Вплив похідних 1,2,4-триазолу на сполучені системи: відновлені тіоли/no in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 616.12-008.331.1:616-092.41-085.615.225.2.615.036.6

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

Вплив похідних 1,2,4-триазолу на сполучені системи: відновлені тіоли/no in vitro

Нагорна О.О.

Анотація

антиоксидантний нейрон інкубаційний динітрозильний

Проводили дослідження антиоксидантних властивостей та впливу на тіол-дисульфідну систему суспензії нейронів в дослідах in vitro за умов моделювання оксидативого та нітрозуючого стресу шляхом додавання до інкубаційного середовища динітрозильного комплексу заліза в токсичній концентрації 250 ммоль/л за Методичними рекомендаціями ДЕЦ МОЗ України. При нітрозуючому оксидативному стресі в нейрональній суспензії встановили зростання вмісту показників окислювальної модифікації білків (АФГ, КФГ), окислювального глутатіону, нітротирозину та пониження антиоксидантної активності, активності глутатіонредуктази, глутатіон-трансферази та рівня відновленого глутатіону. Додавання в суспензію нейронів 11 тіолвміщуючих сполук показало, що всі використані сполуки, за винятком двох, за антиоксидантною активністю перевищували референт-препарати - метіонін, унітіол, тіосульфат натрію, дибунол, альфа-токоферол. Тіолвміщуючі сполуки понижували вміст нітротирозину, стабільного ендогенного продукту окиснення пероксинітриту, що використовується в якості маркера пошкодження. Тіолвміщуючі сполуки понижували вміст окисненого глутатіону та підвищували відновленого, який розглядається як інгібітор активних форм кисню. Тіолвмісні сполуки, особливо тіотриазолін та ангіолін, зберігали активність глутатіон-трансферази та глутатіонредуктази, що стверджує їх антиоксидантну дію.

Ключові слова: тіолвмісні сполуки, нітрозуючий, оксидативний стрес, маркери окислювального пошкодження білків, тіолдисульфідна система та система оксиду азоту.

Реферат

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1,2,4-ТРИАЗОЛА НА СОВМЕЩЕННЫЕ СИСТЕМЫ: ВОССТАНОВЛЕННЫЕ ТИОЛЫ/NO IN VITRO Нагорная E.A.

Проводили исследования антиоксидантных свойств и влияния на тиол-дисульфитную систему суспензии нейронов в экспериментах in vitro в условиях моделирования оксидативного и нитрозирующего стресса путем внесения в инкубационную среду динитрозильного комплекса железа в токсической концентрации 250 ммоль/л согласно Методическим рекомендациям ДЭЦ МЗ Украины. При нитрози- рующем оксидативном стрессе установили в нейрональной суспензии повышение содержания показателей окислительной модификации белков (АФГ, КФГ), окисленного глутатиона, нитротирозина и понижение антиоксидантной активности, активности глутатионредуктази, глутатион^-трансферазы и уровня восстановленного глутатиона. Внесение в нейрональную суспензию 11 тиолсодержащих соединений показало, что все используемые соединения, за исключением двух, по антиоксидантному действию превышали референт-препараты - метионин, унитиол, тиосульфат натрия, дибунол, альфа-токоферол. Тиолсодержащие соединения понижали содержание нитротизорина, стабильного эндогенного продукта окисления пероксинитрита, что используется в качестве маркера NO-зависимого повреждения. Тиолсодержащие соединения снижали содержание окисленного глутатиона и повышали восстановленного, который рассматривается как ингибитор активных форм кислорода. Тиолсодержащие соединения, особенно тиотриазолин и ангиолин, сохраняли активность глутатион-S- трансферазы и глутадионредуктазы, что подтверждает их антиоксидантное действие.

Ключевые слова: тиолсодержащие соединения, нитрозирующий, оксидативный стресс, маркеры окислительного повреждения белков, тиол-дисульфидная система, система оксида азота.

