Участие апоптоза и факторов его регулирующих в патогенезе гестоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Участие апоптоза и факторов его регулирующих в патогенезе гестоза

14.01.01 - «Акушерство и гинекология»

Мальгина Любовь

Иваново - 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологической помощи»

Научные руководители -

доктор медицинских наук Панова Ирина Александровна

доктор биологических наук Кудряшова Анна Владимировна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Охапкин Михаил Борисович

(ГОУ ВПО «Ярославская государственная

медицинская академия Росздрава»

Доктор медицинских наук, профессор Макаров Олег Васильевич

(ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Актуальность проблемы

Одним из наиболее тяжелых осложнений беременности является гестоз, который до сих пор, занимает ведущее место в структуре материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [Айламазян Э.К. и соавт, 2008, Савельева Г.М. и соавт.,2009]. Одним из важнейших механизмов регуляции гестационного процесса является апоптоз. В процессе гестации апоптоз необходим для децидуализации маточного эндометрия, адекватного ремоделирования тканей материнской децидуальной оболочки, инвазии развивающегося эмбриона, обеспечения иммунной толерантности к беременности, подготовке к родам [Joswig A., et al., 2003; Dai S.Y., et al, 2004; Ashton S.V., et al, 2004]. Нарушение апоптоза на системном и локальном уровнях отмечается при развитии осложнений беременности в том числе и гестоза [Сотникова Н.Ю. и др., 2008; Ishihara N. et.al., 2002; Sun L.Z. et.al.,2003; Austgulen R. et al.,2004]. Однако особенности апоптоза клеток плаценты при гестозе рассматриваются без учета локализации тканей цитотрофобласта в базальной децидуальной пластинке и в ворсинах хориона. Практически не исследованы характеристики апоптоза децидуальных клеток как при неосложненной беременности, так и при гестозе.

В работах ряда авторов было показано, что в плаценте при гестозе возникает дисбаланс в продукции про- и анти-апоптотических факторов [Levy R, 2002; Sun L.Z., et al, 2003; Aban M. et al, 2004; Ishioka S. et al.,2006, 2007]. Но данные, приводимые различными исследователями, не всегда соответствуют друг другу, что не позволяет сделать однозначных выводов о роли апоптоза в патогенезе гестоза.

Большинство исследователей показывают, что при гестозе в периферической крови матери и в плаценте усиливаются процессы активации иммунных клеток, что сопровождается повышением их готовности к апоптозу [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Панова И.А., 2007; Посисеева Л.В и соавт.,2008; Darmochwal-Kolarz D.,2002; Borzychowski A.M., 2005; Bachmayer N., 2006; Toldi G., 2008]. Однако характер апоптоза клеток иммунной системы при данной патологии остается практически не изученным. Остаются не исследованными характеристики раннего и завершенного апоптоза лимфоцитов и клеток макрофагального ряда при гестозе, как в периферической крови, так и на уровне плаценты. В литературе отсутствуют данные о характере синтеза клетками иммунной системы апоптоз-регулирующих белков APAF и XIAP при неосложненном течении беременности и при гестозе. Имеются лишь отдельные сведения о том, что изменения в балансе bcl-2 и р53 играют роль в развитии патологии плода и не столь значимы в регуляции апоптоза на системном уровне при гестозе [Веденеева М.В.,2006].

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что в регуляции апоптоза во время беременности важную роль играет TGF [Liu Z., et al, 2002; Smith S., et al, 2002]. В литературе имеются сведения о том, что TGF может оказывать как негативный, так и позитивный эффект в регуляции программируемой клеточной гибели [Dunker N., et al, 2002; Liu Z. et al., 2002]. Но работы о влиянии TGFв на апоптоз клеток при неосложненной беременности и при гестозе крайне не многочисленны [Chakraborty C, 2002; Lash G. E., 2005], и не исследуют характер апоптоз-регулирующего действия этого фактора на иммунокомпетентные клетки в периферической крови и в плаценте.

Таким образом, изучение характера апоптоза и его регуляции на генном и молекулярном уровнях в иммунных клетках периферической крови, децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона, в тканях плаценты при неосложненной гестозом беременности и при гестозе различной степени тяжести представляется несомненно актуальным.

Цель исследования: установить новые патогенетические механизмы развития гестоза у беременных женщин на основании изучения процессов генной регуляции апоптоза периферических и плацентарных лимфоцитов, моноцитов/макрофагов, клеток децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона на основании чего разработать критерии дифференциальной диагностики степени тяжести гестоза.

Задачи исследования:

1. Дать комплексную оценку характера течения беременности, родов и состояния здоровья новорожденных у женщин с гестозом.

2. Выявить особенности апоптоза лимфоцитов, моноцитов/макрофагов на системном и локальном уровнях при гестозе и установить характер экспрессии ими мРНК APAF и XIAP.

