Особенности терапии бактериального вагиноза, ассоциированного с Atopobium vaginae, и характеристика выделений из влагалища с использованием ДНК-чипов (клинико-лабораторное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Особенности терапии бактериального вагиноза, ассоциированного с Atopobium vaginae, и характеристика выделений из влагалища с использованием ДНК-чипов (клинико-лабораторное исследование)

14.00.11. - Кожные и венерические болезни

Плахова Ксения

Москва - 2007

Работа выполнена в отделении урогенитальных инфекционных заболеваний Федерального Государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агенства по высокотехнологичной медицинской помощи» и Государственном учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Гомберг

Доктор биологических наук, профессор Вадим Маркович Говорун

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Елена Валериевна Липова

Доктор медицинских наук Наталья Владиславовна Фриго

Ведущее научное учреждение: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Патологические выделения из влагалища являются одной из ведущих причин обращения женщин к врачу. При обследовании у таких пациенток часто обнаруживают инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в этом случае тактика врача достаточно полно определена в соответствующих рекомендациях. Значительно сложнее ситуация обстоит с пациентками, обратившимися с жалобами на выделения из влагалища, при которых отсутствует безусловный патогенный микроорганизм, а также грибы рода Candida. Классическим примером таких состояний и ведущей по частоте причиной патологических выделений из влагалища является нарушение нормального микробного состава вагинального содержимого - бактериальный вагиноз (БВ). БВ обнаруживают по разным данным у 4,9% - 36% пациенток с выделениями, включая 20-25% среди беременных (Европейское руководство по заболеваниям, передаваемым половым путем, 2004), регистрируется в 17-19% случаев среди обратившихся в клиники планирования семьи. В структуре заболеваний репродуктивной системы БВ встречается в 40-60% случаев (Тихомиров А.Л. с соавт., 2004; Morris M. etc., 2001). Этиологические агенты, приводящие к развитию БВ, до сих пор до конца не изучены, но бесспорной является полимикробная этиология этого состояния.

Наличие БВ у женщин, особенно в течение длительного времени, повышает риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза, создает серьезные проблемы после гинекологических оперативных вмешательств. Кроме того, БВ может явиться причиной осложнений беременности и родов, способствуя невынашиванию беременности и преждевременным родам. Описаны случаи, когда БВ приводил к развитию хориоамнионита, послеродового эндометрита, внутриутробного инфицирования плода, перитонита. Есть публикации, свидетельствующие о том, что БВ ассоциирован с инфекцией уретрального тракта, цервицитами (Анкирская А.С. с соавт.; 2001; Кира Е.Ф., 2001; Cu-Uvin S. etc., 2001).

БВ является фактором риска заражения ИППП и ВИЧ-инфекцией. В условиях высоких значений рН возникают благоприятные условия для колонизации мочеполовой системы патогенными микроорганизмами, а также обострению скрыто протекающей вирусной инфекции урогенитального тракта. Смешанные инфекции или инфекции, развившиеся на фоне выраженного дисбаланса состава микроценоза влагалища, наблюдаются в 20-30% случаев клинически выраженных инфекций влагалища (Анкирская А.С. с соавт., 2001; СDC, 2000; Nillson U. etc.,1997; Hashemi F. B.etc., 1999).

БВ негативно сказывается на качестве жизни женщин. Показано, что при наличии длительно существующих и обильных выделений из влагалища у пациенток возможно развитие психосоматических нарушений, у 1/3 - снижается работоспособность, нарушается половая и детородная функции, снижается качество жизни (Кира Е.Ф., 2001).

По данным некоторых авторов особенностью БВ является его склонность к рецидивированию после проведенного лечения, что наблюдают до 50% случаев (Wilson J., 2004, СDC 2000).

Классическими методами лабораторного обследования при постановке диагноза БВ являются культуральное исследование материала, взятого из заднего свода влагалища, и микроскопическое исследование мазка. Однако при исследовании с помощью световой микроскопии невозможно провести видовую идентификацию микроорганизмов, а при культуральном исследовании можно выделить не более 15% микроорганизмов из числа тех, что действительно присутствуют во влагалище при наличии выделений. Методы генодиагностики позволяют решить проблему быстрого и качественного обнаружения любой микрофлоры, как аэробной, так и анаэробной, а также микроаэрофилов непосредственно в мазках.

Цель исследования. С использованием методов генодиагностики (стандартная ПЦР и ДНК-чипы) и бактериологических методов исследования изучить спектр микроорганизмов у пациенток при выделениях из влагалища и на основании полученных данных повысить эффективность проводимой терапии.

Задачи исследования:

1. Апробировать систему идентификации бактериальной микрофлоры влагалища путем универсальной амплификации генов 16 S РНК бактериальных геномов с последующей видовой идентификацией возбудителей путем гибридизации с видоспецифическими зондами (олигонуклеотидный ДНК-чип).

2. Оценить возможность использования ДНК-чипа для относительной оценки количественного соотношения идентифицированных микроорганизмов.

3. Изучить особенности микробиоценоза влагалища с определением аэробной и анаэробной флоры при БВ, в зависимости от длительности течения.

4. Оценить терапевтическую эффективность интравагинального применения метронидазола или клиндамицина при патологических выделениях из влагалища с наличием признаков БВ, в зависимости от идентифицированных микроорганизмов.

