- 24 -

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Фармакогностическое изучение семян различных сортов амаранта печального (Amaranthus hypochondriacus L.)

Специальность 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Коренская Ирина Михайловна

Пермь - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет" Министерства образования и науки РФ

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Фурса Николай Сергеевич

ГБОУ ВПО "Ярославская государственная медицинская академия" Минздравсоцразвития РФ

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Белоногова Валентина Дмитриевна

ГБОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия" Минздравсоцразвития РФ,

заведующий кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники

доктор фармацевтических наук, доцент

Гейн Людмила Федоровна

ГБОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия" Минздравсоцразвития РФ,

заведующий кафедрой общей и биоорганической химии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО " Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится "26" февраля 2013 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия" Минздравсоцразвития РФ по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д.46.

Отзыв на автореферат просьба отправлять по адресу Диссертационного совета.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http^ // www.mon.gov.ru "___" декабря 2012 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru "___" декабря 2012 г.

Автореферат разослан "___" _____________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01, кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

Аннотации

Целью работы явился сравнительный анализ природных соединений 5 сортов амаранта печального с использованием современных методов, разработка нормативной документации на них и на мазь с амарантовым маслом.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

- провести изучение веществ первичного (углеводы, аминокислоты, жирные кислоты, витамины) и вторичного обмена (терпены, стерины, фенольные соединения, органические кислоты) 5 сортов амаранта печального;

- сравнить элементный состав анализируемых образцов до и после экстракции жирного масла и оценить их экологическую чистоту;

- определить масличность и компонентный состав жирного масла семян различных сортов амаранта и установить показатели его качества;

- выявить характерные морфолого-анатомические признаки и провести определение товароведческих показателей семян пяти сортов;

- предпринять изучение ряда фармакологических свойств масла амаранта;

- разработать фармацевтическую модель мази с амарантовым маслом для наружного применения и оценить ее технологические и фармакологические свойства;

- составить проекты ФСП на семена и мазь с маслом амаранта.

Научная новизна. С использованием современных физико-химических методов исследования (хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС), масс-спектрометрия (МС) с индуктивно связанной плазмой, капиллярный электрофорез, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ и др.) впервые проведено сравнительное фитохимическое изучение семян амаранта печального. При этом в ходе их стандартизации выявлены микродиагностические признаки и дано описание внешних признаков. Наряду с этим показана перспективность использования семян амаранта как важного природного комплекса различных БАВ (углеводов, белков, отличительным признаком которых является значительное количество лизина, жирного масла с высоким содержанием эссенциальных жирных линолевой и линоленовой кислот, сквалена, фосфолипидов (фосфатидилхолина), стеринов, токоферолов и органических кислот).

Методом МС впервые определен 61 элемент в семенах 5 сортов амаранта печального, которые имеют определенное значение в экологическом, токсикологическом, медицинском и хемотаксономическом аспектах.

С использованием метода ГХ/МС впервые проанализирован состав этанольного извлечения из семян и шрота амаранта печального, в результате которого идентифицировано 67 соединений, из которых 57 до и 60 после экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом.

Методом ВЭЖХ определено содержание жирных кислот, фосфолипидов и сквалена в жирных маслах, полученных из анализируемого сырья.

Для качественного и количественного определения токоферолов и фосфолипидов в жирном масле семян амаранта адаптирован метод ТСХ.

Проведено изучение раздражающего действия, острой и хронической токсичности, исследовано гипохолестеринемическое действие и бактерицидная активность жирного масла из семян амаранта печального.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований положены в основу проектов ФСП "Амаранта семена" и "Мазь с маслом амаранта". Данные по товароведческому анализу семян амаранта печального использованы при разработке ТУ 9719-003-77872064-2011 "Зерно амаранта", введенных 24.10.2011, ООО "Русская олива".

Методики качественного и количественного анализа отдельных групп БАВ семян различных сортов амаранта внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ГБОУ ВПО "Воронежская государственная медицинская академия им.Н. Н. Бурденко" (акт о внедрении от 19.03.12 г.), кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО "Воронежский государственный университет" (акт о внедрении от 04.05.12 г.), кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии ГБОУ ВПО "Ярославская государственная медицинская академия" (акт о внедрении от 23.01.12 г.).

