Особенности функциональной активности периферических нейтрофилов и продуцируемых ими медиаторов при невынашивании беременности поздних сроков

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.01.01 - Акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Особенности функциональной активности периферических нейтрофилов и продуцируемых ими медиаторов при невынашивании беременности поздних сроков

Павлов Александр Владимирович

Иваново - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Панова Ирина Александровна

доктор медицинских наук,

профессор Сотникова Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

(ГБОУ ВПО “Нижегородская государственная медицинская академия” Минздравсоцразвития России) Качалина Татьяна Симоновна

доктор медицинских наук (ФГБУ “Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова” Минздравсоцразвития России) Ходжаева Зульфия Сагдуллаевна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО “Московский государственный медико-стоматологический университет” Минздравсоцразвития России.

Защита состоится “___”__________2011г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения и социального развития РФ по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ “Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова” Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан “___”___________2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук И.А. Панова

Актуальность проблемы.

Невынашивание беременности находится в центре внимания современной науки о репродукции человека. Проблема преждевременных родов является одной из ведущих в области охраны здоровья матери и ребенка и имеет первостепенное значение для формирования здорового поколения людей с самого раннего периода их жизни [Радзинский В.Е. и соавт., 2011; Семенова М.В. и соавт. 2010]. Не менее значителен психо-социальный аспект преждевременных родов, так как рождение неполноценного ребенка или его смерть становятся тяжелой психической травмой, приводят к заметному снижению жизненной активности и часто к отказам от последующих беременностей [Макаров О.В. и соавт., 2007]. Частота прерывания беременности в 3 триместре составляет до 30% в структуре невынашивания [Сидельникова В.М., 2007; Czajka R. et al., 2010]. Преждевременный разрыв плодных оболочек сопровождает от 25 до 38% преждевременных родов [Радзинский В.Е., 2011; Holt R. et al., 2011; Kramer M.S. et al., 2010; Derosa G. et al., 2008].

Сложность решения проблемы преждевременных родов обусловлена многочисленностью причин, несовершенством методов диагностики и лечения. Поскольку обследование и лечение женщин в большинстве случаев приходится осуществлять во время беременности, это не позволяет выявить и устранить имеющиеся патологические состояния [Сидельникова В.М. и соавт., 2008; Timmons B.C. et al., 2009].

В настоящее время в связи с широким развитием возможностей иммунологии репродукции изучение иммунологических аспектов беременности и ее прерывания стало одним из самых актуальных и перспективных, и все больше исследователей приходят к выводу о значительной роли скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета в развитии недонашивания [Raghupathy R., 2006; Romero R. et al., 2004].

Большинство факторов врожденного иммунитета имеют несомненное значение в поздние сроки гестационного процесса, однако остаются до конца не изученными до настоящего времени. Изучение их особенностей позволит уточнить системные иммунные механизмы, определяющие развитие невынашивания беременности в поздние сроки, преждевременный разрыв плодных оболочек и преждевременные роды, на основании которых возможна разработка новых прогностических критериев исхода беременности, что имеет большое значение для практического акушерства.

Цель исследования:

Уточнить медико-биологические факторы риска, установить особенности функциональной активности периферических нейтрофилов при невынашивании беременности поздних сроков, на основании чего разработать новые критерии прогнозирования исхода беременности у женщин с данной патологией.

Задачи исследования:

Дать оценку состояния репродуктивного и соматического здоровья, уровня инфицированности женщин с угрозой невынашивания в поздние сроки и при преждевременном разрыве плодных оболочек, течения беременности и родов, состояния новорожденного; определить медико-биологические факторы риска развития данных осложнений беременности.

Установить особенности внутриклеточной продукции IL-1в и IL-8 нейтрофилами периферической крови, экспрессии ими CD62L молекул, мРНК TLR9 и MMP9, сывороточного содержания кальпротектина и дефензинов-б у женщин с угрозой невынашивания беременности и при преждевременном разрыве плодных оболочек в 22-33 недели.

Определить особенности функциональной активности нейтрофилов на системном уровне у женщин с угрозой невынашивания и преждевременным разрывом плодных оболочек в зависимости от срока (22-27 и 28-33 недели) и исхода беременности. невынашивание беременность нейтрофил

Разработать новые критерии прогнозирования исхода беременности у женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели.

Научная новизна исследования:

В современных условиях получены новые теоретические данные о ранжировании факторов риска развития угрозы невынашивания и преждевременного разрыва плодных оболочек в 22-33 недели беременности. Наиболее значимыми факторами риска развития угрозы прерывания являются медицинский аборт в анамнезе, возраст женщин до 20 лет, активная уреаплазменная инфекция; преждевременного разрыва плодных оболочек - наличие угрозы невынашивания при беременности, два и более аборта в анамнезе, выкидыши в анамнезе, активная уреаплазменная и микоплазменная инфекция.

Установлено, что угроза прерывания беременности сопровождается выраженными изменениями продукции провоспалительных цитокинов, экспрессии селектиновых молекул, синтеза противомикробных медиаторов, матриксных металлопротеиназ и паттерн-распознающих рецепторов нейтрофилами периферической крови, зависящими от срока (22-27 и 28-33 недели) и исхода беременности.