Положения, выносимые на защиту:

1. ДНК-чип - динамическая система, которая может быть использована для исследования микробного спектра вагинального содержимого у пациенток с выделениями из влагалища. Использование ДНК-чипа наиболее оправдано при диагностике состояний, когда ожидается обнаружение широкого спектра микроорганизмов, в том числе трудно культивируемых анаэробных. Метод позволяет провести относительную количественную оценку идентифицированных микроорганизмов в исследуемой пробе.

2. Идентификация A.vaginae у пациенток с выделениями из влагалища является дополнительным критерием БВ и прогностическим фактором длительного рецидивирующего течение заболевания.

3. Для лечения БВ, ассоциированного с A.vaginae, приоритетным является назначение клиндамицина интравагинально.

Научная новизна:

1. Впервые в клинической практике апробирована система идентификации микрофлоры влагалища методом ДНК-чипа.

2. Впервые оценена возможность использования ДНК-чипов при постановке диагноза бактериального вагиноза.

3. Впервые путем динамического анализа вагинальной микрофлоры на олигонуклеотидных ДНК-чипах оценен состав микробиоценоза влагалища при БВ, резистентном к терапии.

4. Впервые в России оценена роль A. vaginae при патологических выделениях из влагалища. Установлена высокая корреляция A. vaginae с БВ. Впервые обнаружено, что у всех пациенток с A. vaginae, течение БВ носит длительный рецидивирующий характер.

5. Впервые в России доказана более высокая эффективность интравагинального применения клиндамицина для лечения БВ, ассоциированного с A. vaginae, и БВ, течение которого носит длительный рецидивирующий характер.

Практическая значимость. На основании полученных результатов даны рекомендации по спектру микроорганизмов, целесообразных для включения в ДНК-чип при исследовании вагинального содержимого у пациенток с патологическими выделениями из влагалища. Уточнены рекомендации по прогнозу и ведению пациенток с бактериальным вагинозом, течение которого носит упорный рецидивирующий характер. Даны рекомендации по лечению бактериального вагиноза, ассоциированного с A. vaginae.

Внедрение результатов диссертации в практику. Основанные на результатах диссертации рекомендации используются в клинической работе: ГУЗ НО «Кожно-венерологический диспансер Сормовского района г. Нижний Новгород» и ГКБ № 14 им В.Г.Короленко г. Москвы.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов, г. Санкт-Петербург, 24-27 сентября 2007 г., а также на школе урогинекологов, 11-12 сентября 2007 г. Одинцово.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации: Работа выполнена на 123 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав, содержащих введение, обзор литературы, описание методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы. Список литературы включает 115 зарубежных и российских авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 8 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Проведено клинико-лабораторное обследование 120 женщин в возрасте от 17 до 45 лет, обратившихся в клинико-диагностическое отделение ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий». Основную группу составили 100 женщин, обратившихся с жалобами на выделения из влагалища. Из 100 пациенток у 80 (80%) женщин клинически и лабораторно (в соответствии с критериями Амсела) был установлен диагноз - бактериальный вагиноз (I группа), у остальных 20 пациенток признаков БВ обнаружено не было, и как единственно возможная причина патологических выделений при культуральном исследовании были выявлены генитальные микоплазмы (U. urealyticum и /или M. hominis) (II группа). Контрольную группу (III группа) составили 20 здоровых пациенток, обратившихся для профилактического обследования на ИППП, у которых при клинико-лабораторном обследовании патологии выявлено не было. При включении пациенток в исследования учитывались следующие данные.

Критерии включения в основную группу:

1. Возраст от 17 до 45 лет.

2. Жалобы на патологические выделения из влагалища.

Критерии исключения из основной группы:

1 Беременность и лактация.

2 Наличие ИППП в период проведения исследования.

3 Нарушения менструального цикла, дисфункция яичников.

4 Патология эндокринной системы в анамнезе и в период проведения исследования.

5 Системная и местная антибактериальная терапия в течение 1 месяца до начала проведения исследования.

Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие признаков ИППП при обследовании и отсутствие местной или системной антибиотикотерапии в течение месяца до проводимого обследования. Пациентки группы I были условно разделены на две подгруппы в зависимости от длительности течения заболевания:

Подгруппа 1 - течение заболевания носило рецидивирующий характер в течение 6 месяцев и более - 36 пациенток.

Подгруппа 2 - с длительностью заболевания менее 6 месяцев - 44 пациентки.

При обследовании пациенток использовали: изучение данных анамнеза, клинический осмотр (осмотр с использованием зеркала Куско, проведение аминного теста, исследование рН вагинального содержимого), микроскопическое и микробиологическое исследование материала, методы молекулярной диагностики (ПЦР, ДНК-чип) и статистическую обработку результатов

При исследовании материала, полученного из заднего свода влагалища, уретры, цервикального канала, осуществляли микроскопию мазка, окрашенного по Граму, культуральное исследование для идентификации патогенных возбудителей, передаваемых половым путём (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis), Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis (на базе отдела лабораторной диагностики ИППП и кожных болезней ФГУ ЦНИКВИ «Росмедтехнологий»). Проводили культуральное исследование на наличие условно-патогенных аэробных и анаэробных микроорганизмов материала, полученного из заднего свода влагалища. Использовали ПЦР-диагностику для исключения Chlamydia trachomatis, ВПГ I и II.

