеропластики [6; 7]. Ефективність склеро - пластики ґрунтується на стимулюванні регіональної гемодинаміки внаслідок локального викиду вазоактивних речовин, розвитку новоутворених судин й асептичного запалення, а також стимулюванні росту сполучної тканини.

Запропонована Т.В. Баталовою [8] операція ін'єкційного типу полягала в одночасному введенні двох рідких компонентів (плазми і тромбіну) в теноновий простір, що приводило до формування згустка, який відповідав за своєю формою задньому відрізку очного яблука.

У джерелах літератури опубліковані результати досліджень щодо впливу препаратів кордової крові на динаміку розвитку різноманітних офтальмологічних патологічних процесів [9-11].

Однак варто зазначити, що одна з головних проблем у застосуванні клітинної терапії - це нестача достатньої кількості інформації щодо впливу на організм реципієнта клітинного трансплантату донора. Саме тому, з метою виключення проблем гістосумісності й імунної відповіді на трансплантаційний матеріал, більш виправданим є використання автологічного матеріалу, взятого від самого пацієнта. Одним із таких матеріалів може бути власна плазма, насичена концентратом тромбоцитів (PRP), які містять велику кількість біологічно активних речовин у своєму складі [12-15]. Збагачена тромбоцитами авто - логічна плазма (PRP) - доступний біологічний матеріал, який має регенеративні, трофічні та стимулювальні властивості. Однак, згідно з даними літератури, більшу біологічну активність виявляє автологічна плазма, насичена попередньо активованими тромбоцитами після кріолізи - суавтокріотромболізат (cryoPRP) [14; 15].

Мета роботи - дослідити особливості структурних змін очного яблука на світлооптичному й ультраструктурному рівнях за умов впливу авто - кріотромболізату (cryoPRP).

Матеріал взято від 8 статевозрілих кролів породи Шиншила масою 2,6-3,2 кг (9 очей), віком 4 міс. Кролі були розподілені на дві групи згідно із завданням експериментального дослідження: вивчити вплив автокріотромболізату кролів на фіброзну оболонку ока тварини.

Автокріотромболізат - це біологічний продукт, який отримують з автологічної крові, що має велику кількість різноманітних факторів росту, які містяться в тромбоцитах.

Препарат отримують у три етапи:

1) виділення концентрату тромбоцитів, а також «бідної» плазми;

2) лізис тромбоцитів під дією наднизьких температур (-196°С) і позбавлення «бідної» плазми від кріопреципітату шляхом глибокого заморожування;

3) отримання препарату автокріотромболізату із дефібринізованою автоплазмою як буферний розчин.

Концентрат тромбоцитів виділяють шляхом дворазового центрифугування крові тварини, взятої з антикоагулянтом (цитрат натрію або цитрат декстрози), у співвідношенні 9: 1. Після першого центрифугування плазма, що містить тромбоцити, відокремлюється від еритроцитів і лейкоцитів. Повторне центрифугування плазми дозволяє отримати пул тромбоцитів на дні пробірки та «бідну» на тромбоцити плазму.

Після видалення «бідної» плазми отриманий пул тромбоцитів переноситься до кріопробірки та заморожується в рідкому азоті за температури -196°С, а «бідна» плазма - при (-30±2)°С для дефібринізації.

Для завершення автокріотромболізату заморожений біоматеріал розморожують при 37°С. Потім «бідну» плазма центрифугують, а фібрин видаляють. У подальшому концентрат кріотромболізату ресуспензується в необхідній кількості буферного розчину дефібринізованої «бідної» плазми.

Перша група складалася із кролів, у яких ліве око слугувало контролем. У верхній квадрант субтенонового простору правого ока тварин першої групи було введено автокріотромболізат кролів об'ємом 0,5 мл одноразово. Після введення авто - кріотромболізату кролі були виведені з експерименту шляхом введення повітря в навколовушну вену, з подальшою енуклеацією очей через 2 тиж., 1,5 та 2,5 міс. після початку експерименту.

Друга група - 5 кролів, яким в обидва ока на початку експерименту в верхньому квадранті субтенонового простору було введено автокріо - тромболізат кролів об'ємом 0,5 мл одноразово. Через 2 тиж. після введення автокріотромболіза - ту кролям під загальною анестезією тіопенталом натрію було проведено оперативне втручання: розтин кон'юнктиви у верхньому квадранті в 3 мм від лімба, рифлення склери з введенням ін - трасклерально автокріотромболізату, накладанням П-подібного шва нейлон 8/0 Alcon та введенням в субтеноновий простір над зоною рифлення гіалуронової кислоти 0,1 мл (Гіарал-плюс), на розтин кон'юнктиви було накладено безперервний шов нейлон 8/0 Alcon. Після оперативного втручання кролям протягом 5 днів проводили інстиляцію сульфацилу натрію 15% 4 рази на добу в обидва ока. Кролі були виведені з експерименту аналогічним методом, як і кролі першої групи, через 1,5 та 2,5 міс.