Summary

INFLUENCE OF 1,2,4-TRIAZOL DERIVATIVES ON COMBINATIVE SYSTEMS: REDUCED THIOLS/NO IN VITRO Nagornaya Ye.A.

It has been found out that the triazol derivative thiotriazolinum possesses cardio-, neuro-, hepatoprotec- tive action. It has been shown that functional disturbances are connected with endothelial dysfunction and the changing in thiol-disulfide system markers and the nitric oxide system. The aim of the study is to carry out screening of 1,2, 4-triazole derivatives by their antioxidant action and influence on the thiol-disulfide neuron system in oxidative and nitrosative stress. We studied antioxidant properties and effects on the thiol- disulfite system of neuron suspension in experiments in vitro by modelling of oxidative and nitro-oxidative stress by introducing the iron dinitrosyl complex in a toxic concentration of 250 mmol/l into the incubation medium according to the Methodological Recommendations of the Ukrainian Ministry of Public Health. During nitro-oxidative stress, we found an increase in the content of oxidative modification parameters of proteins (APG, KFG), oxidized glutathione, nitrotirozine and reduction of antioxidant activity, glutathione reductase activity, glutathione-S-transferase and the level of reduced glutathione in the neuronal suspension. The introduction of 11 thiol-containing compounds into the neuronal suspension showed that all the compounds used, with the exception of two, had antioxidant effects exceeding the reference drugs as methionine, unitiol, sodium thiosulfate, dibunol, and alpha-tocopherol. Thiol-containing compounds reduced the content of nitro- tisorin, a stable endogenous oxidation product of peroxynitrite, which is used as a marker for NO-dependent damage. Thiol-containing compounds lowered the content of oxidized glutathione and increased the content of reduced oxidized glutathione, which is considered as an inhibitor of reactive oxygen species. Thiol- containing compounds, especially thiotriazolin and angiolin, retained the activity of glutathione-S-transferase and glutathione reductase that confirms their antioxidant effect.

Key words: thiol-containing compounds, nitro-oxidative stress, markers of protein oxidative damage, thiol disulfide system, nitric oxide system.

В Запорізькому державному медичному університеті проводився цілеспрямований пошук біологічно активних сполук серед п'яти- та шестичленних азагетероциклічних сполук і їх конденсованих аналогів. Внаслідок цих досліджень серед похідних триазолу був виявлений лікарський засіб, який отримав назву «тіотриазолін». Тіотриазолін - високоактивний препарат з широким спектром дії, що має кардіо-, нейро- та гепатопротекторну дію [6]. Встановлено, що порушення метаболізму і функції життєво важливих органів пов'язані з дисфункцією ендотелію, яка, в свою чергу, обумовлена зміщеннями тіолдисульфідної системи та системи оксиду азоту [4], що є підставою для застосування тіолових сполук для попередження змін метаболізму і функції ендотелію[1]. Тому пошук нових ендоте- ліопротекторів доцільно проводити серед похідних триазолу з урахуванням їх впливу на маркери окислювального пошкодження білків та тіол- дисульфідної системи [2].

Мета дослідження

Провести скринінг похідних 1,2,4-триазолу за наявністю дії та впливу на тіол-дисульфідну систему нейронів при оксидативному і нітрозуючому стресі in vitro.

Матеріали і методи дослідження

Для досліджень in vitro використовували 95 безпородних білих щурів-самців у віці 4 тижнів і масою 80 - 100 г., що утримувалися у віварії НМУ ім. О.О. Богомольця відповідно до положень Європейської конвенції про захист безхребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 2005), «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», ухвалених П'ятим національним конгресом з біоетики, Київ, 2013.