На базе НИИ ФХМ проводился анализ материала из заднего свода влагалища с помощью ДНК-чипов (рис.1) и на первых этапах работы ПЦР-идентификация A. vaginae в исследуемом материале. ДНК-чип включал в себя 41 различный патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизм, в ходе работы в спектр исследуемых с помощью ДНК-чипа микроорганизмов был включен 42 - A. vaginae.

Рис.1. Результат сканирования флюоресценциии при исследовании вагинального содержимого с помощью ДНК-чипа (пациентка Н., диагноз: бактериальный вагиноз).

Для количественной оценки результатов, полученных с использованием ДНК-чипов, использована компьютерная программа Totallab.

Пациентки, с установленным диагнозом БВ (n=80) получали лечение по одной из двух следующих схем: гель метронидазол (0,75%) интравагинально по 5 г в течение 5 дней или клиндамицин крем 2% интравагинально по 5 г в течение 6 дней. Выбор схемы лечения осуществляли произвольно. После лечения обследовали 44 пациентки: 50% (n=22; 1-ая подгруппа) получали метронидазол интравагинально и 50% получали клиндамицин интравагинально (n=22, 2-ая подгруппа). Контрольное обследование проводилось не ранее, чем через неделю после окончания лечения, и оценивалось по субъективным (исчезновению жалоб на выделения из влагалища) и объективным признакам (критериям Амсела и иррадикации A. vaginae из вагинального отделяемого).

Обработка полученных данных проводилась на персональном компьютере с помощью прикладных программ Microsoft Excel - 98 и Statistika for Windows, программы «Биостатистика». Анализ достоверности результатов исследования определяли с помощью критерия 2 (p<0,05 - различия статистически достоверны) и с помощью критерия Фишера. Для выявления наиболее часто встречающихся ассоциаций микроорганизмов в различных группах проводился кластерный анализ.

Результаты собственных исследований

Средний возраст I, II и III групп составил 27 ± 5,8 лет.

Результаты клинико-анамнестического обследования пациенток с жалобами на выделения из влагалища

По результатам клинико-анамнестического обследования пациенток были выявлены следующие факторы риска развития БВ (при сравнении группы I c группами II и III):

* раннее начало половой жизни (до 18 лет) в 47 (58,7%) случаев (p=0,04);

* абсолютное пренебрежение барьерными методами контрацепции в 29 (36,2%) случаях (p=0,04);

* частая смена половых партнеров (более 10 половых партнеров за жизнь) 23 (28,8%) случая (p=0,04);

* БВ в анамнезе 36 (45%) случаев (p = 0,03);

* применение местных спермицидов в 5 (6,3%) случаях и внутриматочной спирали в 2 (2,5%) случаях.

Данные анамнеза и выявленные факторы риска характеризовали группу пациенток с БВ (группа I) в целом вне зависимости от длительности течения заболевания. При разделении группы на две подгруппы по длительности течения заболевания значимых различий в анамнестических данных и данных клинического обследования выявлено не было. Длительность периода рецидивирования БВ не зависела от выявленных факторов риска развития БВ. Не выявлено достоверного влияния особенностей сексуального поведения и данных гинекологического анамнеза на длительность течения БВ.

Исследование микрофлоры влагалища с использованием культуральных методов исследования.

При обследовании пациенток с жалобами на выделения из влагалища (n=100) с использованием микроскопии мазка, окрашенного по Граму, и культуральных методов исследования было идентифицировано 14 различных условно-патогенных микроорганизмов в сравнении с группой контроля (группа III, n=20), где было идентифицировано 7 различных микроорганизмов. Среди пациенток с БВ (группа I, n=80) c наибольшей частотой был идентифицирован микроорганизм, часто ассоциирующийся с БВ - G. vaginalis в 55 (68,7%) случаях. С несколько меньшей частотой были идентифицированы другие БВ -ассоциированные микроорганизмы: U. urealyticum в 41 (51,5%) случае, Mobiluncus spp. в 30 (37,5%) случаях и M. hominis в 25 (31,2%) случаях. С высокой частотой обнаруживался рост Corynebacterium spp. и Staphylococcus epidermidis в 50 (62,5%) случаях. Причем во II-ой и III-ей группах Corynebacterium spp. также встречался с высокой частотой: 15 (75%) и 11 (55%) пациенток соответственно (p> 0,05). В то время как Staphylococcus epidermidis во II-ой и III-ей группах обнаруживали с достоверно более низкой частотой 6 (30%) и 7 (35%) пациенток соответственно (p=0,004). Так же отмечено, что только в I-ой группе встречался Staphylococcus spp. у 8 (10%) пациенток. Представитель кишечной микрофлоры E. coli встречался с относительно одинаковой частотой во всех трех рассматриваемых группах (p>0,05).

Во II-ой группе, кроме обнаруженных при культуральном исследовании в 100% случаев генитальных микоплазм (U.urealyticum и/или M. hominis), c достоверно большей частотой обнаруживали представителя кишечной микрофлоры Enterococcus faecalis в 14 (70%) случаях (p=0,008 при сравнении с группами I и III). А также с достоверно большей частотой в группе II по сравнению с группой I обнаруживали Staphylococcus saprophyticus в 6 (30%) случаев (р=0,001).