Показано, что преждевременный разрыв плодных оболочек в 22-33 недели сопровождается менее выраженными изменениями показателей врожденного иммунитета, чем угроза прерывания беременности в те же сроки, и характеризуется различиями сывороточного уровня кальпротектина в 22-27 и 28-33 недели.

Выявлено, что показатели функциональной активности периферических нейтрофилов при угрозе прерывания и преждевременном разрыве плодных оболочек в отличие от не осложненной беременности коррелируют между собой, и характер связей зависит от срока и исхода беременности.

Установлены особенности относительного содержания CD62L+ нейтрофилов в периферической крови женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели, позволяющие прогнозировать преждевременные роды.

Практическая значимость:

Разработаны нормативные значения сывороточного содержания кальпротектина и дефензинов-б в сроке 22-33 недели беременности.

В клиническую практику предложен способ прогнозирования исхода беременности на основании определения в периферической крови относительного содержания CD62L позитивных нейтрофилов у женщин с угрозой невынашивания в сроке 22-33 недели.

Положения, выносимые на защиту:

Угроза прерывания беременности и преждевременный разрыв плодных оболочек в 22-33 недели ассоциируются с гиперактивацией нейтрофилов на системном уровне, обусловленной активной уреаплазменной и микоплазменной инфекцией и проявляющейся усилением продукции IL-1в+ и IL-8+, экспрессии CD62L+, повышением сывороточного содержания дефензинов-б и зависит от срока и исхода беременности.

Главными отличиями преждевременного разрыва плодных оболочек от угрозы прерывания в 22-33 недели являются отсутствие экспрессии мРНК TLR9, MMP9 периферическими нейтрофилами и изменений уровня кальпротектина.

Показатель относительного содержания CD62L+ нейтрофилов в периферической крови женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели служит прогностическим критерием преждевременных родов.

Внедрение результатов в практику:

Разработанный новый способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели прошел предрегистрационное испытание в акушерской клинике ФГБУ “Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова” Минздравсоцразвития России (приоритетная справка № 2011139011 от 26.09.2011г).

Апробация работы:

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 30-летию со дня основания института ФГБУ “Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова” Минздравсоцразвития России (г. Иваново, 2010г); 4-ой Всероссийской конференции “Иммунология репродукции” с элементами научной школы для молодежи (г. Пермь, 2010г); конференции молодых ученых ГБОУ ВПО ИвГМА (г. Иваново, 2011г).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора:

Диссертационная работа представляет собой самостоятельный труд автора. Автором лично проводился забор материала для диагностических исследований, динамическое наблюдение за пациентами, прослежены исходы беременности у обследованных, заполнялись индивидуальные карты наблюдений, производилась статистико-математическая обработка полученных данных.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 212 источников, из них 70 на русском и 142 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 15 рисунками. Содержание работы:

Материал и методы исследования:

В условиях акушерской клиники Федерального государственного бюджетного учреждения “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения и социального развития РФ и женских консультаций № 2 и № 9 города Иваново обследовано 160 беременных женщин в сроке гестации 22-33 недели. Исход беременности прослежен у всех беременных. Были сформированы следующие клинические группы:

первая группа (контрольная) - женщины с нормально протекающей беременностью в сроке 22-33 недели - 50 человек;

вторая группа - женщины с угрозой прерывания беременности в сроке 22-33 недели - 50 человек;

третья группа - женщины с преждевременным разрывом плодных оболочек в сроке 22-33 недели - 60 человек.

Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь и плацента.

Методы исследования:

Клинические методы (сбор анамнеза, наружное и внутреннее акушерское исследования, полное клинико-лабораторное обследование);

Функциональные методы (ультразвуковое исследование, кардиотокография).

Иммунологические методы: выделение обогащенных популяций нейтрофилов из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078, d=1,114) (Boyum A.,1968). Поверхностный фенотип и внутриклеточный синтез цитокинов нейтрофилами определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC). В исследовании использовали конъюгированные с FITC анти-CD62L антитела (CALTAG Laboratories, USA). Внутриклеточную продукцию цитокинов оценивали с помощью мАТ: коньюгированные с FITC анти-human-IL-1в и анти-human-IL-8 антитела (CALTAG Laboratories, USA). При оценке внутриклеточной продукции цитокинов нейтрофилами периферической крови предварительно проводили процедуру пермеабилиазации клеточной мембраны с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA, USA). Для количественного определения экспрессии мРНК MMP9 и TLR9 нейтрофилами периферической крови использовали количественный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в масштабе реального времени. Содержание кальпротектина и дефензинов-б в сыворотке крови определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия). В сыворотке периферической венозной крови методом ИФА на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) с использованием коммерческих систем ЗАО “Вектор-Бест” определяли уровень IgM и IgG антител к HSV, CMV, Chlamydia Trachomatis, IgA и IgG антител к Ureaplasma Urealyticum, Mycoplasma Hominis.

Патоморфологические методы: обзорная гистология, окраска гематоксилином и эозином.