3. Выявить влияние TGFв2 на экспрессию мРНК проапоптотического белка APAF и антиапоптотического белка XIAP лимфоцитами и моноцитами/макрофагами периферической крови и плаценты при неосложненной беременности и гестозе.

4. Оценить выраженность апоптоза на уровне децидуальной базальной пластинки и ворсинчатого хориона при неосложненной беременности и гестозе.

5. На основании выявленных особенностей экспрессии про- и антиапототических факторов лимфоцитами периферической крови и клетками плаценты разработать критерии дифференциальной диагностики степени тяжести гестоза.

Научная новизна исследования:

Впервые показано, что при гестозе усиливается апоптоз периферических лимфоцитов, децидуальных лимфоцитов и макрофагов, лимфоцитов ворсинчатого хориона.

Впервые выявлено, что при гестозе нарушаются процессы регуляции апоптоза с увеличением экспрессии ингибирующих апоптоз факторов на уровне периферической крови и ворсинчатого хориона и усилением синтеза активирующих апоптоз факторов на уровне децидуальной оболочки.

Впервые установлены особенности влияния TGFв2 на апоптоз иммунокомпетентных клеток при беременности, которые проявляются в стимуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов, в подавлении апоптоза децидуальных макрофагов и в усилении экспрессии XIAP лимфоцитами и макрофагами децидуальной оболочки плаценты.

Впервые установлено увеличение содержания белка р53 в цитотрофобластических клетках базальной децидуальной оболочки, ворсинчатого хориона и уровня bcl-2 в синцитиотрофобластических клетках ворсинчатого хориона с нарастанием степени тяжести гестоза.

Практическая значимость исследования:

Предложен новый способ морфологической диагностики степени тяжести гестоза по определению уровня белков р53 и bcl-2 на уровне децидуальной базальной пластинки и ворсинчатого хориона (положительное решение о выдаче патента от 09.07.2010 по заявке №2009121396 на «Способ морфологической диагностики степени тяжести гестоза»).

Положения, выносимые на защиту:

Гестоз ассоциируется с нарушением процессов апоптоза и дисбалансом синтеза апоптоз-регулирующих факторов APAF и XIAP иммунокомпетентными клетками матери на системном и локальном уровнях, с повышением содержания р53 в клетках цитотрофобласта, и bcl-2 в синцитиотрофобласте, что приводит к нарушению плацентарного барьера, накоплению активированных клонов клеток иммунной системы и развитию цитотоксических и аутоиммунных реакций.

Изменение продукции TGFв2 при гестозе на системном и локальном уровнях ведет к нарушению регуляции апоптоза клеток периферической крови и плаценты. элиминации активированных клонов клеток путем апоптоза.

Определение уровня содержания в плаценте экспрессии р53 и bcl-2 у беременных женщин с гестозом позволяет проводить дифференциальную диагностику степени тяжести гестоза.

Внедрение результатов исследования в практику:

Предложенный способ морфологической диагностики степени тяжести гестоза прошел предрегистрационные испытания в отделение патоморфологии и электронной микроскопии ФГУ «Ив НИИ МиД им.В.Н.Городкова Росмедтехнологий».

Апробация работы: материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции по иммунологии репродукции в рамках Объединенного иммунологического форума (Санкт-Петербург, 2008), на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2008), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении») (Санкт-Петербург, 2009), на XIII Всеросийском научном Форуме с международным участием имени академика В.Н.Иоффе Дни иммунологии (Санкт-Петербург, 2009), на VII съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической конференции «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности» (Минск, 2009), на III Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Саратов, 2009), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 75-летию со дня рождения основателя института, В.Н. Городкова (Иваново, 2007), на конференции молодых ученых, памяти В.Н. Городкова (Иваново, 2009).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора: автором самостоятельно проводился набор материала по теме диссертации, обследование и лечение тематических больных, выполнена систематизация и компьютерная обработка полученных результатов.

Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, четыре главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 115 отечественных и 174 иностранных источников. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 24 фотографиями, 8 диаграммами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Всего обследовано 150 беременных женщин в III триместре. Среди пациенток были выделены основная группа - 100 женщин с гестозом разной степени тяжести (50 женщин с гестозом легкой и 50 - с гестозом тяжелой степени) и контрольная группа - 50 женщин без признаков гестоза. Степень тяжести гестоза определяли по бальной шкале Гоека в модификации Г.М.Савельевой (1996). Материалом для исследования служили периферическая кровь из локтевой вены, децидуальная ткань и ткань ворсинчатого хориона зрелой плаценты.

Проводилось общеклиническое обследование, в том числе общепринятое лабораторное и биохимическое обследование. Ультразвуковое исследование беременных женщин проводилось на аппарате Aloka SSD-650, кардиотокографическое исследование - на аппарате Analogic Fetalgard -2000.

Иммунологические методы исследования.