В группах II и III не обнаруживали микроорганизмы, характерные для пациенток с БВ (группа I): G. vaginalis и Mobiluncus spp.

Представители нормальной микрофлоры влагалища - Lactobacillus spp., выявлялись с относительно низкой частотой во всех рассматриваемых группах (p>0,05).

Таким образом, в результате проведения культурального исследования вагинального содержимого, в рассматриваемых группах установлен спектр наиболее часто выявляемых условно-патогенных микроорганизмов:

1. Для группы I (n=80): G. vaginalis, U. urealyticum, Mobiluncus spp., M. hominis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus spp.

2. Для группы II (n=20): U. urealyticum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus.

3. Часто обнарживались во всех рассматриваемых группах: Corynebacterium spp., E. сoli.

Исследование спектра микрофлоры влагалища и количественного соотношения идентифицированных микроорганизмов с использованием ДНК-чипа.

С использованием ДНК-чипа и стандартной ПЦР был исследован материал (отделяемое заднего свода влагалища), полученный от 45 пациенток с жалобами на выделения из влагалища. В качестве контрольной группы обследовано 8 здоровых по результатам клинико-лабораторного обследования женщин, жалоб на момент обращения не предъявлявших. В материале, полученном от пациенток с жалобами на выделения из влагалища (n=45), с помощью ДНК-чипа нам удалось идентифицировать 29 различных микроорганизмов из 42 возможных, включая трудно-культивируемые анаэробные бактерии. Спектр выявляемой микрофлоры составили как условно-патогенные микроорганизмы, так и микроорганизмы, входящие в нормальный состав микробиоценоза влагалища. В ДНК-чип, который использовали в данном исследовании, наряду с условно-патогенными микроорганизмами было включено три патогенных: N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium. Патогенные микроорганизмы при анализе микробного состава с помощью ДНК-чипа не выявлялись, т.к. наличие ИППП являлось критерием исключения из исследования. Среди 29 выявленных с помощью чипов микроорганизмов обнаруживали различные группы бактерий, в том числе: микроаэрофильные бактерии (G. vaginalis в 30 (66,7%) случаях), облигатно-анаэробные грамположительные и грамотрицательные бактерии (Bacteroides spp. в 37 (82,2%) случаях, A. vaginae в 34 (75,5%) случаях, Lactobacillus spp. в 25 (55,5%) случаях, Clostridium spp. в 9 (20%) случаях, Prevotella spp. в 9 (20%) случаях, Porphyromonas spp. в 8 (17,8%) случаях, Fusobacterium spp. в 7 (15,5%) случаях, Peptostreptococcus spp. в 5 (11,1%) случаях, Mobiluncus spp. в 4 (8,8%) случаях, Veilonella spp. в 3 (6,6%) случаях) и факультативно-анаэробные грамположительные бактерии (M.hominis, U.urealyticum в 15 (33,3%) случаях, Streptococcus spp. в 3 (6,7 %) случаях, Staphylococcus spp. в 1 (2,2%) случае). Идентифицированный спектр микроорганизмов во многом предопределен составом исследуемой группы, в которой из 45 пациенток у 39 (86,7%) был установлен диагноз БВ (согласно критериям Амсела). У 6 (13,3%) пациенток, не имеющих признаков БВ, в качестве единственно возможной причины патологических выделений из влагалища были выявлены генитальные микоплазмы (U. urealyticum и/ или M. hominis) при культуральном исследовании.

При обследовании группы контроля (материал получали из заднего свода влагалища; n=8) с использованием ДНК-чипа было выявлено всего 5 различных микроорганизмов, среди которых чаще всего (в 5 случаях) обнаруживали представителя нормальной микрофлоры влагалища Lactobacillus fermentus.

Среди пациенток I-ой группы (n=80) была выделена подгруппа 1, у которых в анамнезе отмечались рецидивы БВ в течение 6 месяцев и более (n=20), а также подгруппа пациенток, у которых длительность БВ была менее 6 месяцев (подгруппа 2, n=19). Спектр, микроорганизмов, выявленных у пациенток с длительным течением БВ, в целом оказался шире, чем у пациенток с длительностью заболевания менее 6 месяцев. Обращало на себя внимание, что A. vaginae в этой подгруппе выявляли с достоверно более высокой частотой - в 100% (p=0,02) по сравнению с подгруппой 2. Также в подгруппе 1 суммарная частота идентифицированных представителей рода Bacteroides spp. достоверно выше, чем в подгруппе 2 (р=0,047). Кроме того, при более длительном течении БВ достоверно чаще встречались генитальные микоплазмы (p=0,003).

Таким образом, использование ДНК-чипов позволило не только поставить диагноз БВ, но и установить факторы длительного течения БВ - микроорганизмы, обнаружение которых может свидетельствовать о длительном, рецидивирующем течении заболевания:

1. Atopobium vaginae при длительном течении БВ обнаружен в 100%;

2. Bacteroides spp. при длительном течении БВ обнаружены в 75%;

3. Генитальные микоплазмы (U. urealyticum и / или M. hominis) при длительном течении БВ обнаружены в 50%.