Математическая обработка полученных результатов исследования проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. Описание выборки производилось с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25-С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивалась по непараметрическому критерию U (Манна-Уитни) и по t-критерию (M±m). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных лицензионных программ “Statistica 6.0.”, “Microsoft Office 2007”, “GenStat”, “MedCalk” и “Open Epi”.

Результаты исследования и их обсуждение:

Возраст обследованных беременных колебался от 16 до 40 лет. Группы практически не отличались по среднему возрасту, который составил 28,04±0,79года в первой группе; 28,28±0,86 - во второй и 29,24±1,37- в третьей группе. Подавляющее большинство женщин были в возрасте от 21 до 30 лет: в первой группе - 60,0% , во второй - 52,0% и в третьей - 50,0%. Следует отметить, что наибольшее количество женщин в возрасте до 20 лет было во второй группе (32,0% против 8,0%; скорректированное ОШ 5,41; 95% ДИ 1,66-17,64, р<0,01). Во второй и третьей группах достоверно чаще по сравнению с контролем женщины были не работающими (р<0,001). Характер становления менструальной функции в группах наблюдения особенностей не имел. При проведении ретроспективной оценки гинекологического анамнеза обследуемых женщин установлено, что частота гинекологических заболеваний у женщин второй и третьей группы была достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,01 в обоих случаях). Среди них достоверно чаще отмечены воспалительные процессы гениталий (кольпит, аднексит, эндометрит) (34,0% против 14,0%; скорректированное ОШ 3,16; 95% ДИ 1,17-8,51во второй группе и 35,0% против 14,0%; скорректированное ОШ 3,3; 95% ДИ 1,26-8,62 в третьей группе, p<0,01в обоих случаях), эктопия шейки матки (48,0% против 20,0%, скорректированное ОШ 3,69; 95% ДИ 1,52-8,97, p<0,05 во второй группе и 56,7% против 20,0%, скорректированное ОШ 5,2; 95% ДИ 2,21-12,37 в третьей группе, p<0,01). Нарушения менструальной функции достоверно чаще выявлены у женщин второй группы по сравнению с контролем (p<0,05). Анализ данных о предшествующих беременностях показал, что артифициальные аборты у женщин второй и третьей групп отмечены достоверно чаще, чем в контрольной группе (26,0% против 6,0%; скорректированное ОШ 5,5; 95% ДИ 1,46-20,75 во второй и 53,3% против 6,0%; скорректированное ОШ 17,9; 95% ДИ 5,01-63,9 в третьей группе, p<0,01). У женщин с ПРПО в анамнезе чаще имели место самопроизвольные выкидыши (23,3% против 2,0%; скорректированное ОШ 14,91; 95% ДИ 1,88-118,0, p<0,01).

Первобеременными во второй группе были 14,0% пациенток (скорректированное ОШ 3,14; 95% ДИ 1,29-7,65, p<0,01), в третьей - 15% женщин, что достоверно ниже, чем в контрольной группе (56%) (p<0,01 в обоих случаях). Женщины с ПРПО чаще были повторнородящими по сравнению со второй группой (p<0,05).

Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что группу повышенного риска по невынашиванию беременности составляют молодые женщины с наличием в анамнезе воспалительных заболеваний, самопроизвольных выкидышей и медицинских абортов [Сидельникова В.М., 2006]. На фоне хронического воспалительного процесса гениталий происходят изменения в системе иммунитета, что может приводить к нарушению процесса плацентации, инвазии и развития хориона и, в конечном итоге, к прерыванию беременности [Puchner K., 2011; Namba F., 2010].

В структуре экстрагенитальной патологии у 100% обследованных всех групп в анамнезе имели место инфекционные заболевания детского возраста (корь, краснуха, скарлатина, ветряная оспа) (р>0,05 во всех случаях). Каждая женщина перенесла в своей жизни острую респираторно-вирусную инфекцию. Пациентки второй группы достоверно чаще имели в анамнезе хронический тонзиллит (р<0,05), хронический бронхит (р<0,05), хронический пиелонефрит (30,0% против 10,0%; скорректированное ОШ 4,23; 95% ДИ 1,41-12,7, р<0,01). В третьей группе по сравнению с контролем было больше пациенток, перенесших пневмонию, хронический пиелонефрит (26,7% против 10,0%; скорректированное ОШ 3,0; 95% ДИ 1,005-8,95, р<0,05), его обострение при беременности (р<0,05 во всех случаях).

В структуре осложнений во время беременности у пациенток второй (88%) и третьей (55,0% против 0%; скорректированное ОШ 38,5; 95% ДИ 4,92 - 301,2, р<0,01) групп преобладала угроза прерывания, начиная с первого триместра (p<0,01 в обоих случаях). Обращает на себя внимание высокая частота острых респираторных заболеваний в первом триместре у женщин второй группы (28,0% против 8,0%; скорректированное ОШ 4,47; 95% ДИ 1,35-14,7, р<0,01). Беременность у женщин с угрозой прерывания во втором триместре чаще протекала на фоне анемии (р<0,05).