Впервые на доклиническом этапе исследований обоснована целесообразность использования амарантового масла в качестве гипохолестеринемического и противоожогового средства, что позволяет в известной мере реализовать возможность применения семян амаранта печального в медицине.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Данные сравнительного изучения веществ первичного и вторичного обмена пяти сортов амаранта печального.

2. Итоги определения элементного состава и оценки экологической чистоты анализируемого сырья до и после экстракции жирного масла.

3. Результаты изучения компонентного состава экстракционного амарантового масла и обоснования возможностей его применения в медицине.

4. Характеристика морфолого-анатомических признаков семян амаранта печального и их товароведческих показателей.

5. Особенности фармакологического действия амарантового масла.

6. Результаты исследования фармацевтической модели мази с маслом амаранта.

7. Разработанные нормативные документы - проекты ФСП "Амаранта семена" и "Мазь с маслом амаранта".

Апробация и публикация результатов исследования

Основные результаты исследований доложены и обобщены на следующих межрегиональных и международных научно-методических конференциях: "Пути и формы совершенствования фармацевтического образования" (ВГУ, Воронеж 2003, 2005, 2007, 2010 гг.), "Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации" (ВГУ, Воронеж 2008, 2011), "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (ПГФА, Пятигорск 2010, 2011, 2012), "Науково-технiчний прогрес i оптимiзацiя технологiчних процесiв створення лiкарських препаратiв" (ТДМУ, Тернопiль 2011); "Moderni vymozenosti vedy" (Praha, 2012); "Бъдещите изследвания" (София, 2012); "Europejska nauka XXI powieka - 2012" (Przemysl)" (2012), на научных конференциях студентов и молодых учёных ГБОУ ВПО ЯГМА (2010 - 2012), на ежегодных научных сессиях ФГБОУ ВПО ВГУ в период 2005-2012 гг.

Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО ВГУ (код по ГРНТИ: 31.23). Тема диссертационной работы утверждена на заседании Ученого совета фармацевтического факультета ВГУ (протокол № 09 от 27.10.05 г.).

Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных по изучению элементного, углеводного, аминокислотного, липидного и фенольного состава семян 5 сортов амаранта печального, в проведении сравнительной характеристики их микродиагностических признаков, в исследовании отдельных фармакологических свойств амарантового масла, в апробации результатов исследования, в составлении 2 проектов ФСП и подготовке публикаций по выполненной работе.

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы, из них 10 в журналах, в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 175 страницах текста компьютерной верстки и состоит из "Введения", "Обзора литературы" (1 глава), "Экспериментальной части" (5 глав), выводов, списка литературы, включающего 244 источника, в том числе 46 на иностранных языках, и приложений. Диссертация содержит 51 таблицу, 31 рисунок, в том числе 15 фотографий.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе обобщены данные литературы по ботанической характеристике и химическому составу видов рода щирица (Amaranthus) семейства амарантовые (Amaranthaceae), их применению в медицине, а также дана характеристика, классификация, физико-химические свойства и методы анализа жирных масел. Вторая глава посвящена материалам и методам исследования. Третья глава включает результаты определения элементного состава и исследования веществ первичного и вторичного обмена 5 сортов семян амаранта печального. В четвертой главе отражены результаты изучения амарантового масла и характеристика его качества. Пятая глава содержит данные по стандартизации семян амаранта печального. В шестой главе приведены результаты по исследованию раздражающего действия, определению острой и хронической токсичности, по изучению противомикробного и гипохолестеринемического действия амарантового масла. Приложения включают отдельные масс-спектры идентифицированных веществ, проекты фармакопейных статей, приведены результаты по исследованию фармацевтической модели мази с маслом амаранта, а также материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

Основное содержание работы

объекты и методы исследования

Для сравнительного анализа нами использованы семена зерновых и овощных сортов (Воронежский, Кинельский, Крепыш, Кизлярец, Янтарь) амаранта печального (Amaranthus hypochondriacus L.), интродуцированных в Украине, в Российской Федерации (Центральный и Сибирский ФО) и интенсивно культивируемых в Воронежской, Белгородской и Липецкой областях.