Вивчали ультраструктуру кон'юнктиви та ділянки епісклери, фотографували об'єкти в електронному мікроскопі ПЕМ-100-01 (Україна).

Для електронно-мікроскопічного дослідження шматочки тканин фіксували у 2,5% розчині глю - таральдегіду на фосфатному буфері при значенні рН 7,4 з додатковою дофіксацією 1% розчином осмієвої кислоти при тому ж рН буферного розчину. Потім зразки зневоднювали в спиртах висхідної концентрації. Просочення тканин та їхню полімерізацію проводили в суміші епоксидних смол епон-аралдит. Контрастування ульт - ратонких зрізів відбувалось за методикою Reynolds [16]. Робота виконана в групі електронної мікроскопії лабораторії патологоанатомічних і електронно-мікроскопічних досліджень ДУ «Інститут очних хвороб та тканинної терапії ім. В.П. Філатова НАМН України» під керівництвом канд. біол. наук, ст. н. с. Н. І. Молчанюк.

Вплив на структури ока субкон'юнктивального введення автокріотромболізату. У результаті проведених досліджень встановлено, що субкон'юнктивальне введення автокріотромболізату сприяє формуванню щільної неоформленої сполучної тканини в субепітеліальному шарі. При цьому відмічається активація фібробластів, а сполучнотканинні елементи являють собою пучки колагенових волокон, орієнтованих уздовж склеральної капсули без виражених ознак запальної реакції.

Через два тижні після введення під кон'юнктиву автокріотромболізату виявили набряк субепі - теліального шару кон'юнктиви зі скупченням сіткоподібного слабоеозинофільного однорідного матеріалу, інфільтрованого дифузно розподіленими фібробластоподібними клітинами, які мають веретеноподібну форму з паличкоподібним інтенсивно забарвленим ядром. Ці клітини орієнтовані паралельно, а між ними визначається міжклітинний матеріал, який являє собою пластинки колагенових волокон, занурених у муко - полісахариди. При цьому між наведеними структурними елементами визначаються щілиноподібні невеликі ділянки скупчення серозної рідини. Будь-яких ознак запальної реакції підепітеліального сполучнотканинного шару кон'юнктиви, її епітелію і прилеглих шарів склери не виявлено. Кон'юнктивальний епітелій на всьому протязі без істотних структурних змін, за винятком незначної ексфоліації його поверхневих шарів. Не виявлено структурних змін внутрішніх шарів склери, строми, м'язів і епітелію війкового тіла та кореня райдужної оболонки, розташованих у проекції введення автокріотромболізату.

Через 1,5 міс. після субкон'юнктивального введення автокріотромболізату відзначаються зникнення набряку кон'юнктиви та лімфоїдна інфільтрація її стромальної частини з ознаками гіперплазії фіброцитів і формуванням пучків колагенових волокон різної щільності в різних ділянках. Подібні зміни відзначалися і в епісклері поблизу місця введення автокріотромболізату. Склера без істотних змін. Винятком є ділянки скупчення невеликих лімфоїдних інфільтратів, розташованих навколо нечисленних кровоносних судин.

На ультраструктурному рівні через 1,5 міс. після введення автокріотромболізату ділянка між епісклерою і м'язами заповнена пухкою волокнистою сполучною тканиною, яка складається з пучків колагенових волокон і значної кількості клітин. Розшарування колагенових волокон нерівномірне: місцями вони лежать щільно і між ними виявляються поодинокі фібробласти; подекуди серед пухко розташованих колагенових волокон визначаються лімфоцити, плазматичні клітини, макрофаги, фібробласти з довгими відростками; інколи колагенові фібрили або окремі колагенові волокна розташовані пухко між клітинами гістоцитарного ряду. Ці клітини лежать скупчено, у вигляді шару або зібрані в ланцюжок, на окремих ділянках вони щільно контактують між собою своїми плазмолемами. Серед клітин цієї зони переважають: лімфоцити, макрофаги, поодинокі лейкоцити. Фібробласти в активному стані з довгими відростками тут в невеликій кількості. Вони розташовані вільно в електронно-світлій безструктурній ділянці, поруч з їхньою плазмолемою - поодинокі колагенові фібрили.