Исследование стадий апоптоза производили методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток Annexin V (CALTAG Laboratories, США) и пропидиумом иодидом (PI) (CALTAG Laboratories, США). Для определения экспрессии в клетках мРНК APAF и XIAP использовали количественный метод RT-PCR в реальном времени. Процедуру выделения тотальной РНК из клеток проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформ методом с использованием набора реагентов «Онкоскрин» ООО «ГеноТехнология» (Россия). Содержание TGFв2 оценивали методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) с использованием тест системы фирмы R&D Systems (США). Стимуляцию периферических мононуклеарных клеток и плацентарных эксплантов осуществляли рекомбинатным TGFв2 (R&D Systems, США) в концентрации 1000 пг/мл в течение 24 часов при 370С и 5% СО2. В качестве контроля использовали клетки и экспланты, инкубировавшиеся в аналогичных условиях в среде RPMI-1640 с 10% FСS.

Морфологические методы исследования. Комплексная оценка структурных изменений последа включала макроскопическое описание, органометрию плацент с определением массы, объема и площади материнской поверхности, световую микроскопию с использованием обзорных элективных методов окраски. Экспрессию апоптоз-регулирующих белков p53 и bcl2 в образцах ткани плаценты определяли методом иммуногистохимии с использованием моноклональных антител и реактивов для иммуногистохимического окрашивания фирмы «Dako» (Германия). Оценка результатов проводилась с учетом иммуногистохимического коэффициента, рассчитываемого по трехбалльной системе.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием персонального компьютера с набором стандартных программ в системе Windows XP 2000. Материалы исследования обрабатывались методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excell из комплекта Microsoft Office 2000.

Результаты исследования и их обсуждение:

Возраст обследованных женщин колебался от 15 до 40 лет. Соматические заболевания в анамнезе, среди которых преобладали детские инфекции и простудные заболевания, имели 100% беременных контрольной группы и 100% беременных основной группы. Женщины во всех исследуемых были сопоставимы по возрасту, перенесенным заболеваниям, по наличию самопроизвольных выкидышей и гинекологических заболеваний в анамнезе. Тяжелый гестоз при предыдущей беременности имели 5% основной группы против 2% в группе контроля. Обращает на себя внимание высокая частота экстрагенитальной патологии, выявленной во время беременности: у 88% женщин основной группы и у 36% контрольной группы (p<0,001). По литературным данным подавляющее большинство соматических заболеваний имеют тенденцию к прогрессированию во время гестационного процесса и, как правило, ухудшают течение беременности и исход родов [Гурьева В.М. и соавт., 2009]. Среди экстрагенитальной патологии в основной группе с гестозом чаще встречались артериальная гипертензия (p<0,001), вегетососудистая дистония по гипертоническому типу (p<0,001), хронический пиелонефрит (p<0,001), ожирение (p<0,001), диффузное увеличение щитовидной железы (p<0,001), хронический тонзиллит (p<0,001). что согласуется с литературными данными о роли экстрагенитальной патологии в развитии гестоза [Шалина Р.И., 2002; Савельева Г.М., 2005, Гурьева В.М. и соавт., 2009].

Изучение характера течения настоящей беременности показало, что осложнения гестационного процесса имели место у 100% обследованных основной группы и 24% контрольной группы (p<0,001). Развитие тяжелых форм гестоза характеризовалось ранним началом, длительным течением и более выраженными клиническими проявлениями [Сидорова И.С., 2004; Савельева Г.М., 2005].

Наиболее неблагоприятными исходами беременности отличается группа с тяжелыми формами гестоза. У женщин этой группы чаще встречались преждевременные роды (в 48,0% случаев), рождение ребенка с перинатальной патологией у 64,7% женщин (СЗРП, перинатальные поражения ЦНС гипоксического и геморрагического генеза, инфекционно- воспалительная патология), что согласуется с современным мнением ведущих ученых [Сидорова И.С., 2004; Савельева Г.М., 2005, Гурьева В.М. и соавт., 2009].

Таким образом наиболее значимыми факторами риска развития гестоза являются: высокая частота экстрагенитальных заболеваний (вегетососудистая дистония по гипертоническому типу, артериальная гипертензия, ожирение, хронический пиелонефрит, хронический тонзиллит, диффузное увеличение щитовидной железы).

С целью уточнения роли иммунных механизмов в патогенезе гестоза мы исследовали изменения апоптоза лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, а также механизмов его эндо- и экзогенной регуляции на системном и локальном уровне при беременности неосложненной гестозом и при гестозе.

Независимо от характера инициирующего сигнала к апоптозу, приобретение клеткой способность фиксировать белок AnnexinV свидетельствует о вступлении клетки в состояние апоптоза. Клетки, находящиеся на ранних, обратимых этапах апоптоза, не способны накапливать внутриклеточно PI и имеют фенотип AnnexinV+PI-. В тех случаях, когда апоптоз клеток приобретает необратимый характер, PI свободно поступает в цитоплазму гибнущей клетки, такие клетки приобретают фенотип AnnexinV+PI+.