Анализ БАВ проводили классическими и современными методами исследований, в частности бумажной (БХ) и тонкослойной хроматографией (ТСХ), методом капиллярного электрофореза (прибор Applied Biosystem 273 Т, США), хромато-масс-спектрометрией (ГХ/МС) (газовый хроматограф 6850 с масс-селективным детектором 5973 фирмы Agilent Technologies, США), ВЭЖХ с фотометрической детекцией (аминокислотные анализаторы: ААА-400, Чехия, и Hitachi 835, Япония), масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (масс-спектрометр ELAN-DRC-e, США), титриметрией, УФ-спектрофотометрией (СФ-56), товароведческого анализа, фармакологическими методами оценки острой и хронической токсичности, моделирования раздражающего, гипохолестеринемического, антибактериального действия, используя унифицированные биохимические методы исследования крови. При этом в работе использовали реактивы, стандарты, растворители, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами и с помощью программы "Statistica - 6,0".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Элементный состав

Определение макро-, микро - и ультрамикроэлементов в семенах пяти сортов амаранта печального и их шрота (после экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом) проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой на приборе ELAN-DRC-e (США). Для контроля точности определений применяли метод добавок.

В анализируемых образцах нами выявлен 61 элемент, среди которых 7 макро-, 54 микро - и ультрамикроэлемента (табл.1), третья часть из которых является эссенциальными. Каждый образец характеризовался индивидуальными особенностями в накоплении отдельных элементов. Среди макроэлементов в семенах амаранта сорта Воронежский до и после экстракции преобладали калий и кальций, сорта Кизлярец, Кинельский и Янтарь - фосфор, калий, кальций, сорта Крепыш - фосфор, кальций и магний. Из микроэлементов во всех анализируемых образцах доминировало железо, затем в значительных количествах накапливались марганец, цинк, несколько меньше рубидий, титан, медь, стронций, барий и др.

Из приведённых в таблице 1 данных видно, что до экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом содержание половины элементов было большим, чем после неё, и наоборот. Содержание доминирующих элементов в семенах амаранта коррелировало с таковым в семенах льна (М.А. Гарумова, 2005), семенах гречихи (Л.И. Бутенко, 2010) и плодах расторопши пятнистой (А.В. Волоцуева, 2004.; В.М. Рыжов, 2009).

Накопление токсичных элементов (Pb, As, Cd, Hg) в семенах 5 сортов амаранта печального не превышало предел допустимых концентраций на период заготовки и исследования сырья (СанПиН 2.3.2.1078-01 от 2001 года). В связи с чем их следует считать экологически безопасными. Отмеченное послужило основанием к дальнейшему исследованию семян и получению из них жирного масла.

Из изложенного следует, что семена амаранта печального и, что важно, его шрота - источник многих эссенциальных элементов, недостаток которых в организме человека приводит к различным заболеваниям.

ВЕЩЕСТВА ПЕРВИЧНОГО И ВТОРИЧНОГО ОБМЕНА

Углеводы. Наличие углеводов в водных извлечениях из семян подтверждали обработкой трехкратным объемом 96% спирта этилового. Полученные рыхлые бело-серые осадки использовали для проведения реакции с реактивом Фелинга, подтвердившим присутствие в исследуемых образцах сахаров в связанном виде. Гравиметрическим методом определено содержание водорастворимых полисахаридов, пектинов, гемицеллюлозы А и В 5 сортов изучаемых семян. Отмечено наиболее высокое суммарное содержание углеводов в семенах амаранта печального сорта Воронежский (57 %), использованных для углубленного изучения состава моносахаров. Методом прямофазной ВЭЖХ нами не обнаружены моносахариды в свободном состоянии, а из связанных сахаров методом капиллярного электрофореза определено довольно значительное содержание глюкозы (9,8 %).