Относительная оценка количественного соотношения микроорганизмов, выявленных в исследуемых образцах, проводилась по определению интенсивности положительного сигнала (степени свечения). Это позволяло косвенно оценивать соотношение, выявленных микроорганизмов (рис. 2). На диаграмме видно, что самый интенсивный сигнал, соответствует зонду All, который принят за контрольный и за 100 %. Наибольшие положительные по интенсивности результаты соответствуют Porphyromonas asacchoralytica, G. vaginalis и Bacterоides distasionis занимают в этой пробе 70%, 58% и 55% соответственно. С наименьшей интенсивностью выявляли Lactobacillus spp., Enterococcus faecalis, Streptococcus spp. и Clostridium ramosum с интенсивностью 20%, 20%, 15% и 18% соответственно.

При широком спектре микроорганизмов, выявленных в исследуемой пробе, ДНК-чип позволяет определить количественное соотношение содержания выявленных микроорганизмов между собой, что может способствовать внесению коррекции при выборе той или иной схемы терапии.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.2. Соотношение идентифицированных на ДНК-чипе микроорганизмов

Сравнительная характеристика выявленного спектра микроорганизмов с использованием ДНК-чипов и с помощью культурального метода исследования. Спектр микроорганизмов, идентифицированных с помощью ДНК-чипа, отличался от результатов, полученных при стандартном лабораторном обследовании (микроскопия мазка и культуральное исследование) (см. Таблицу №1). Эти различия трудно рассматривать с точки зрения достоверности, так как спектр микроорганизмов, идентифицированных с помощью ДНК-чипа, был обусловлен 42, включенными в него, специфичными для различных микроорганизмов, зондами. бактериальный вагиноз метронидазол

Представители видов микроорганизмов, идентифицированных при использовании рассматриваемых двух методов, различались. Например, с использованием ДНК-чипа было идентифицировано три вида представителей рода Lactobacillus: Lactobacillus fermentus, Lactobacillus brevis и один представитель, не отнесенный к определенному виду, выявленный по положительному результату в зонде, соответствующем Lactobacillus spp. При культуральном исследовании идентифицировались представители рода, без отнесения их к виду.

Таблица №1

Характеристика выявляемых микроорганизмов у пациенток с патологическими выделениями из влагалища с использованием различных методов диагностики (n=45)

№	Название микроорганизма	Результаты исследования с помощью ДНК-чипа	Результаты исследования с помощью микроскопии мазка и культурального метода
		Идентифицировали	Идентифицировали
		+/-	абс.	%	+/-	абс.	%
	Микроаэрофильные бактерии
1	Gardnerella vaginalis	+	30	66,60%	+	21	46,60%
2	Lactobacillus (суммарно)	+	25	55,50%	+	12	26,60%
2.1	Lactobacillus fermentus		16	35,50%		-	-
2.2	Lactobacillus brevis		8	17,70%		-	-
2.3	Lactobacillus spp		1	2,20%		-	-
	Облигатно-анаэробные грамположительные бактерии
3	Atopobium vaginae	+	34	75,50%	-	-	-
4	Clostridium spp.	+			-	-	-
4.1	Clostridium ramosum		9	20,00%
5	Peptostreptococcus spp.	+			-	-	-
5.1	Peptostreptococcus anaerobius		5	11,10%
6	Mobiluncus spp.(суммарно)	+	4	8,80%	+	14	31,10%
6.1	Mobiluncus curtisii		3	6,60%		-	-
6.2	Mobiluncus mulieris		1	2,20%		-	-
	Облигатно-анаэробные грамотрицательные бактерии
7	Bacteroides spp. (суммарно)	+	37	82,20%	-	-	-
7.1	Bacteroides distasonis		13	28,80%
7.2	Bacteroides cacae		10	22,20%
7.3	Bacterides fragilis		5	11,10%
7.4	Bacteroides uniformis		4	8,80%
7.5	Bacteroides stercoris		4	8,80%
7.6	Bacterides eggerthii		1	2,20%
8	Prevotella spp. (суммарно)	+	8	17,70%	-	-	-
8.1	Prevotella bivia		5	11,10%
8.2	Prevotella melanogencia		3	6,60%
8.3	Prevotella disiens		1	2,20%
9	Veillonella spp.	+			-	-	-
9.1	Veillonella parvila		3	6,60%
10	Porphyramonas spp.	+			-	-	-
10.1	Porphyramonas asacchoralytica		8	17,70%
11	Fusobacterium spp.	+			-	-	-
11.1	Fusobacterium nucleatum		7	15,50%
	Факультативно-анаэробные грамположительные бактерии
12	Corynebacterium spp.	-	-	-	+	23	51,10%
13	Staphylococcus spp. (суммарно)	+	1	2,20%	+	18	40,00%
13.1	Staphylococcus epidermidis	-	-	-	+	14	31,10%
13.2	Staphylococcus aureus	+	1	2,20%	+	1	2,20%
13.3	Staphylococcus spp		-	-		3	6,60%
14	Streptococcus spp. (суммарно)	+	3	6,60%	+	2	4,40%
14.1	Streptococcus anginosus		2	4,40%		-	-
14.2	Streptococcus spp		1	2,20%		2	4,40%
	Аэробные грамположительные и грамотрицатеьные бактерии
15	Enterococcus spp.	+			+
15.1	Enterococcus faecalis		6	13,30%		16	35,50%
15.2	Enterococcus faecicum		3	6,60%		-	-
16	E. coli	+	6	13,30%	+	11	24,40%
17	Moraxella catarrhalis		1	2,20%		-	-
18	M. hominis + U.urealyticum	+	15	33,30%	+	23	51,10%

С помощью ДНК-чипа с наибольшей частотой выявляли G. vaginalis и A. vaginae: в 30 (66,6%) и 34 (75,5%) случаях, соответственно. При культуральном исследовании G. vaginalis были идентифицированы реже - в 21 (46,6%) случае.