В контрольной группе у всех женщин беременность завершилась своевременными родами. У пациенток с угрозой прерывания в 44% случаев беременность завершилась преждевременными родами (р<0,01). В третьей группе у 18,3% женщин беременность завершилась поздним самопроизвольным выкидышем, у 73,3% женщин - преждевременными родами в сроке 28-33 недель (р<0,01 во всех случаях). В данной группе в 80% случаев диагностирован длительный безводный промежуток, среднее значение которого составило 140,64±31,28 часов (р<0,01).

Средняя масса новорожденных во второй группе составила 2695,4±107,3гр, в третьей - 1680,6±63,8гр (р<0,05 и р<0,01соответственно). Средняя масса доношенных новорожденных во второй группе составила 3072,0±137,8гр, что достоверно меньше, чем в первой группе (р<0,05). Перинатальные поражения ЦНС гипоксического генеза были выявлены у 38,0% детей второй группы, что достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,01) и у 86,7% детей третьей группы, что достоверно выше, чем в первой и второй группах (р<0,01 и р<0,05 соответственно). У детей второй и третьей группы достоверно чаще диагностировалась церебральная ишемия 2 степени (р<0,01). Церебральная ишемия 3 степени выявлена в 21,6% случаев в третьей группе. В контрольной группе и в группе женщин с угрозой прерывания данное заболевание не отмечалось (р<0,05 в обоих случаях). Перинатальные поражения ЦНС геморрагического генеза были выявлены у 20,0% детей второй группы, что достоверно чаще, чем в контрольной группе (р<0,01) и у 63,3% детей третьей группы, что достоверно выше, чем в первой и второй группах (р<0,01 и р<0,05 соответственно). У детей третьей группы в 31,7% случаев выявлено внутриутробное инфицирование, что достоверно выше, чем в первой и второй группах (р<0,01 и р<0,05 соответственно).

Неблагоприятное влияние инфекционного фактора на течение гестационного процесса и состояние плода хорошо изучено и связано с реализацией патогенных свойств возбудителей инфекций в организме матери и плода [Кравченко Е.Н., 2009; Saraswathy T.S. 2011]. Так ряд возбудителей способны оказывать тератогенное действие, прямое цитотоксическое действие на клетки (лимфоциты), вызывать изменения в системе гемостаза, тем самым, приводя к прерыванию беременности [Menon R., 2011; Estrada-Gutierrez G., 2010]. Считается, что персистирующая вирусная и бактериальная инфекция являются основными факторами, приводящими к прерыванию беременности [Kovo M., 2011; Zaga-Clavellina V., 2011].

При обследовании женщин на наличие урогенитальной инфекции методом ИФА установлено, что пациентки всех обследуемых групп имели высокий уровень инфицированности с преобладанием вирусно-бактериального инфицирования (57,1%, 47,3% и 60% соответственно). Частота выявления активной инфекции Ureaplasma Urealyticum у пациенток второй и третьей групп была достоверно выше, чем в контрольной (20,9% против 4,7%; скорректированное ОШ 5,33; 95% ДИ 1,18-45,9 и 24,0% против 4,7%; скорректированное ОШ 5,71; 95% ДИ 1,02-51,7, р<0,05). Частота выявления активной инфекции Mycoplasma Hominis у женщин в третьей группе была достоверно выше по сравнению с таковой в контроле (24,0% против 4,7%; скорректированное ОШ 5,71; 95% ДИ 1,02-51,7, р<0,05).

При патоморфологическом обследовании плацент от женщин с угрозой прерывания беременности в 22-33 недели диагностировано воспаление базальной децидуальной оболочки последа и стромы ворсин смешанной вирусно-бактериальной этиологии (р<0,05). Характерной особенностью воспаления явился васкулит стволовых ворсин с сужением просвета магистральных сосудов.

В плацентах женщин с ПРПО наряду с пролиферативным воспалением диагностирован экссудативный хориоамнионит, плацентарный хорионит и субхориальный интервиллузит. В плодных оболочках выявлена картина хориоамнионита и париетального децидуита (р<0,05), что патогенетически связано с восходящим инфицированием [Namba F, 2010].

Выявление причин преждевременных родов очень важно в каждом конкретном наблюдении, поэтому во многих странах мира применяется стратегия выделения факторов риска с учетом биологических и медицинских факторов в разных категориях беременных женщин. При оценке риска развития угрозы прерывания беременности в 22-33 недели нами установлено, что наиболее значимыми факторами риска развития данного осложнения беременности являются: медицинский аборт в анамнезе (ОШ=5,5), возраст пациенток до 20 лет (ОШ=5,41), активная уреаплазменная инфекция (ОШ=5,33), ОРЗ во время беременности (ОШ=4,47), хронический пиелонефрит (ОШ=4,23), эктопия шейки матки (ОШ=3,69), воспалительные заболевания генитального тракта (ОШ=3,16), первая беременность (ОШ=3,14).

Риск развития ПРПО повышается в 38 раз у женщин с угрозой невынашивания, в 17,9 раз у женщин, имеющих в анамнезе 2 и более медицинских аборта, в 14,9 раз - самопроизвольные выкидыши. Также риск ПРПО увеличивается у женщин с эктопией шейки матки - в 5,2 раза, с воспалительными заболеваниями генитального тракта - в 3,3 раза, у повторнородящих - в 2,6 раза.