Таблица 1 - Элементный состав семян пяти сортов амаранта печального до экстракции жирного масла (мкг/г)

Более разнообразный состав моносахаров (девять) обнаружен методом ГХ/МС. При анализе семян и шрота амаранта печального (сорт Воронежский) отмечено, что среди углеводов доминировали сахароза (89,98 % и 70,67 % от общей суммы углеводов) и галактоза в фуранозной форме (7,97 и 9, 46 %). В шроте идентифицирована пентоновая (ксилоновая) кислота (табл.2).

Таблица 2 - Содержание углеводов в этанольных извлечениях семян амаранта печального (сорт Воронежский) до и после экстракции жирного масла

аминокислоты. Для первоначального обнаружения белкового комплекса семян использовали нингидриновую пробу. Содержание протеина в них варьировало в зависимости от сорта (11,61-15,34 %). Количественное определение аминокислот в семенах проводили с помощью аминокислотного анализатора Hitachi (Япония) в стандартных условиях после гидролиза (табл.3 и рис.1).

В результате исследований обнаружили 18 аминокислот, из них 7 заменимых (Ala, Gly, Ser, Cys, Asp, Glu, Pro), 3 - условно заменимых (Tyr, His, Arg) и 7 - незаменимых (Val, Ile, Leu, Met, Phe, Thr, Lys). Орнитин выявлен в следовых количествах. Доля незаменимых аминокислот (в среднем по сортам около 33 % в общей сумме) значительно ниже (более чем в 2 раза), чем заменимых (около 67 %). По мере убывания содержания отдельные аминокислоты можно расположить в следующий ряд: Glu > Arg > Asp > Gly > Lys > Leu > Ser > Val > Phe > Thr > Pro > Ala > Ile > His > Tyr > Cys > Met. От общей суммы аминокислот доля глютаминовой кислоты, аргинина, аспарагиновой кислоты, глицина, лейцина, лизина и серина составляла около 65%.

По содержанию лизина, лейцина, фенилаланина и других незаменимых аминокислот протеины семян амаранта превосходят белки семян льна (М.А. Гарумова, 2005) и плодов расторопши пятнистой (А.В. Волоцуева, 2004). Возможно, это свидетельствует о значительной биологической ценности семян амаранта печального. Аналитическими исследованиями подтвержден уникальный сбалансированный аминокислотный состав белков в семенах амаранта, который имеет наибольшее совпадение с теоретически рассчитанным идеальным белком ФАО/ВОЗ (67-87 баллов).

Таблица 3 - Аминокислотный состав пяти сортов семян амаранта печального (n = 5, p ? 0,05)

Рисунок 1 - Хроматограмма аминокислот семян амаранта печального (сорт Воронежский)

Липофильная фракция. При анализе методом ГХ/МС этанольного извлечения семян сорта Воронежский обнаружено 31, а в шроте - 30 соединений липофильной природы (табл.4 и 5).

Таблица 4 - Жирнокислотный состав этанольного извлечения семян сорта Воронежский до и после экстракции жирного масла

* - содержание компонента относительно общей суммы всех идентифицированных жирных кислот

Из данных, приведенных в таблице 4, следует, что в семенах до экстракции жирного масла идентифицированно 18 жирных кислот, доля которых равнялась более 75 % от общей суммы, после неё - 23 (52%). Содержание ненасыщенных жирных кислот в семенах в 2 раза больше, чем насыщенных. В шроте увеличилось содержание насыщенных жирных кислот (почти на 87 %), в основном за счет маргариновой и стеариновой кислот. Кроме того, в нём идентифицировано еще 4 насыщенные жирные кислоты: лауриновая, бегеновая, лигноцериновая, церотиновая.

Из ГХ/МС-анализа липофильных соединений видно, что среди них больше всего содержалось сквалена (табл.5, рис.2). Кроме того, в значительных количествах обнаружен витамин Е. Причем их содержание в семенах до экстракции более значимо. После экстракции в шроте количество сквалена уменьшилось почти в 3, а б-токоферола - в 25 раз. Весьма разнообразен набор стероидных соединений семян (табл.5), среди которых доминировал ситостерин, который, как известно, вызывает понижение холестерина плазмы и ингибирует адсорбцию холестерина. В семенах и шроте отмечено наличие глицерина и его сложных эфиров (табл.5) с органическими (пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая) и неорганическими (фосфорная) кислотами. Доля каждого из них в значительной мере увеличилась в шроте (глицерина - более чем в 50 раз).