Культуральное исследование на A. vaginae не проводилось ввиду сложности его идентификации при использовании этого метода. В то же время обращало на себя внимание, что на первом месте по частоте обнаружения при культуральном обследовании выявляли не включенные в ДНК-чип микроорганизмы из рода Corynebacterium (в 23 (51,1%) случаях). По данным литературы, филогенетически A. vaginae ближе всего относится как раз к представителям этого рода. Учитывая тот факт, что представители рода Corynebacterium не идентифицировались по видовой принадлежности при культуральном исследовании, можно предположить наличие Atopobium vaginae в структуре положительных ответов на Corynebacterium при стандартном микробиологическом исследовании.

При исследовании на ДНК-чипе представители рода Bacteroides встречались суммарно в 37 (82,2%) случаях, что предопределено тем фактом, что в основной группе 86,7 % составили пациентки с БВ. При стандартном микробиологическом обследовании представители рода Bacteroides не обнаруживались, что связано с трудностями культивирования этих микроорганизмов.

Обращало на себя внимание, что некоторые факультативно-анаэробные бактерии и аэробные при культуральном исследовании встречались с несколько большей частотой, чем при исследовании на ДНК-чипе. Это могло быть обусловлено установленным порогом диагностической чувствительности для этих микроорганизмов на ДНК-чипе, когда положительным считался результат, соответствующий результату «обильный рост» при культуральном исследовании. Более высокая частота обнаружения представителей Mobiluncus spp. при микроскопии мазка, окрашенного по Граму, в сравнении с результатами исследования с помощью ДНК-чипа, кроме установленного порога диагностической чувствительности, могла быть обусловлена, еще и тем, что микроскопия мазка позволяет определить морфотип без видовой идентификации микроорганизма. В то время как идентификация с использованием ДНК-чипа позволяла обнаруживать два вида Mobiluncus curtisii и Mobiluncus mulieris.

В целом спектр микроорганизмов, идентифицированных у пациенток с жалобами на выделения из влагалища с помощью ДНК-чипа, оказался в два раза шире, чем при культуральном исследовании. При этом с помощью ДНК -чипа часто обнаруживались облигатно-анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы, тогда как при культуральном исследовании чаще обнаруживались факультативно-анаэробные и аэробные бактерии.

Роль A. vaginae в развитии БВ.

По современным данным мировой литературы (в особенности данных молекулярной диагностики) анаэробный микроорганизм A. vaginae в большей степени ассоциирован с БВ, чем другие микроорганизмы. В нашем исследовании ассоциация БВ с A. vaginae оказалась более выраженной, чем с G. vaginalis. В группе I (пациентки с БВ, n=80) A.vaginae были идентифицированы в 66 (82,5%) случаях. В группе II (пациентки с жалобами на выделения из влагалища без признаков БВ, но с наличием микоплазм, (n=20)), A.vaginae были идентифицированы в 5 (25%) случаях. Группа I была условно разделена на две подгруппы в зависимости от длительности течения БВ. При этом в подгруппе пациенток, у которых течение БВ носило длительный, рецидивирующий (более 6 месяцев) характер (n=36), A.vaginae выявляли во всех 36 случаях (100%) (рис. 3).



Рис. 3. Частота выявления A. vaginae в подгруппах пациенток с различной длительностью течения БВ

В подгруппе с длительностью течения заболевания менее 6 месяцев (n=44) этот микроорганизм идентифицировали со значительно меньшей частотой - в 30 (68,2%) случаях (p<0,05). Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что идентификация A. vaginae может служить прогностическим критерием длительности течения БВ.

При оценке ассоциации различных микроорганизмов, выявляемых при БВ в ассоциации с A.vaginae, были получены следующие результаты. Из 30 (37,5%) случаев, когда у пациенток с БВ при микроскопии мазков, окрашенных по Граму, обнаруживали представителей Mobiluncus spp., в 24 (80%) случаях также были идентифицированы A. vaginae. Таким образом, ассоциация Mobiluncus spp., с A. vaginae встречалась в 30% случаев БВ.

При сопоставлении частоты ассоциации Mobiluncus spp. и A. vaginae с продолжительностью течения БВ, было установлено, что у пациенток из подгруппы с длительным течением БВ такая ассоциация встречалась достоверно чаще (16 случаев (44,4%)), чем у пациенток из подгруппы с менее длительным течением БВ (8 (18,2%; p=0,02).