Виділення збагачених фракцій нейронів і нейроглії проводилось у два етапи. На першому етапі мозкова тканина дезінтегрується з метою одержання клітинної суспензії, на другому - здійснюється диференціальне ультрацентрифугування у градієнті щільності сахарози і фіколу. Для одержання нейронів і нейроглії щурів декапітують і швидко вилучають мозок. Кору головного мозку відокремлюють від білої речовини, подрібнюють і переносять у розчин, що містить 7,5% полівінілпіролідону (ПВП), 1% бичачий сироватковий альбумін (БСА) і 10 мМСаСІ₂. Отриману суспензію фільтрують через три сита під невеликим тиском для зменшення втрат нейрональних клітин. Після послідовного пропускання через сита клітинну суспензію нашаровують на градієнт, що складається з 2 видів сахарози -- 1М і 1,75М. Центрифугування проводять при 60000g протягом 15 хв (при температурі 10°С). У результаті центрифугування одержують два шари і щільний осад. Верхній шар представлений залишками мієлінових оболонок, другий шар складається з гліальних і нейрональних клітин. Осад, представлений тілами нейронів, відповідав ступеню чистоти 90%. Надалі проводять додаткове очищення другого шару шляхом другого фільтрування й ультрацентрифугування. Виділені нейрональні клітини відмивають від сахарози й альбуміну охолодженим фізіологічним розчином (температура розчину 4 °С). Отриману в такий спосіб суспензію ділять на серії:

- інтактна: суспензія нейронів без внесення ініціюючих агентів і досліджуваних потенційних нейропротекторів;

- контрольна: суспензія нейронів, до якої додають агенти, що ініціюють оксидативний і нітро- зуючий стреси;

- з метою моделювання нітрозуючого стресу, в інкубаційне середовище у токсичній концентрації (0,1-5 мкМ) вносять динітрозольний комплекс заліза (DNIC). DNIC, на відміну від NO, виступає більш сильним нітрозилюючим агентом, взаємодіє з тіолами білків, гістидином, аспартатом, глутаміном, метіоніном, цистеїном, глутатіоном і утворює N- та S-нітрозотіоли в токсичній зоні 250 мкмоль.

За умов нормального функціонування клітин, фізіологічних концентрацій оксиду азоту та відсутності дефіциту кисню утворення DNIC є необхідною умовою для транспорту активних форм азоту. Токсичний вплив цієї сполуки на метаболізм клітин проявляється лише при розвитку оксидативного стресу. Значні концентрації DNlC викликають оборотне, а на більш пізніх етапах, незворотне окиснення та нітрозилювання значної частини регуляторних та транспортних білків цитоплазми, внутрішньої та зовнішньої клітинної мембрани. За таких умов відбувається окислення металів змінної валентності - міді, цинку, заліза, які знаходяться в активних центрах білків-ферментів, що призводить до їх інактивації. Особливо важливими вказані перетворення є для ферментів, що задіяні у підтримці антиоксидантного захисту.

Для оцінки інтенсивності оксидативного стресу в цитозольній фракції гомогенату головного мозку визначали маркери окисної модифікації білка - альдегідфенілгідразони (АФГ) і кетонфенілгідразони (КФГ).

Біохімічний метод оцінки заснований на реакції взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4-динітрофенілгідразином (2,4-ДНФГ) з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів. Для цього до 0,2 мг цитозольної та мітохондріальної фракцій клітин додавали 0,1 мл 25% трихлороцтової кислоти та центрифугували 30 хв при 3000 об/хв. Далі до осаду додавали 1 мл 2,2% ДНФГ та інкубують 1 год при температурі 37°С, потім повторно центрифугували 10 хв при 3000 об/хв. Осад, що утворився, промивають 3 мл етилацетату, розчиняють у 3 мл 50% розчину сечовини, додають 1 краплю 7% розчину соляної кислоти та розводять дистильованою водою в 12 разів. Підготований таким чином розчин надалі досліджували на спектрофотометрі, визначаючи вміст АФГ при довжині хвилі 274 нм, КФГ - при 363 нм [7].