Рисунок 2 - Масс-спектр сквалена и участок хроматограммы этанольного извлечения шрота амаранта

Таблица 5 - Содержание отдельных липофильных веществ этанольного извлечения семян сорта Воронежский до и после экстракции

* - содержание компонента относительно общей суммы идентифицированных липофильных соединений

Следовательно, при получении жирного масла гексаном с пищевым нефрасом большая часть жирных кислот, особенно эссенциальных и б-токоферолов, экстрагировалась в жирное масло. Стерины и сапонин фриделанон извлекались полностью.

Фенольные соединения. Наличие фенольных соединений в семенах амаранта печального обнаруживали качественными реакциями и бумажной хроматографией (БХ). При этом отметили наличие кофейной и феруловой кислот.

Органические кислоты. При ТСХ-анализе в семенах амаранта печального выявлено 2 органические (янтарная и аскорбиновая), а методом ГХ/СМ в семенах и шроте - 6 органических кислот (молочной, бензойной, янтарной, яблочной, фумаровой, коричной) с преобладанием фумаровой.

АМАРАНТОВОЕ МАСЛО

Масло из семян амаранта получали экстракционным способом по запатентованной технологии (А.М. Макеев с соавторами, 1997), разработанной в Воронежском государственном университете.

Содержание жирного масла и его физико-химические показатели в семенах 5 сортов амаранта печального определяли согласно ГФ X издания. Наибольшая масличность (6%) отмечена в сортах Воронежский, Крепыш и Кизлярец. Анализируемые жирные масла характеризовались сходными физико-химическими показателями (табл.6). По величине йодного числа они отнесены к группе полувысыхающих жирных масел. Установлен срок их годности по показателям кислотного, перекисного и йодного чисел - 1,5 года.

Таблица 6 - Физико-химические показатели жирного масла семян пяти сортов амаранта печального

Методом ВЭЖХ проанализирован состав жирных кислот и сквалена в маслах из семян различных сортов амаранта печального (табл.7). При этом в них обнаружено 10 жирных кислот и сквален. Амарантовые масла из семян разных сортов различались содержанием жирных кислот. Причем, сорта Воронежский и Кинельский наиболее богаты также по содержанию суммы эссенциальных кислот (линолевой и линоленовой) - до 45% и сквалена (до 7%).

При исследовании компонентного состава амарантового масла семян сорта Воронежский методом ГХ/МС идентифицировано 20 соединений (вероятность более 85 %), среди которых выявлено 12 жирных кислот, 3 этиловых эфира отдельных кислот, 2 спирта, пропиловый эфир пальмитиновой кислоты, дисахарид и ациклический тритерпен - сквален.

При анализе фосфолипидов и токоферолов методом ТСХ с последующей обработкой полученных зон программой Sorbfil Videodensitometer в анализируемых жирных маслах определено содержание суммы токоферолов (в пределах 0,312 - 0,401%) и фосфолипидов (от 2,5 до 3,5%). При анализе последних идентифицированы фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидовая кислота. Наиболее богато по содержанию суммы токоферолов и фосфолипидов, особенно фосфатидилхолина, жирное масло семян сорта Воронежский.

Таблица 7 - Компонентный состав жирного масла семян анализируемых сортов амаранта печального, полученного экстракцией гексаном

разработка нормативной документации

В настоящее время семена амаранта печального (Amaranthi hypochondriaci semina) в РФ не находят применения в официнальной медицине, поэтому отсутствует нормативная документация на них, что явилось основой изучения их морфолого-анатомических особенностей. Из результатов микродиагностического изучения следует, что кожура семян большей частью однослойная со слегка утолщенными стенками клеток, хорошо развитый зародыш, расположенный кольцом по краю семени (диска) вокруг эндосперма. При проведении товароведческого анализа семян определены такие числовые показатели, как влажность (8,13-10,55 %), общая зола (3,78-4,48 %), зола, нерастворимая в 10% HCl (0,08-0,1 %), а также примеси (другие части растения), содержание которых может быть в пределах - 0,52-0,95%, органической примеси (0,67-0,95 %), минеральной примеси (0,16-0,26 %), положенные в основу проекта ФСП "Амаранта семена".