В настоящее время большое значение имеет исследование иммунного статуса беременных. Установлено, что материнская иммунная система находится не в супрессивном, как считалось ранее, а в активированном состоянии [Сотникова Н.Ю., 2005]. С целью уточнения иммунных механизмов развития угрозы невынашивания и преждевременного разрыва плодных оболочек в 22-33 недели беременности было проведено исследование функциональной активности нейтрофилов на системном уровне.

При анализе характера внутриклеточной продукции нейтрофилами периферической крови IL-1в нами было установлено, что угроза невынашивания в сроке 22-33 недели и преждевременный разрыв плодных оболочек в этом сроке сопровождаются усилением продукции провоспалительных цитокинов (IL-1в) нейтрофилами (74,15% и 70,45% соответственно по сравнению с контролем, р<0,0001 в обоих случаях), что является признаком, свидетельствующим об активации периферических нейтрофилов при данных осложнениях беременности. Можно предположить, что выявленная усиленная внутриклеточная продукция IL-1 обусловлена наличием урогенитальных инфекций, которые по литературным данным могут выступать в роли триггера воспалительного ответа [Kazimierczac I.A., 2003]. Анализ относительного содержания в периферической крови беременных женщин нейтрофилов, экспрессирующих внутриклеточно IL-8, показал, что при угрозе невынашивания и при преждевременном разрыве плодных оболочек в сроке 22-33 недели уровень IL-8+ нейтрофилов был значительно повышен (77,45% и 76,95% соответственно по сравнению с таковым в контроле, р<0,0001 в обоих случаях). Полученные данные могут свидетельствовать о том, что, являясь сильным хемоаттрактантом [Tцrnblom S.A., 2005], IL-8 участвует в индукции направленного хемотаксиса нейтрофилов.

При анализе относительного содержания IL-1+ и IL-8+ нейтрофилов на системном уровне нами не выявлено зависимости данных параметров от срока (22-27 и 28-33 недели) беременности у женщин с угрозой невынашивания и при преждевременном разрыве плодных оболочек.

При оценке характера экспрессии СD62L молекул на поверхности периферических нейтрофилов нами было установлено, что угроза невынашивания беременности в 22-33 недели и ПРПО в эти же сроки сопровождались повышением количества CD62L+ нейтрофилов в периферической крови беременных женщин (62,85% и 66,85% соответственно, по сравнению с показателями контроля, р<0,001 в обоих случаях). При анализе относительного содержания периферических CD62L+ нейтрофилов нами не выявлено зависимости данного показателя от срока беременности (22-27 и 28-33 недель) у женщин второй и третьей групп (р>0,05 в обоих случаях).

Как известно, CD62L молекулы относятся к группе L- селектинов. Находясь на поверхности клеточной мембраны, этот гликопротеин обеспечивает клеточную адгезию к активированному сосудистому эндотелию в начальной фазе воспаления и выходу клеток из сосудистого русла в ткань [Kittipatarin C., 2010]. По-видимому, выявленное нами выраженное усиление экспрессии CD62L молекул на поверхности периферических нейтрофилов, у женщин с угрозой невынашивания беременности и при ПРПО по сравнению с таковым в группе женщин с не осложненной беременностью, может быть одним из механизмов, определяющих усиленную миграцию нейтрофилов в ткань шейки матки, плодные оболочки, плацентарную зону непосредственно перед развязыванием родовой деятельности.

Учитывая выявленные нами значительные изменения в экспрессии функциональных молекул на поверхности периферических нейтрофилов при угрозе невынашивания беременности и при преждевременном разрыве плодных оболочек в 22-33 недели, мы оценили также характер экспрессии нейтрофилами матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9) у данных групп женщин. Выбор именно этих молекул, относящихся к классу протеолитических ферментов, был продиктован тем, что по данным литературы MMР9 участвует в тканевом ремоделировании шейки матки [Gonzalez J.M., 2011]. При исследовании уровня экспрессии мРНК ММР9 периферическими нейтрофилами у женщин с угрозой невынашивания беременности в 22-33 недели было установлено значительное повышение данного показателя по сравнению с показателями контрольной группы (M±m=72,74±34,25 и 3,32±3,01 копий парЧ103/мкл соответственно, р<0,05). Причем, при анализе этого параметра в зависимости от срока гестации установлен достоверно более высокий его уровень в сроке 22-27 недель (Me=22,29 копий парЧ103/мкл), чем в контроле (p<0,02). С увеличением срока гестации (28-33 недель) уровень экспрессии мРНК ММР9 периферическими нейтрофилами снижался (Me=6,32 копий парЧ103/мкл) и не имел достоверных отличий от показателей контрольной группы и группы женщин с угрозой прерывания в 22-27 недель. По-видимому, это можно объяснить тем, что по мере увеличения срока беременности усиливается хоминг нейтрофилов, экспрессирующих мРНК ММР9, из сосудистого русла в ткани шейки матки.