Ассоциация Mobiluncus spp., генитальные микоплазмы (U. urealyticum и/или M. hominis) и A. vaginae среди всех пациенток с БВ встречалась в 15 (18,7%) случаев. При этом в подгруппе пациенток с длительным течением БВ такая ассоциация встречалась достоверно чаще (в 11 (30,5%) случаях), чем в подгруппе пациенток с менее длительным течением БВ (в 4 (9,1%); p=0,03). Ассоциация A. vaginae с генитальными микоплазмами (U. urealyticum и / или M. hominis) встречалась часто - в 40 (50%) случаях. Такая ассоциация оказалась также более характерной для БВ длительного течения и встречалась в 24 (66,7%) случаях в сравнении с меньшей частотой при менее длительном течении БВ (16 (36,4%) случаев; p=0,01).

Для оценки наличия в исследуемом материале одного из основных маркеров БВ - G. vaginalis в дополнение к культуральному исследованию и микроскопии мазка, было проведено исследование методом ПЦР. По результатам этого исследования G. vaginalis была идентифицирована в группе пациенток с БВ в 65 (81,2%) случаях. При этом у 58 (89,2%) пациенток G. vaginalis ассоциировалась с A. vaginae, у части обследованных - у 9 (11,2%) женщин A. vaginae идентифицировали в отсутствии G. vaginalis в исследуемом материале. Одновременное присутствие A. vaginae и G. vaginalis в подгруппе пациенток с длительным течением БВ было обнаружено в 30 (83,3%) случаев, а в подгруппе пациенток с менее длительным течением БВ в 28 (63,6%) случаев.

Ассоциация G. vaginalis, A. vaginae и Mobiluncus spp. отмечалась у 18 (22,5%) пациенток, из них 11 (13,7%) относились к подгруппе с длительным течением БВ и только 7 (8,7%) к подгруппе с менее длительным течением БВ.

Ассоциация всех рассматриваемых микроорганизмов (G. vaginalis, A. vaginae, Mobiluncus spp. и генитальных микоплазм) наблюдалась в 13 (16,2%) случаев, из них большую часть составили пациентки с БВ длительного течения - 9 (11,2%) и меньшую - пациентки с менее длительным течением БВ - 4 (5%). Частота обнаружения A. vaginae у пациенток с БВ не зависела от его ассоциаций с другими БВ-ассоциированными микроорганизмами (G.vaginalis, Mobiluncus spp., U. urealyticum, M. hominis) и являлась самостоятельным фактором.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что длительное рецидивирующее течение БВ наиболее часто ассоциируется с облигатно-анаэробными грамположительными A. vaginae, как самостоятельно, так и в ассоциации с облигатно-анаэробными грамположительными Mobiluncus spp. и факультативно-анаэробными грамположительными генитальными микоплазмами (U. urealyticum и / или M. hominis).

Бактерии G. vaginalis и A. vaginae являются частыми спутниками БВ. Однако, в то время как, G. vaginalis встречается одинаково часто при различной длительности течения БВ, обнаружение A. vaginae оказывается прогностическим фактором длительного рецидивирующего течения БВ.

Результаты лечения пациенток с БВ, ассоциированным с A. vaginae.

Из 44 пациенток, находившихся под наблюдением до и после лечения, A. vaginae обнаружили до лечения в 36 случаях, из них 18 пациенток получали метронидазол интравагинально и были включены в первую подгруппу, а 18 остальных получали клиндамицин интравагинально и были включены во вторую подгруппу.

Было установлено, что среди пациенток первой подгруппы у 2 (11%) сохранялись признаки БВ, согласно критериям Амсела, а у 8 (44,5%) пациенток сохранялись жалобы на выделения из влагалища после лечения. Во второй подгруппе пациенток признаки БВ, согласно критериям Амсела полностью нивелировали, а жалобы на выделения из влагалища сохранялись у 2 (11%) пациенток.

Оценка результатов лечения по иррадикации из выделений A. vaginae показала следующее. В первой подгруппе A. vaginae повторно после окончания лечения обнаруживался в 12 (66,7%) случаях, из них у восьми пациенток сохранялись жалобы на выделения из влагалища. Во второй подгруппе A. vaginae повторно после лечения обнаруживался достоверно реже, чем в первой подгруппе, в 3 (16,7%) случаях (p = 0,006), из них у двух пациенток сохранялись жалобы на выделения из влагалища (см. таблицу №2). Таким образом, у всех пациенток предъявлявших жалобы на выделения из влагалища после лечения был обнаружен A. vaginae.

Результаты проведенного исследования показали, что клиническое излечение при использовании клиндамицина интравагинально и метронидазола интравагинально наступило в 83,3% и 33,3 % случаях соответственно (p<0,05).

Таблица №2

Распределение положительных результатов на A. vaginae до и после лечения

Использованные схемы лечения	Положительных результатов на A. vaginae до лечения	Положительных результатов на A. vaginae после лечения	Успешно пролечено (согласно клинико-лабораторному обследованию)
	абс	%	абс	%	абс	%
Метронидазол вагинально (n=22)	18	81,8	12	66,7	10	55,5
Клиндамицин вагинально (n=22)	18	81,8	3	16,7	18	100

С учетом полученных результатов предложен алгоритм ведения пациенток с БВ (рис.4) и рекомендации по использованию ДНК-чипов для анализа микробного спектра вагинального содержимого.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Алгоритм ведения пациенток с БВ

Рекомендации по ведению пациенток с длительным рецидивирующим течением БВ

1. Метронидазол остается основным препаратом для лечения БВ.

2. В перечень для исследования микроорганизмов при БВ рекомендуется включение - анаэробного грамположительного микроорганизма A. vaginae.