Материалы фитохимического и товароведческого исследования нами использованы также при разработке ТУ 9719-003-77872064-2011 "Зерно амаранта", введенных 24.10.2011, ООО "Русская олива".

Фармакологические свойства амарантового масла

При проведении изучения раздражающего, токсического, гипохолестеринемического и бактерицидного действия масла из семян амаранта в экспериментах использованы лабораторные животные (6 кроликов породы шиншилла, 140 белых беспородных крыс обоих полов, массой 200-230 г). При исследовании общетоксического и гипохолестеринемического действия исследуемое масло вводили через зонд внутрижелудочно в различных дозах. Интактные животные вместо масла получали в тех же дозах воду очищенную.

Раздражающее действие масла амаранта оценивали по тесту Драйза по изменению состояния слизистой оболочки глаза кролика. Выявлено, что оно практически не оказывало раздражающего действия на конъюнктиву глаза кролика.

Острую токсичность масла амаранта изучали в дозах 10, 20, 30 мл/кг. Летальность не выявлена ни для одной из доз при наблюдении в течение 14 дней. Масло из семян амаранта при однократном введении в желудок крысам являлось достаточно безопасным и может быть отнесено к IV классу токсичности по классификации Сидорова К.К. (1977).

Хроническую токсичность масла амаранта определяли в дозах 10 мл/кг (2 мл/200 г) и 0,5 мл/кг (0,1 мл/200 г) при ежедневном внутрижелудочном введении на протяжении 3 месяцев. Проведенное в конце эксперимента патологоанатомическое и морфометрическое изучение внутренних органов животных, исследование показателей общего анализа крови не выявило значимых специфических патологических изменений. При сравнении показателей биохимического анализа крови животных отмечены достоверно значимые отклонения от физиологической нормы только в отношении повышения АсАТ, АлАТ и ЩФ при введении амарантового масла в дозе в 2 раза превышающей терапевтическую (10,0 мл/кг). Так, в сыворотке крови существенно увеличилась активность АлАТ (на 70,8 %), активность АсАТ (на 15,8 %), а коэффициент де Ритиса при этом уменьшился (на 32,1 %). Активность ЩФ возросла в 2,16 раза. Вероятно, эти изменения следует расценивать как начальные проявления синдромов цитолиза и холестаза при данной дозе.

Гипохолестеринемическое действие масла из семян амаранта проводили в условиях дополнительной алиментарной холестериновой нагрузки в сравнении с подсолнечным и льняным маслами на 40 беспородных крысах-самцах, разделенных на 4 группы (1 - контроль, 2, 3, 4 - экспериментальные). При этом выявлено, что, несмотря на дополнительную холестерин-ЖК нагрузку, в сыворотке крови животных опытных групп отсутствовало достоверное увеличение активности печеночных ферментов, что, возможно, указывает на наличие элементов гепатопротекторной активности исследуемого масла.

Пероральное применение раствора 1% холестерина в подсолнечном масле в дозе 5 мл/кг привело к достоверному увеличению общего холестерина (ОХ) почти в 4 раза, тогда как на фоне применения раствора холестерина в амарантовом масле не отмечено достоверного повышения в содержании ОХ по сравнению со здоровыми животными, а на фоне введения 1% раствора холестерина в льняном масле зафиксировано его достоверное снижение по сравнению с интактом (табл.8).

Содержание атерогенных липопротеидов (ЛПНП) в контрольной группе увеличилось более чем в 5,5 раз, в то время как введение амарантового и льняного масла вызвало снижение ЛПНП на 46% и 66% соответственно по сравнению со здоровыми животными. Изложенное позволяет судить о наличии гипохолестеринемического эффекта у амарантового масла.