Показатели экспрессии мРНК MMP9 нейтрофилами периферической крови женщин с ПРПО в 22-33 недели беременности не определялись, вероятно, за счет усиленного направленного процесса хоминга клонов в плодные оболочки, способствующего не только непосредственному разрушению структурных компонентов межклеточного матрикса, но и опосредованно вызывающего больший приток фагоцитов в децидуальную ткань, дегрануляция которых приводит к увеличению концентрации деструктивных веществ на локальном уровне.

Известно, что в защите организма от патогенов принимают участие две системы иммунологической защиты - реакции врожденного (естественного) и приобретенного (адаптивного) иммунитета [Макаров О.В., 2007]. На начальном этапе взаимодействия фагоцитов с патогенами происходит распознавание молекулярных паттернов на поверхности микроорганизмов с помощью паттерн-распознающих рецепторов, прежде всего Toll-like Receptors (TLRs) [Nitsche J.F., 2010]. Нами выявлено достоверное увеличение экспрессии мРНК TLR9 периферическими нейтрофилами женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели беременности по сравнению с показателями контрольной группы (0,65±0,25 копий парЧ103/мкл, p<0,01), в основном за счет поздних сроков (28-33 недели). Полученные данные могут свидетельствовать о процессах гиперактивации системы врожденного иммунитета, которые носят адекватный компенсаторный характер, что сдерживает развитие мощной воспалительной реакции и способствует пролонгированию беременности. По данным литературы [Witkin S.S., 2011] подобная гиперактивация TLR избирательно направлена на борьбу с микробными инфекционными агентами, не опосредуя процесса фагоцитоза, но запуская синтез цитокинов и усиливая переваривающую способность фагоцитов [Киселева Е.П., 2011].

Показатели экспрессии мРНК TLR9 нейтрофилами на системном уровне женщин с ПРПО в 22-33 недели беременности не определялись, вероятно, за счет усиления миграции нейтрофилов и макрофагальных субпопуляций в ткани шейки матки, плодные оболочки, плацентарную зону.

Показано, что связывание патогенов с TLR инициирует секрецию противомикробных пептидов [Макаров О.В., 2007]. Обеспечивая “мгновенный иммунитет”, противомикробные пептиды являются, с одной стороны, естественными эндогенными антибиотиками, а с другой - сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы активации клеток иммунной системы [Janeway Jr. C.A., 2002]. Нами было изучено содержание б-дефензинов в сыворотке крови у женщин при угрозе невынашивания в 22-33 недели. Установлено, что концентрация этого белка в данной группе была достоверно выше, чем у пациенток контрольной группы (722,05±67,92 и 405,04±45,94 пг/мл соответственно, р<0,05), что может свидетельствовать о выраженной противомикробной защите. Проведенная нами оценка особенностей содержания дефензинов-б в сыворотке крови беременных женщин с ПРПО в 22-33 недели показала, что концентрация этого показателя была также достоверно выше, чем у пациенток контрольной группы (868,44±99,14 и 405,04±45,94 пг/мл соответственно, р<0,05), что ассоциируется с наличием активной инфекции Ureaplasma Urealyticum и Mycoplasma Hominis в данной клинической группе и связано, по-видимому, с активацией TLR9.

Известно, что нейтрофилы периферической крови являются короткоживущими клетками [Ярилин А.А., 2010], поэтому мы не наблюдали одновременного повышения ими экспрессии мРНК TLR9 ввиду их направленной миграции в ткани. Кроме того, повышение содержания дефензинов-б на системном уровне у женщин с ПРПО было более выражено в сроке 22-27 недель, чем в 28-33 недель (1009,1±104,4 и 272,06±63,8 пг/мл соответственно, р<0,05), что свидетельствует о выраженности иммунологических изменений на более ранних сроках гестации с вовлечением других иммунных механизмов.

Для дополнительной оценки процессов противомикробной иммунной защиты при невынашивании беременности поздних сроков нами было оценено сывороточное содержание кальпротектина, являющегося одним из наиболее распространенных цитоплазматических протеинов нейтрофилов, обладающего выраженным бактерицидным и фунгицидным действием и секретирующимся в больших количествах при активации нейтрофилов в местах воспаления [Feng C., 2011; Dessing M.C., 2010]. Нами выявлено, что сывороточное содержание кальпротектина у женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели было достоверно ниже по сравнению с таковым в контрольной группе (3,1±0,49 и 6,22±1,32 мкг/мл соответственно, р<0,05). Очевидно, что при данной акушерской патологии активация нейтрофилов не сопровождалась адекватным усилением продукции кальпротектина, что может обуславливать нарушение формирования противоинфекционного ответа и приводить к развитию клинических признаков угрозы невынашивания беременности.

Мы не установили достоверных отличий в концентрации кальпротектина в сыворотке крови у женщин с ПРПО в 22-33 недели. Однако, наличие положительной корреляционной связи между уровнем б-дефензинов и кальпротектина может свидетельствовать об однонаправленной реализации биологических эффектов данных протеинов.