По нашим данным в периферической крови беременных с гестозом отмечалось повышенное по сравнению с показателями в контрольной группе содержание AnnexinV+ периферических лимфоцитов (20,30±0,94 в контрольной группе; 27,561,49 в группе с легким гестозом, p<0,001; 24,231,47 в группе с тяжелым гестозом, p<0,02), но находящихся на ранних, обратимых, этапах апоптоза (15,780,91 в контрольной группе, 19,640,83 в группе с легким гестозом, p<0,001; 19,220,60 в группе с тяжелым гестозом, p<0,001). Только при гестозе легкой степени было выявлено и повышенное содержание лимфоцитов, находящихся на поздних этапах апоптоза по сравнению с показателями контрольной группы (4,370,67 в контрольной группе, 7,411,09 в группе с легким гестозом, p<0,02). При тяжелом гестозе данный показатель не отличался от такового в группе женщин без гестоза (p>0,05). Нарушение завершенности апоптоза периферических лимфоцитов при тяжелом гестозе может приводить к накоплению активированных ЦТЛ и ЕК, отмечаемому большинством авторов при гестозе [Matthiesen L. et al.,2005; Sharma A. et al., 2007; Панова И.А., 2006; Мамалыга, 2008] и способствовать развитию цитотоксических реакций в различных органах и тканях при гестозе [Панова И.А., 2006; Мамалыга, 2008].

Процесс апоптоза клеток, регулируется различными экзо- и эндогенными сигналами, среди которых важная роль принадлежит проапоптотическому фактору APAF и антиапоптотическому - XIAP [Goyal L., 2001; Holcik M. et al., 2001; Schimmer A.D., 2004; Gupta S. et al., 2005]. Как показали результаты RT-PCR, отмеченное нами при гестозе повышение содержания AnnexinV-позитивных периферических лимфоцитов, не определялось усилением экспрессии мРНК проапоптотического белка APAF, так как во всех исследуемых группах уровень экспрессии мРНК APAF лимфоцитами был крайне незначителен (0,560,56 в контрольной группе, 2,402,40 в группе с легким гестозом; 0,160,16 в группе с тяжелым гестозом; p>0,05 во всех случаях). Известно, что белок APAF играет важную роль в митохондриальном пути апоптоза клеток [Schimmer A.D., 2004; Gupta S. et al., 2005]. Вероятно, митохондриальный путь апоптоза не имеет большой значимости для лимфоцитов периферической крови, как при неосложненной беременности, так и при гестозе. Это согласуется с данными других исследователей, которые показали, что для иммунных клеток периферической крови основным является апоптоз, включаемый рецепторами плазматической мембраны [Самуилов В.Д., 2001]. В тоже время, нами было отмечено достоверное снижение экспрессии периферическими лимфоцитами антиапоптотического белка XIAP при легкой и тяжелой степени гестоза по сравнению с показателями в контрольной группе (5,05±1,75 в контрольной группе, 0,740,22 в группе с легким гестозом, p<0,05; 0,460,06 в группе с тяжелым гестозом, p<0,02). Известно, что XIAP не влияет на индукцию апоптоза, но способен подавлять эффекторные механизмы данного процесса, связывая активные формы каспазы-3, -7 и -9, то есть подавлять переход апоптоза в заключительную фазу деградации клеток [Фильченков А.А., 2003; Schimmer A.D., 2004]. Таким образом, отмеченное нами усиление ранних обратимых этапов апоптоза периферических лимфоцитов при гестозе могло быть обусловлено угнетением синтеза XIAP.

Одним из важнейших экзогенных факторов регуляции апоптоза является TGF, способный осуществлять проапоптотическое действие на уровне каспаз [Cain R et al.,2001; Kim V., 2004; Shooner J., 2005; Kabovashi D. et al., 2005; Konrad М., 2006,]. Результаты наших исследований свидетельствуют о сниженном уровне TGFв2 в периферической крови при гестозе легкой степени тяжести по сравнению с группой контроля (3,43±0,38 в контрольной группе, 2,33±0,36 в группе с легким гестозом, p<0,05), при отсутствии достоверных изменений в сывороточном содержании TGFв2 при тяжелом гестозе (3,35±0,27, p>0,05). гестоз лимфоцит беременность

В эксперименте in vitro TGFв2 вызывал повышение содержания апоптирующих периферических лимфоцитов во всех исследуемых группах, в большей степени стимулируя развитие поздних этапов апоптоза (p<0,001 во всех исследуемых группах). Увеличение уровня погибших лимфоцитов после стимуляции TGFв2 отмечалось только в группах без гестоза и с тяжелым гестозом (p<0,05 по сравнению с 24-часовым контролем в обеих группах). По данным RT-PCR TGFв2 во всех группах не оказывал существенного влияния на показатели экспрессии периферическими лимфоцитами мРНК APAF (p>0,05 по сравнению с 24-часовым контролем во всех группах), но достоверно усиливал синтез XIAP при беременности неосложненной гестозом (p<0,05).