Таблица 8 - Влияние 1% раствора холестерина в исследуемых маслах на основные показатели липидного обмена животных

Примечание: ? - p?0,05 - достоверность различий при сравнении между опытными и показателями интактной группы

Антиоксидантную активность оценивали в условиях проведения предыдущего опыта путем определения содержания азота оксида в сыворотке крови экспериментальных животных спектрофотометрическим методом. При этом отмечено его повышение после введения растворов холестерина в амарантовом или льняном маслах, что указывало на наличие данной активности.

Антибактериальная активность масла семян амаранта определялась в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов in vitrо. Выраженное противомикробное действия выявлено по отношению к музейным штаммам кишечной и синегнойной палочки.

С учётом выявленной фармакологической активности разработана парафармацевтическая модель мази с маслом амаранта и проведены ее реологические, биофармацевтические и предварительные фармакологические исследования. При этом определены нормы качества данной модели в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения" и установлен срок ее годности - 12 месяцев, при хранении при температуре +10°C. На основе этих исследований предложен проект ФСП "Мазь с маслом амаранта".

Общие выводы

1. С использованием современных методов впервые проведён сравнительный анализ отдельных веществ первичного (углеводов, аминокислот, липидов), вторичного (стеринов, терпенов, фенольных соединений, органических кислот) обмена и элементного состава 5 сортов (Воронежский, Кинельский, Кизлярец, Крепыш, Янтарь) амаранта печального, выявлены их микродиагностические признаки и изучены некоторые фармакологические свойства амарантового масла.

2. Методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в семенах 5 сортов амаранта печального определен 61 элемент, из них 7 макро - (Al, Сa, K, Mg, Na, P, Si), 54 микро - и ультрамикроэлемента (Ag, As, Au, B, Ba, Be, Bi, Br, Ce, Cd, Co, Cs, Cr, Cu, Dy, Er, Eu, Fe, Ga, Gd, Ge, Hf, Hg, Ho, I, La, Li, Lu, Mn, Mo, Nb, Nd. Ni, Pb, Pr, Rb, Sb, Se, Sm, Sn, Sr, Ta, Tb, Th, Ti, Tl, Tm, U, V, W, Y, Yb, Zn, Zr), имеющих определенное значение в хемосистематическом, экологическом, токсикологическом и медицинском аспектах, и отмечено, что содержание токсичных элементов (As, Cd, Hg, Pb) в них не превышало допустимый уровень нормативной документации.

3. При количественном определении аминокислот семян 5 сортов амаранта печального с использованием аминокислотного анализатора обнаружено 18 аминокислот, среди них 7 заменимых (Ala, Gly, Ser, Cys, Asp, Glu, Pro), 3 условно незаменимых (Tyr, His, Arg) и 7 незаменимых (Val, Ile, Leu, Met, Phe, Thr, Lys), среди которых преобладали Glu (15,66 - 18,47 %), Arg (11,96 - 12,46 %), Asp (7,99 - 9,43 %), Gly (7,48 - 8,49 %), Lys (6,22 - 7,36 %) и др.

4. Установлена масличность семян исследуемых сортов амаранта печального (Воронежский - 6,05 %, Кинельский - 4,92 %, Крепыш - 5,95 %, Янтарь - 4,5 %, Кизлярец - 5,9 %) и близость их физико-химических показателей, методами ВЭЖХ и ТСХ определен компонентный состав жирных масел, представленный насыщенными (25-28 %) и полиненасыщенными жирными кислотами (61-74 %), токоферолами (0,55-1,30 %), фосфолипидами (2,48-3,85 %) в зависимости от сорта и отмечено, что по содержанию эссенциальных жирных кислот доминировали сорта Воронежский и Кинельский, по содержанию токоферолов и фосфолипидов - сорт Янтарь.