Проведенный корреляционный анализ не выявил функциональных связей между показателями активности периферических нейтрофилов в контрольной группе. При угрозе невынашивания беременности в 22-33 недели было выявлено 4 положительные корреляционные связи: IL-1в+ - IL-8+, IL-8+ - CD62L+, CD62L+ - мРНК TLR9, дефензины-б - кальпротектин. При преждевременном разрыве плодных оболочек в 22-33 недели было выявлено 3 функциональные связи: IL-1в+ - IL-8+, IL-8+ - CD62L+, дефензины-б - кальпротектин. Характер связей в группах менялся в зависимости от срока и исхода беременности, наличия признаков угрозы прерывания.

При ретроспективной оценке иммунологических показателей на системном уровне у женщин с угрозой невынашивания в зависимости от исхода беременности установлено, что имело место изменение только относительного содержания CD62L+ нейтрофилов. В группе женщин, беременность которых завершилась родами в срок, относительное содержание CD62L+ нейтрофилов составило 57,9%; в группе женщин, беременность которых завершилась преждевременными родами - 70,0%, что достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,001 в обоих случаях). Нами выявлено, что относительное содержание CD62L позитивных нейтрофилов в группе женщин, беременность которых завершилась преждевременными родами, было достоверно выше по сравнению с группой женщин, беременность которых завершилась родами в срок (р<0,05). На основании полученных данных был разработан способ прогнозирования исхода беременности при угрозе невынашивания в 22-33 недели по относительному содержанию CD62L+ нейтрофилов периферической крови. При его значении равном или более 65% прогнозируют преждевременные роды (приоритетная справка № 2011139011 от 26.09.2011г).

Резюмируя результаты проведенного исследования, можно заключить, что развитие угрозы прерывания в 22-33 недели беременности и ПРПО в эти же сроки ассоциировано с активацией факторов врожденного иммунитета на системном уровне при наличии инфекционного фактора.

Проведенные исследования позволили охарактеризовать функциональную активность нейтрофилов периферической крови, цитокин-, TLR- опосредованные механизмы формирования угрозы невынашивания в поздние сроки, роль противомикробных пептидов в данном осложнении беременности. Выявленная активация системы врожденного иммунитета, которая носит адекватный компенсаторный характер, сдерживает развитие мощной воспалительной реакции и способствует пролонгированию беременности. И, напротив, полученные данные о гиперактивации факторов врожденного иммунитета или неадекватном иммунном ответе могут обусловливать нарушение формирования противоинфекционного ответа и приводить к развитию клинических признаков угрозы невынашивания беременности и преждевременному разрыву плодных оболочек.

Выводы

Медико-биологическими факторами риска, влияющими на развитие угрозы невынашивания в сроке 22-33 недели беременности являются медицинский аборт в анамнезе (OШ=5,5), возраст пациенток до 20 лет (OШ=5,4), активная уреаплазменная инфекция (OШ=5,3), ОРЗ во время беременности (OШ=4,4); хронический пиелонефрит (OШ=4,2), эктопия шейки матки (OШ=3,6), воспалительные заболевания генитального тракта (OШ=3,1), первая беременность (OШ=3,1).

К медико-биологическим факторам, определяющим риск развития преждевременного разрыва плодных оболочек в 22-33 недели беременности, относятся угроза невынашивания (OШ=38,5), два и более аборта в анамнезе (OШ=17,9), самопроизвольные выкидыши в анамнезе (OШ=14,9), активная уреаплазменная (OШ=5,7) и микоплазменная инфекция (OШ=5,7); эктопия шейки матки (OШ=5,2), воспалительные процессы гениталий (OШ=3,3), хронический пиелонефрит (OШ=3,0).

Для женщин с угрозой прерывания беременности и женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек в 22-33 недели по сравнению с контрольной группой характерно повышение уровня периферических нейтрофилов, внутриклеточно продуцирующих IL-1в и IL-8, экспрессирующих CD62L молекулы, увеличение сывороточного содержания дефензинов-б. Только для угрозы прерывания беременности характерно повышение мРНК TLR9, MMP-9, снижение сывороточного уровня кальпротектина, для ПРПО - отсутствие экспрессии мРНК TLR9, MMP9 и изменений в уровне кальпротектина.

При угрозе прерывания беременности в 22-27 недель в отличие от показателей женщин контрольной группы отмечается усиление экспрессии периферическими нейтрофилами мРНК MMP9, а в 28-33 недели - мРНК TLR9. При преждевременном разрыве плодных оболочек отличия от показателей женщин с нормально протекающей беременностью отсутствуют.

Беременность, закончившаяся преждевременными родами при наличии угрозы прерывания в 22-33 недели, ассоциируется с высоким содержанием CD62L+ нейтрофилов в периферической крови. Повышение относительного содержания CD62L позитивных нейтрофилов периферической крови пациенток с угрозой прерывания в 22-33 недели беременности более 65% позволяет прогнозировать преждевременные роды с точностью 90%.

Характер корреляционных связей между показателями функциональной активности нейтрофилов различен при угрозе прерывания беременности и преждевременном разрыве плодных оболочек и зависит от срока и исхода беременности.

Практические рекомендации:

1. В группу риска на развитие угрозы невынашивания беременности в поздние сроки следует относить первобеременных женщин в возрасте до 20 лет, страдающих хроническим пиелонефритом, эктопией шейки матки, имеющих медицинский аборт и воспалительные заболевания гениталий в анамнезе, с активной уреаплазменной инфекцией и перенесших ОРЗ во время беременности.