Анализируя характер апоптоза моноцитов, мы установили, что не зависимо от тяжести гестоза отмечалась лишь тенденцию к увеличению периферических моноцитов, вступивших в апоптоз и находящихся на ранних этапах апоптоза, по сравнению с группой контроля (p>0,05 во всех случаях). Уровень периферических моноцитов, находящихся на необратимых этапах апоптоза, оставался неизменным по сравнению с контрольной группой и не зависел от степени гестоза (p>0,05 во всех случаях). Экспрессия мРНК XIAP моноцитами также имела лишь тенденцию к увеличению в обеих исследуемых группах с гестозом (p>0,05 во всех случаях). Во всех исследуемых группах в моноцитах не амплифицировалась мРНК APAF.

Стимуляция препаратом TGFв2 во всех исследуемых группах приводила к переходу моноцитов на необратимые этапы апоптоза (p<0,001 в группе без гестоза; p<0,001 в группе с легким гестозом; p<0,02 в группе с тяжелым гестозом, по сравнению с показателями 24-часового контроля), а в группе с тяжелым гестозом у к увеличению уровня погибших клеток (p<0,02). При этом во всех исследуемых группах TGFв2 не оказывал какого-либо влияния на показатели экспрессии мРНК APAF и XIAP.

Полученные нами данные свидетельствовали о том, что в периферической крови женщин с гестозом, особенно при его тяжелых формах, отмеченное рядом авторов накопление активированных лимфоцитов и моноцитов [Панова И.А., 2008; Мамалыга И.Н., 2009; Darmochwal-Kolarz D. et al., 2002; Dimitracova Dzhambazova E. et al., 2005; Sargent I.L. et al., 2006], может определяться нарушением завершенности апоптоза. Вероятно, эти изменения апоптоза периферических лимфоцитов и моноцитов при гестозе определяются угнетением синтеза XIAP лимфоцитами и снижением влияния TGFв2 в результате нарушения экспрессии его рецепторов, либо в результате недостаточного уровня его продукции, как это отмечалось при легкой степени гестоза.

При проведении иммуногистохимических исследований экспрессии проапоптотического белка р53 и антиапоптотического белка bcl-2 в различных структурах плаценты мы выявили различное распределение этих факторов в децидуальной оболочке и в хорионе плаценты как при беременности, протекавшей без гестоза, так и при гестозе. Так, нами впервые было показано, что в децидуальных клетках базальной пластинки экспрессия р53 и bcl-2 не определялась ни при неосложненной беременности, ни при гестозе. Как в норме, так и при гестозе белок р53 в максимальной степени накапливался в ядрах клеток цитотрофобласта в децидуальной базальной пластинки и в единичных клетках цитотрофобласта ворсин хориона.

Анализируя полученные нами данные, мы установили, что в контрольной группе проапоптотический белок р53 максимально экспрессировался в клетках цитотрофобласта базальной децидуальной оболочки (12% клеток), и в единичных случаях в цитотрофобласте в ворсинчатом хорионе (1 % клеток). С другой стороны, антиапоптотический белок Bcl-2 содержался в ворсинчатом хорионе, и не определялся в базальной децидуальной оболочке. Вероятно, в норме усиление экспрессии р53 и отсутствие выраженной продукции bcl-2 в базальной децидуальной оболочке является одним из механизмов отторжения плаценты во время родов, что подтверждается выводами других авторов [Adachi S. et al., 1997; Narita M. et al., 1998]. Нами так же отмечено увеличение проапоптотического белка р53 в группе женщин, беременность которых протекала на фоне легкого гестоза в базальной децидуальной оболочке. С другой стороны нами обнаружено увеличение количества антиапоптотического белка Bcl-2. Наблюдаемый нами дисбаланс между проапоптотическим и антиапоптотическим факторами совпадает и не противоречит ранее опубликованным сведениям о соотношении проапоптотических и антиапоптотических белков при легкой степени тяжести гестоза. Несомненно, дисбаланс между изучаемыми факторами является одной из этиологических причин развития гестоза.