5. В этанольном извлечении семян сорта Воронежский хромато-масс-спектрометрией идентифицировано 67 соединений, из которых 57 (жирных кислот 18, аминокислот 13, углеводов 6, глицерина и его сложных эфиров 6, витамин Е, сквален, стеринов 4, органических кислот 7, тритерпеновых сапонинов 1 - фриделанон) до и 60 (жирных кислот 23, аминокислот 14, углеводов 9, глицерина и его сложных эфиров 5, витамин Е, сквален, органических кислот 7) после экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом. Определено, что до экстракции в семенах в общей сумме наиболее значима доля (более 75 %) жирных кислот и сквалена (свыше 10 %), гораздо меньше углеводов (до 6 %) и стеринов (свыше 4 %), в незначительных количествах обнаружены органические кислоты (менее 1 %), глицерин и его сложные эфиры (более 0,3 %) и аминокислоты (в пределах 0,3 %) и отмечено, что содержание жирных кислот после экстракции уменьшилось в 1,5 раза, сквалена - в 2,5 раза, витамина Е - в 25 раз, стерины и фриделанон извлеклись полностью.

6. В результате фармакогностического изучения семян амаранта печального выявлены их основные микродиагностические признаки (кожура - большей частью однослойная со слегка утолщенными стенками клеток, хорошо развитый зародыш, расположенный кольцом по краю семени (диска) вокруг эндосперма), определены нормы качества семян амаранта печального и составлен проект ФСП "Амаранта семена" и ТУ 9719-003-77872064-2011 "Зерно амаранта".

7. В эксперименте на животных изучено гиперхолестеринемическое, антиоксидантное, бактерицидное действие амарантового масла и установлено, что оно не обладало практически раздражающим действием и относится к безопасным соединениям (IV класс токсичности).

8. Разработана парафармацевтическая модель "Мазь с маслом амаранта", которая обладала вязкопластичностью, тиксотропностью. структурированностью и оказывала выраженный ранозаживляющий эффект, вероятно, обусловленный антиоксидантным и бактерицидным действием, определены нормы ее качества, положенные в основу проекта ФСП "Мазь с маслом амаранта"

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коренская, И.М. Изучение фосфолипидного состава отходов амарантового масла / И.М. Коренская, Е.Ф. Сафонова, А.М. Макеев и др. // Новые и нетрадиционные растения и перспектива их использования: мат-лы IV Междун. симп. (20-24 июня 2001г., Пущино). - Москва, 2001. - С.99-101.

2. Макеев, А.М. Амарантовое масло - уникальное природное лекарственное средство / А.М. Макеев, И.М. Коренская, А.А. Кунин, и др. // Растительные ресурсы для здоровья человека (возделывание, переработка, маркетинг): мат-лы I Междун. науч. - практ. конф.23-27 сентября 2002 г. - Москва, Сергиев Посад, 2002. - С.255-266.

3. Коренская, И.М. Влияние различных доз амарантового масла на активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс / И.М. Коренская, А.П. Салей, З.Д. Мухаммед // Физиология и психофизиология мотиваций: межрегиональный сборник научных работ, посв.85-летию образования ВГУ. - Воронеж, 2003. - С.117-119.

4. Коренская, И.М. Амарантовое масло снижает содержание общего холестерина в крови / И.М. Коренская, А.П. Салей, А.М. Макеев // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования: мат-лы Межрегион. науч. - мет. конференции "Фармобразование 2003" (21-23 апр. 2003). - Воронеж, 2003. - С.178-180.

5. Близнецова, Г.Н. Изучение антиоксидантного действия амарантового и льняного масел в эксперименте / Г.Н. Близнецова, И.М. Коренская, А.Н. Постыка // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования: мат-лы.2-й Всеросс. науч. - мет. конф. "Фармобразование 2005" (20-22 апр. 2005). - Воронеж, 2005. - С.300-301.

6. Коренская, И.М. Исследование противоожоговой активности амарантового масла в эксперименте / И.М. Коренская, Н.П. Ивановская, И.Е. Измалкова // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования: матер.2-й Всерос. науч. - мет. конференции "Фармобразование 2005" (20-22 апр. 2005). - Воронеж, 2005. - С.346-347.

7. Коренская, И.М. Сравнительный фармакологический анализ влияния амарантового и льняного масел на динамику липидного обмена крыс в условиях холестериновой нагрузки / И.М. Коренская, В.Ю. Сулин, Е.Ф. Сафонова, А.Н. Постыка // Вестник Воронеж. гос. ун-та: серия химия, биология, фармация, 2006. - № 1. - С. 204-208.