2. В группу риска на развитие преждевременного разрыва плодных оболочек в сроке 22-33 недели беременности необходимо относить женщин в возрасте до 20 лет, страдающих хроническим пиелонефритом, эктопией шейки матки, имеющих два и более аборта, самопроизвольные выкидыши и воспалительные заболевания генитального тракта в анамнезе, с активной уреаплазменной и микоплазменной инфекцией, перенесших угрозу невынашивания во время беременности.

3. Для прогнозирования исхода беременности у женщин с угрозой невынашивания в 22-33 недели следует определять относительное содержание CD62L+ нейтрофилов в периферической крови. При значении содержания CD62L позитивных нейтрофилов равном или более 65% прогнозируют развитие преждевременных родов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Публикации в журналах, включенных в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ:

Павлов А.В., Панова И.А., Крошкина Н.В. Взаимосвязь сывороточного содержания кальпротектина с особенностями функционального состояния нейтрофилов периферической крови у женщин с угрозой прерывания беременности поздних сроков. - Российский иммунологический журнал - 2010, - Т.4(13), №4. - С. 408.

Панова И.А., Павлов А.В. Особенности экспрессии CD62L молекул и внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов нейтрофилами периферической крови женщин с преждевременным разрывом плодных оболочек // «Вестник Уральской медицинской академической науки» - 2010.- №2/1(29).- С.184-185.

Павлов А.В., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В., Панова И.А. Взаимосвязь уровня экспрессии МРНК TLR9 нейтрофилами периферической крови с исходом беременности у женщин с угрозой невынашивания поздних сроков // Медицинская иммунология.- Т.13, №4-5.- 2011.- С.435.

Павлов А.В., Крошкина Н.В., Панова И.А. Особенности продукции дефензинов, протеолитических ферментов и провоспалительных цитокинов нейтрофилами периферической крови при преждевременном разрыве плодных оболочек // «Вестник уральской медицинской академической науки». Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. - 2011. - №2/1(35).- С.57-58.

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:

1. Павлов А.В., Панова И.А., Крошкина Н.В., Сотникова Н.Ю. Особенности клинических проявлений угрозы недонашивания беременности в поздние сроки в зависимости от инфекционного статуса женщины // Материалы III Регионального научного форума «Мать и дитя» - Москва.- 2009.- С.206.

2. Павлов А.В., Панова И.А., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В. Особенности функционального состояния нейтрофилов периферической крови женщин с угрозой прерывания беременности в III триместре // Сборник научных трудов и материалов республиканской научно-практической «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности»- Минск.-2009.- С. 127-131.

3. Павлов А.В., Панова И.А., Крошкина Н.В., Сотникова Н.Ю. Изменение параметров активации нейтрофилов периферической крови при угрозе прерывания беременности поздних сроков // Проблемы репродукции (специальный выпуск по материалам IV международного конгресса по репродуктивной медицине) - Москва.- 2010.- С.107-108.

4. Павлов А.В., Панова И.А., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В. Изменение показателей экспрессии селектиновых молекул в периферической крови при преждевременном разрыве плодных оболочек // Сб. научн. тр. «Репродуктивное здоровье нового поколения»/ под ред. Малышкиной А.И. - Иваново: ОАО «Издательство «Иваново», 2010.- С.264-268.

5. Павлов А.В. Особенности экспрессии CD62L и продукции IL-1в периферическими нейтрофилами при угрозе прерывания беременности поздних сроков // Сб. научн. тр. «Репродуктивное здоровье нового поколения»/ под ред. Малышкиной А.И. - Иваново: ОАО «Издательство «Иваново», 2010.- С.370.

6. Павлов А.В., Крошкина Н.В., Панова И.А., Сотникова Н.Ю. особенности внутриклеточной продукции IL-1в нейтрофилами периферической крови при дородовом излитии околоплодных вод // Проблемы репродукции (материалы V международного конгресса по репродуктивной медицине) - Москва.- 2011.- с.67-68.

7. Павлов А.В., Панова И.А., Крошкина Н.В., Кулида Л.В. Особенности внутриклеточной продукции IL-1в и IL-8 нейтрофилами периферической крови у женщин с угрозой прерывания беременности поздних сроков при наличии инфекционного фактора // Актуальнi питання педiатрii, акушерства та гiнекологii. - Украина, Тернопiль.- 2011. - № 1.- С.216-219.

8. Павлов А.В., Лопухова Е.В., Манис С.С. Факторы риска развития преждевременного разрыва плодных оболочек при беременности 22-33 недели // Материалы V Регионального научного форума «Мать и дитя». - Геленджик.- 2011.- С.98.

Список условных сокращений

мРНК - матриксная рибонуклеиновая кислота

ПРПО - преждевременный разрыв плодных оболочек

ММР - матриксная металлопротеиназа

IL - интерлейкин

TLR - толл-подобный рецептор

CD62L - L-селектин

CD - молекулы дифференцировки лимфоидных клеток

ОШ - Скорректированное отношение шансов