Анализируя полученные нами данные, мы выявили повышенное содержание проапоптотического белка р53 в базальной децидуальной оболочке в группе женщин, беременность которых протекала на фоне тяжелого гестоза. Уровень антиапоптотического белка Bcl-2 в синцитиотрофобласте так же увеличивался с утяжелением гестоза. По нашему мнению, увеличение синтеза и секреции проапоптотического фактора в 4,3 раза по сравнению с контролем по мере утяжеления гестоза сопровождается повышением экспрессии антиапоптотического белка, что расценено как компенсаторная реакция в зонах формирования синцитиальных почек в связи с повышением интенсивности апоптоза цитотрофобластических клеток при тяжелой степени тяжести гестоза. Таким образом, по нашему мнению, развитие гестоза на локальном уровне сопровождается превалированием продукции про-апоптотических факторов при недостаточной компенсации со стороны антиапоптотических факторов. Вероятно, именно эти процессы приводят к усилению апоптоза. Отсутствие выраженной экспрессии р53 и bcl-2 в децидуальных клетках позволяют предположить, что митохондриальный путь апоптоза не играет существенной роли в их апоптозе. В цитотрофобластических клетках децидуальной базальной пластинки и ворсин хориона, как при неосложненной беременности, так и при гестозе, данный путь регуляции апоптоза представляется значимым. Это подтверждается нашими результатами о корреляции уровня экспрессии р53 в клетках цитотрофобласта в децидуальной базальной пластинке и в ворсинах хориона с развитием гестоза.

При развившемся гестозе нами отмечалось нарушение созревания ворсинчатого хориона по диссоциированному типу. При гестозе обращала на себя внимание неравномерная толщина цитотрофобластического слоя в базальной децидуальной оболочке за счет чередования участков истончения, где клетки располагались в 2-3 ряда, с зонами цитотрофобластической пролиферации. Количество эозинофильных, активно секретирующих форм клеток цитотрофобласта, в базальной пластинке несколько меньше количества больших децидуальных клеток.

Исследование апоптоза иммунных клеток в плаценте показало, что при легкой и тяжелой степени гестоза по сравнению с показателями контрольной группы повышалось содержание AnnexinV+ (p<0,01 и p<0,001, соответственно) и AnnexinV+PI- (p<0,02 и p<0,001, соответственно) децидуальных лимфоцитов. Только при гестозе легкой степени в децидуальной оболочке плаценты также как и в периферической крови, отмечалось увеличение количества лимфоцитов, находящихся на необратимых этапах апоптоза, но лишь на уровне тенденции (p>0,05). Для децидуальных макрофагов при гестозе было характерным, достоверное повышение уровня клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза (p<0,02 в группе с легким гестозом и p<0,001 в группе с тяжелым гестозом) и тенденция к снижению уровня клеток, находящихся на поздних этапах апоптоза (p>0,05 в обоих случаях).

Эти изменения характера апоптоза иммунных клеток в тканях плаценты могли вызывать те же патологические реакции со стороны активированных цитотоксических клеток, В-лимфоцитов и макрофагов, которые отмечаются на системном уровне.

В отличие от периферической крови при неосложненной беременности и при гестозе децидуальные лимфоциты и макрофаги в высокой степени экспрессировали мРНК проапоптотического белка APAF, уровень экспрессии XIAP соответствовал таковому в периферической крови. Причем, при гестозе в децидуальной оболочке плаценты отмечалось многократное усиление синтеза проапоптотического белка APAF лимфоцитами (7,181,28 в контрольной группе, 36,599,40 в группе с гестозом, p<0,05) и макрофагами (7,77±2,18 в контрольной группе, 33,67±8,05 в группе с гестозом, p<0,01). Характер экспрессии мРНК XIAP децидуальными лимфоцитами и макрофагами при гестозе не отличался от такового при неосложненной беременности (p>0,05).

Полученные нами данные о повышении синтеза APAF свидетельствовали об усилении митохондриального пути апоптоза иммунными клетками на уровне децидуальной оболочки плаценты и о высокой значимости XIAP в регуляции этого процесса. Отмеченные нами особенности синтеза про- и анти-апоптотического белков на уровне децидуальной оболочки плаценты показали, что при неосложненной беременности в популяциях лимфоцитов и макрофагов также как и в периферической крови преобладало апоптоз-ингибирующее влияние XIAP, в то время как при гестозе превалировало апоптоз-активирующее влияние APAF. Это позволило нам предположить, что при гестозе на уровне децидуальной оболочки плаценты механизмы инициации апоптоза лимфоцитов и макрофагов значительно отличались от аналогичных в периферической крови, а усиление апоптоза иммунных клеток определялось высоким уровнем экспрессии APAF.

Исследование особенностей влияния TGFв2 на показатели апоптоза децидуальных мононуклеарных клеток показало, что в группе без гестоза фактор роста не вызывал существенных изменений показателей раннего и позднего апоптоза лимфоцитов (р>0,05 в обоих случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля), но угнетал переход макрофагов в необратимый апоптоз (p<0,05). Стимуляция клеток препаратом TGFв2 в группе с гестозом приводила к достоверному повышению уровня апоптирующих лимфоцитов, вызывая усиление, как ранних, так и необратимых этапов их апоптоза (p<0,01 в обоих случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля). Действие TGFв2 на апоптоз децидуальных макрофагов при гестозе было аналогичным в контрольной группе и определялось снижением уровня апоптирующих децидуальных макрофагов, в результате угнетения содержания клеток, находящихся на поздних этапах апоптоза (p<0,05 в обоих случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля).