3. При впервые установленном диагнозе БВ обнаружение A. vaginae является критерием для назначения клиндамицина интравагинально.

4. При длительном, рецидивирующем БВ предпочтительнее применение клиндамицина интравагинально вне зависимости от выявления A. vaginae.

Рекомендации по использованию ДНК-чипов для исследования микробного спектра вагинального содержимого у пациенток с жалобами на выделения из влагалища

У пациенток, с жалобами на выделения из влагалища, целесообразно проводить исследование материала из влагалища с использованием технологии ДНК-чипа, включающей широкий спектр определяемых микроорганизмов.

В спектр микроорганизмов для исследования у пациенток с выделениями из влагалища целесообразно включить анаэробный микроорганизм A. vaginae.

Исследование материала, полученного из заднего свода влагалища, с помощью ДНК-чипов следует проводить не ранее, чем через 1,5-2 месяца после антибиотикотерапии по любым показаниям.

4. Применение ДНК-чипов оправдано, в случаях, когда ожидается обнаружение широкого спектра микроорганизмов, особенно труднокультивируемых анаэробных.

Выводы

1. На клиническом материале (вагинальное содержимое пациенток с выделениями из влагалища) апробирован олигонуклеотидный ДНК-чип для идентификации бактериальной микрофлоры путем универсальной амплификации генов 16 S РНК бактериальных геномов с последующей видовой идентификацией возбудителей.

2. Использование технологии ДНК-чипов при патологических выделениях из влагалища позволяет проводить относительную количественную оценку 29 идентифицированных микроорганизмов в каждой исследуемой пробе и определять преобладающий микроорганизм в исследуемом материале.

3. У пациенток с БВ, длительностью заболевания более 6 месяцев установлена более высокая частота обнаружения: Atopobium vaginae (в 100% случаев), Bacteroides spp. (в 75% случаев), генитальных микоплазм (U. urealyticum и / или M. hominis; в 50% случаев), в сравнении с пациентками с длительностью течения заболевания менее 6 месяцев, когда Atopobium vaginae, Bacteroides spp. и генитальные микоплазмы обнаруживали в 68 %, 37% и в 5% случаев, соответственно (р<0,05). Высокая частота ассоциации патологического процесса с анаэробным микроорганизмом A.vaginae (82,5%), позволяет считать его одним из критериев диагноза БВ, а обнаружение A.vaginae у всех пациенток с длительным, рецидивирующим течением БВ, может служить прогностическим признаком такого течения этого заболевания.

4. У пациенток с БВ, ассоциированном с A.vaginae, применение клиндамицина интравагинально более эффективно, чем назначение метронидазола интравагинально (клиническое излечение в 83,3% и 33,3 %: случаев, соответственно; p<0,05).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гомберг М.А. Терапия трихомониаза и бактериального вагиноза: проблемы и пути решения / Гомберг М.А., Плахова К.И.// Consilium-medicum. - 2005. - т. 7. - № 3. - с 210-214.

2. Гомберг М.А. Современная тактика ведения пациенток с выделениями из влагалища /Гомберг М.А., Плахова К.И.// Новости дерматологии и венерологии Южного Кавказа. - 2005. - № 1. - с 9 - 13.

3. Гомберг М.А. Стандартная и нестандартная диагностика и терапии при выделениях из влагалища / Гомберг М.А., Плахова К.И., Анискова И.Н. // Фарматека. - 2006. - №2. - с 45-50.

4. Гомберг М.А. О терапии трихомониаза и бактериального вагиноза / Гомберг М.А., Плахова К.И.// Вестник дерматологии и венерологии. - 2006. - №1. - с. 60-63.

5. .Гомберг М.А. Использование ДНК-чипов для микробиологического анализа патологических выделений из влагалища / Гомберг М.А, Говорун В.М., Плахова К.И., Мудрак Д.Е. // IX Всероссийская конференция дерматовенерологов, тезисы научных работ. - Екатеринбург. - 2006. - с. 31.

6. Плахова К.И. Диагностика и лечение бактериального вагиноза / Плахова К.И. // Венеролог. - 2006. - № 9. - с. 46-49.

7. Плахова К.И. Бактериальный вагиноз: протокол ведения больных / Плахова К.И. // Венеролог. - 2007. - № 4. - с. 10-16.

8. Plakhova K.I. Microchip technology in detection of vaginal flora in women with vaginal discharge / Plakhova K.I., Gomberg M.A., Ilina E.N., Atroshkina M.E., Govorun V.M. // 17- th USTI World Congress, Book of abstracts. - Seattle. - 2007. - p-647.

9. Плахова К.И. Исследование микробного спектра состава вагинального содержимого с использованием ДНК-чипов / Плахова К.И., Гомберг М.А., Атрошкина М.Е., Ильина Е.Н., Говорун В.М. // Второй Всероссийский конгресс дерматовенерологов, тезисы научных работ. - Санкт-Петербург. - 2007. - с. 162

10. Плахова К.И. Роль Atopobium vaginae при рецидивировании бактериального вагиноза / Плахова К.И., Гомберг М.А., Атрошкина М.Е., Ильина Е.Н., Говорун В.М. // Вестник дерматологии и венерологии, № 5, 2007 г., с. 9 -13.

Размещено на Allbest.ru