Через 2,5 міс. після субкон'юнктивального введення автокріотромболізату характер світло - оптичних змін структур ока поблизу місця введення зберігається, але фіброз субепітеліального шару кон'юнктиви та епісклери більш виражений. На ультраструктурному рівні в зоні епісклери розташована велика кількість колагенових волокон, які місцями лежать щільно, подекуди пухко, інколи визначаються окремі довгі поодинокі колагенові фібрили. Між колагеновими волокнами спостерігаються великі фібробласти в активному стані, які мають довгі відростки. Виявлені також окремі великі міофібробласти, а також поодиноко інші сполучнотканинні клітини. Загалом у даній ділянці відбувається активний процес формування сполучнотканинних волокон. При цьому колагеноутворення спостерігали не тільки в субкон'юнктивальному шарі, а й епісклерально. Ознаки запальної реакції відсутні (рис. 1).

Вплив на структури ока субкон «юнктивального та інтрасклерального введення автокріотромболізату, рифлення склери. Патоморфологічні зміни після рифлення склери в різних ділянках відрізнялися. У деяких ділянках відмічалися частково організовані крововиливи, що супроводжувалися гемолізом еритроцитів і скупченням фібробластоподібних клітин. В інших місцях спостерігалася більш виражена організація сполучної тканини на межі епісклери і склери з формуванням щільної волокнистої тканини. Місцями між пучками новоствореної волокнистої тканини в епісклері відмічалася запальна інфільтрація середнього ступеня вираженості, яка іноді супроводжувалася дистрофічними змінами епісклери і зовнішніх шарів склери. Електронно-мікроскопічно, через 1,5 міс. після початку експерименту, між епісклерою і м'язом, виявлявся шар із сполучнотканинних клітин, які щільно контактували між собою. У поодиноких випадках між ними проходили електронно-щільні тяжі, які містили фібрилярний матеріал. Місцями розташовувалися тяжі з колагенових волокон, частина яких з ознаками деструктивних змін. У зазначеній зоні багато як плазматичних клітин і макрофагів, так і лімфоцитів. На інших ділянках спостерігалися лише колагенові волокна і фібробласти в активному стані.

Рис. 1. Ультраструктура ділянки між епісклерою та м'язом через 2,5 міс. після субтенонового введення автокріотромболізату. Фібробласт з довгим відростком і лімфоцит серед пухко розташованих колагенових волокон. Електронна мікрофотографія: х 5000. Умовні позначення: КВ - колагенові волокна; ЛЦ - лімфоцит; ФБ - фібробласт

Через 2,5 міс. після початку експерименту виражених ультраструктурних змін склери не спостерігали, однак виявлені ознаки запалення в епі - склері; знову утворена сполучна тканина не структурована порівняно з групою тварин, у якій не виконували рифлення склери (рис. 2).

Таким чином, аналіз матеріалу показав, що після субкон'юнктивального введення автокріотромболізату, у ділянці між епісклерою та м'язом, активно формуються колагенові волокна пухкої сполучної тканини за рахунок збільшення кількості фібробластів й активації їхніх білоксинтезувальних процесів. Тим же часом у самій склері, у цитоплазмі окремих склероцитів також визначаються ознаки підвищення білоксинтезувального процесу, що, можливо, пов'язано з місцевим ушкодженням колагенових волокон склери або з цілеспрямованою дією автокріотромболізату.

У наших попередніх роботах ми з'ясували, що при прогресуванні міопії порушується архітектоніка колагенових волокон склери [2], а, згідно з даними літератури, існуючі методики поєднаного з рифленням склери. Тяжі електронно - щільного однорідного матеріалу, де розташовані колагенові фібрили, між якими скупчення плазматичних клітин, макрофагів, лейкоцитів та фібробластів. Електронна мікрофотографія: х 3000. Умовні позначення: ПК - плазматична клітина; МФ - макрофаг; ФБ - фібробласт; Л - лейкоцит зміцнення склери недостатньо ефективні [6-8]. Отже, виявлена здатність автокріотромболізату при субкон' юнктивальному введенні стимулювати упорядковане формування колагенових волокон може стати підґрунтям для розробки нових методів профілактики прогресування міопії.

Рис. 2. Ультраструктура склери кроля через 1,5 міс. після інтрасклерального введення автокріотромболізату

Субкон'юнктивальне введення автокріотромболізату, між епісклерою та м'язом, спричиняє посилення процесів колагеноутворення. При цьому відмічається активація фібробластів, а сполучнотканинні елементи являють собою пучки колагенових волокон, орієнтованих уздовж склеральної капсули без виражених ознак запальної реакції.