По данным RT-PCR при неосложненной гестозом беременности и при гестозе TGFв2 не влиял на экспрессию мРНК APAF лимфоцитами и макрофагами децидуальной оболочки (p>0,05 во всех случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля), но усиливал синтез XIAP в обеих клеточных популяциях (p<0,05 во всех случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля).

Вероятно, неоднозначность воздействия TGFв2 на апоптоз децидуальных лимфоцитов и макрофагов определяется особенностями экспрессии его рецепторов в различных клеточных пулах и исходным характером процессов инициации их апоптоза в норме и при патологии. Отсутствие значимых изменений в регуляции раннего и позднего апоптоза децидуальных мононуклеарных клеток при воздействии TGFв2 в группе без гестоза могло быть обусловлено низким уровнем экспрессии его рецепторов, а изменения в группе с гестозом - усилением экспрессии рецепторов к TGFв. Косвенным подтверждением высказанного нами предположения могут служить полученные данные об усилении продукции TGFв2 в децидуальной оболочке при легкой и тяжелой степени гестоза, свидетельствующие о высокой значимости данного фактора роста в процессах иммунорегуляции на локальном уровне при гестозе. Возможно, при гестозе TGFв2 усиливал лишь рецептор-опосредованный путь апоптоза децидуальных лимфоцитов, так какпоказано, что TGFв влияет именно на рецепторный путь апоптоза в различных клетках, индуцируя экспрессию Fas и активацию каспазы-8 [Freathy I. et al., 2000; Cain R. et al.,2001; Kim S.G., 2004]. При этом стимулированный фактором роста синтез XIAP не был достаточным для блокирования данного процесса. Изменения параметров апоптоза децидуальных макрофагов при воздействии TGFв2 при гестозе были иными, чем в популяции децидуальных лимфоцитов. Возможно, для них индукция синтеза антиапоптотических факторов, таких как XIAP, при воздействии TGFв2 была более значимой.

Изменения при гестозе параметров апоптоза лимфоцитов и макрофагов ворсинчатого хориона были минимальными. Для обеих клеточных популяций при гестозе было характерным небольшое повышение содержания клеток, находящихся на поздних этапах апоптоза (p<0,05 в популяции лимфоцитов и p>0,05 в популяции макрофагов, по сравнению с показателями контрольной группы). Характер экспрессии APAF лимфоцитами и макрофагами ворсинчатого хориона не различался в сравниваемых группах, но при гестозе было выявлено снижение синтеза XIAP лимфоцитами (p<0,05). Выявленные нами изменения могли отражать развитие компенсаторных реакций, подавляющих патологическое воздействие активированных иммунных клеток в системной циркуляции плода. По данным литературы снижение готовности к апоптозу пуповинных ЦТЛ и 56+ ЕК, уменьшение уровня апоптирующих лимфоцитов, усиление экспрессии FasL на поверхности ЦТЛ и ЕК является одним из патогенетических механизмов поражения ЦНС плода [Серкина Е.В., 2008]. Кроме того, именно в ворсинчатом хорионе по данным иммуногистохимического исследования при гестозе отмечалось усиление продукции bcl-2 в синцитиотрофобласте, что можно также рассматривать как компенсаторную реакцию, способствующую сохранению структуры хориона в окружении повреждающих факторов. Нарушение этих компенсаторных реакций могло определять максимальную выраженность апоптотических процессов в цитотрофобласте базальной децидуальной пластинке, в ворсинчатом хорионе и межворсинчатом пространстве при тяжелых формах гестоза.

Результаты эксперимента показали, что на уровне ворсинчатого хориона TGFв2 вызывал однотипные апоптоз-регулирующие реакции при неосложненной гестозом беременности и при гестозе. В обеих исследуемых группах усиливался AnnexinV+ лимфоцитов под воздействием TGFв2 (p<0,05 в контрольной группе и p<0,001 в группе с гестозом по сравнению с показателями 24-часового контроля). Но в группе без гестоза рост апоптирующих лимфоцитов определялся стимуляцией ранних этапов апоптоза (p<0,01 по сравнению с показателями 24-часового контроля), а в группе с гестозом его поздних этапов (p<0,001 по сравнению с показателями 24-часового контроля). Стимуляция TGFв2 не вызывала достоверных изменений в показателях раннего и позднего апоптоза макрофагов ворсинчатого хориона в обеих исследуемых группах (p>0,05 во всех случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля).