Глутатіон відновлений встановлювали за методом, заснованим на взаємодії ортофталієвого ангідриду з відновленим глутатіоном, унаслідок чого утворюється флюоресціюючий комплекс, який реєструється флюорометрично при Ex/Em=340/420 нм. Глутатіон розраховували за калібрувальною кривою [7]. Глутатіонредуктаза (ГР) відновлює дисульфідний зв'язок окисненого глутатіону GSSG до його сульфгідрильної форми GSH. Відновлення глутатіону відбувається за рахунок енергії НАДФ-Н, що утворюється в пен- тозному циклі ГР. Є одним з основних ферментів тіол-дисульфідної системи.

Глутатіон-трансфераза (Г-S-T) входить до родини ферментів, що нейтралізують токсичний вплив різних гідрофобних і електрофільних сполук шляхом їх кон'югації з відновленим глутатіоном. Г-S-T локалізована переважно у цитозолі клітин. Основна функція GST -- захист клітини від цитотоксичних продуктів окисної модифікації білкових молекул, ліпідів шляхом їх відновлення, приєднання до субстрату молекули глутатіону або нуклеофільного заміщення гідрофобних груп. Є одним із ключових ферментів як антиоксидантної, так і тіол-дисульфідної систем. Зміна активності даного ензиму відображає спрямованість, перебіг патологічного процесу, а також ефективність лікування. Принцип методу: активність глутатіон-Б-трансферази визначають за швидкістю утворення глутатіон-Б-кон'югатів між GSH і 1-хлор-2,4- динітробензолом (ХДНБ). Збільшення концентрації кон'югатів у ході реакції реєструють спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм (максимум поглинання глутатіон-Б- ХДНБ).

Для оцінки антиоксидантної активності (АОА) за гальмуванням нітрозуючого стресу визначали ступінь гальмування продуктів окислювальної модифікації білку - АФГ, КФГ в пробах [7].

Нітротирозин є специфічним маркером окислювального стресу. Його визначали в гомогенаті серця твердофазним імуносорбентним методом за набором фірми ELISA та виражали в нм/г тканини. Дослідження, проведені на відібраних 11 сполуках - похідних 1,2,4-триазолу - 3-метил- 1,2,4-триазоліл-5-тіокарбонових кислотах та їх солях.

Достовірність відмінностей між експериментальними групами оцінювали за допомогою t- критерію Стьюдента та U-критерію Уїтні-Манна. Для всіх видів аналізу статистично значимими

вважали відмінності при р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Встановлено, що додавання вказаного токсичного агента (DNIC) викликало розвиток нітро- зуючого та оксидативного стресу. Про це свідчить підвищення маркерів окисного пошкодження білків - альдегідфенілгідразонів (АФГ) та кетонфенілгідразонів (КФГ), а також збільшення вмісту нітротирозину (табл. 1 - 3). Так, встановлено підвищення на 93,3% рівня АФГ у нейрональній суспензії на 60 хвилину інкубації. Внесення до інкубаційного середовища досліджуваних сполук показало наявність у них здатності обмежувати реакції оксидативного стресу, що спричинені додаванням DNIC. Найбільш активними у цьому відношенні виявилися сполуки під робочим шифром 1.2 (тіотриазолін) та 1.11 (ангіолін), які обмежували окисну деструкцію білків і накопичення їх альдегідних похідних на 35,9 та 41,5%% відповідно. Серед інших сполук досить активними виявилися сполуки з шифром 1.6 (на 30,3%), 1.7 (на 33,8%) та 1.9 (на 28,3%). Наявна антиоксидантна активність у 5 перерахованих сполуках підтверджується статистично значимими отриманими результатами (табл. 1). Всі використані сполуки, окрім 1,2,4-триазолу та 1.10, за силою своєї антиоксидантної активності перевищували використані референс-препарати - метіонін, унітіол, тіосульфат натрію, дибунол та а-токоферол.

Таблиця 1. Активність похідних 3-метил-1,2,4-триазоліл-5-а-тіокарбонових кислот в суспензії нейронів in vitro при DNIC-індукованому стресі