За умов субкон'юнктивального та інтраскле - рального введення автокріотромболізату разом з рифленням склери спостерігали різноспрямова - ні зміни склери, кон'юнктиви, епісклери: поруч з ділянками активації фібробластів і формування колагенових волокон виявлені зони з ознаками запалення в епісклері, дистрофічними змінами епісклери і зовнішніх шарів склери.

Автокріотромболізат крові, за умов субкон'юнктивального введення між епісклерою та м'язом, сприяє фізіологічному упорядкованому формуванню колагенових волокон, що приводить до склерозміцнення у кролів за умов експерименту, та може бути підґрунтям для подальших досліджень можливості використання даного методу в клінічних умовах при міопії.

Література

автокріотромболізат епісклера фібробласт

1. Светлова О.В. Функциональные особенности взаимодействия склеры, аккомодационной и дренажной систем глаза при глаукомной и миопической патологии: дис…. д-ра мед. наук. Москва, 2010. 319 с.

2. Ульянова Н.А., Думброва Н.Е., Молчанюк Н.И. Морфологические изменения склеры при моделировании миопии. Морфологія. 2014. Т. 8, №2. С. 72-76.

3. Шаргородська І. В. Роль біомеханічних властивостей фіброзної оболонки ока при аномаліях рефракції та керато - конусі: автореф. дис…. д-ра мед. наук: 14.01.18. Київ, 2017. 38 с.

4. Ланцевич А.В. О метаболической теории патогенеза приобретенной близорукости. Глаз. 2008. №4. С. 26-27.

5. Кошиц И.Н., Светлова О.В. Дискуссионные вопросы приобретенной миопии. Офтальмологический журнал. 2012. №6. С. 112-124.

6. Укрепление склеры при прогрессирующей близорукости синтетическим трансплантатом, обладающим биологически активными свойствами / Е.П. Тарутта и др. Глаз. 2007. №1. С. 14-22.

7. Паштаев Н.П., Арсютов Д.Г. Использование медицинских клеев в хирургии прогрессирующей миопии и отслойки сетчатки. Офтальмохирургия. 2009. №3. С. 16-20.

8. Баталова Т.В. Введение фибринообразующих компонентов крови в теноново пространство с целью стабилизации прогрессирующей близорукости: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.08. Ленинград, 1988. 22 с.

9. Демин Ю.А., Петренко А.Ю., Литвинова Л.В. Эффективность применения криоконсервированных эмбриональных нейрональных клеток в комплексном лечении склеротических макулодистрофий. Проблемы криобиологии. 2004. №2. С. 89-93.

10. Результаты применения фетоплацентарного препарата Гемокорд при лечении дистрофических и сосудистых заболеваний сетчатки и зрительного нерва / Л.В. Венгер и др. Філатовські читання: матеріали наук.-практ. конф. офтальмологів з міжнар. участю, присв. 80-річчю тканинної терапії за методом академіка В.П. Філатова. Одеса, 2324 травня 2013 року. Одеса, 2013. С. 120-121.

11. Ульянова Н.А., Венгер Л.В. Эффективность применения препаратов кордовой крови при высокой осложненной миопии. Офтальмология. Восточная Европа. 2014. №2 (21). С. 147-154.

12. Pacifici L., Casella F., Maggiore C. Platelet rich plasma (PRP): potentialities and techniques of extraction. Minerva Sto - matol. 2002. Vol. 51, №7/8. Р. 341-350.

13. Thermosensitive eyedrops containing platelet lysate for the treatment of corneal ulcers / G. Sandri et al. Int. J. Pharm. 2012. Vol. 426, №1/2. Р. 1-6.

14. Use of Platelet-Rich Plasma for Collagen Matrixes Revitalization with Human Fibroblast / M.S. Makarov et al. Journal of Biosciences and Medicines. 2015. Vol. 3, №10. Р. 80-87.

15. Цепколенко В.О., Пихтєєв Д.М., Запорожченко П.О. Спосіб малотравматичного закриття перфорації барабанної перетинки: пат. 98962 Україна, МПК (2015.01): A61B 17/ 00 / заявник та патентовласник Цепколенко В.О. № u 2014 13323; заявл. 12.12.2014; опубл. 12.05.2015, Бюл.

16. Reуnoldes E.S. The use of lead citrate at high pH an electronopaque stain in electron microscopy. I. of Cell Biol. 1963. Vol. 17. P. 208-212.

Размещено на Allbest.ru