В ворсинчатом хорионе TGFв2 не вызывал изменений в экспрессии мРНК анализируемых апоптоз-регулирующих генов лимфоцитами и макрофагами при неосложненной гестозом беременности и лимфоцитами в группе с гестозом (p>0,05 по сравнению с показателями 24-часового контроля во всех случаях). Усиление экспрессии мРНК XIAP макрофагами при воздействии фактора роста отмечалось только в группе с гестозом (p<0,05 по сравнению с показателями 24-часового контроля). Вероятно апоптоз-регулирующее влияние TGFв2 на иммунные клетки плодового происхождения, также как и на клетки периферической крови матери в большей степени затрагивает рецептор-опосредованный путь апоптоза.

Таким образом, развитие гестоза ассоциируется с изменением апоптоза клеток иммунной системы и тканей плаценты. Дисбаланс продукции апоптоз-регулирующих факторов с усилением влияния проапоптотического белка р53 по-видимому лежит в основе усиление апоптоза в плаценте при гестозе, что приводит к повреждению фетоплацентарного барьера и усиленному поступлению в кровоток матери микрочастиц трофобласта и клеток плодового происхождения. Повышенная антигенная стимуляция материнской иммунной системы в свою очередь может инициировать цитотоксические и аутоиммунные реакции, обусловливая полиорганную недостаточность при гестозе и повреждение тканей плаценты, что формирует порочный круг патологических реакций. Нарушение эндо- и экзогенной регуляции иммунного апоптоза на генном и молекулярном уровнях, приводящее к накоплению активированных цитотоксических лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, вероятно, способствует развитию этих реакций.

Определение уровня содержания в плаценте экспрессии р53 и bcl-2 у беременных женщин с гестозом позволяет проводить дифференциальную диагностику степени тяжести гестоза.

Выводы

Установлено, что гестоз чаще возникает у женщин, страдающих экстрагенитальной патологией (артериальная гипертензия, ВСД по гипертоническому типу, хронический пиелонефрит, ожирение, диффузное увеличение щитовидной железы, хронический тонзиллит); беременность у которых чаще осложняется угрозой прерывания, фетоплацентарной недостаточностью, преждевременными родами, возникновением перинатальной патологии у новорожденных (СЗРП, перинатальное поражение ЦНС, инфекционно-воспалительные заболевания) и перинатальных потерь.

У женщин с гестозом увеличивается количество лимфоцитов периферической крови, лимфоцитов и макрофагов децидуальной оболочки, находящихся на обратимых этапах апоптоза, и лимфоцитов ворсинчатого хориона на необратимых этапах апоптоза, при гестозе легкой степени повышается содержание периферических лимфоцитов, находящихся на необратимых этапах апоптоза.

Для женщин с гестозом характерно снижение уровня экспрессии мРНК XIAP периферическими и трофобластическими лимфоцитами и усиление синтеза APAF лимфоцитами и макрофагами децидуальной оболочки.

При гестозе легкой степени уровень TGFв2 снижается в периферической крови и повышается в децидуальной оболочке плаценты.

В эксперименте in vitro при гестозе TGFв2 усиливает апоптоз децидуальных лимфоцитов и экспрессию мРНК XIAP макрофагами ворсинчатого хориона; при беременности независимо от наличия гестоза - усиливает апоптоз лимфоцитов и моноцитов периферической крови, лимфоцитов ворсинчатого хориона, но угнетает апоптоз децидуальных макрофагов и стимулирует синтез XIAP иммунокомпетентными клетками децидуальной оболочки плаценты.

При гестозе нарушается продукция факторов, регулирующих апоптоз: усиливается экспрессия молекул р53 в цитотрофобластических клетках базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона, и повышается экспрессия молекул bcl-2 в синцитиотрофобластических клетках ворсинчатого хориона, выраженность этих изменений нарастает с утяжелением степени гестоза.

1.В группу риска на развитие гестоза следует относить женщин с экстрагенитальной патологией (артериальная гипертензия, ВСД по гипертоническому типу, хронический пиелонефрит, ожирение, диффузное увеличение щитовидной железы, хронический тонзиллит).

2. Для уточнения степени тяжести гестоза целесообразно проводить иммуногистохимическое исследование плаценты, полученной после родов от женщин с гестозом, с определением индекса экспрессии маркеров апоптоза p53 и bcl-2. При значении p53 равном или более 2,4 у.е. и bcl-2 равном или более 2,2 у.е. диагностируют гестоз тяжелой степени, а при значении p53 2,0-2,39 у.е. и bcl-2 1,8-2,19 у.е. диагностируют гестоз легкой степени тяжести.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:

1.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Мальгина Л.Ю., Панова И.А. Влияние трансформирующего фактора роста бета-2 на показатели апоптоза децидуальных лимфоцитов и макрофагов // Аллергология и иммунология. -2009.- т.10, №2.- С.170-171.

2.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мальгина Л.Ю., Мамалыга И.Н. Нарушение регуляции апоптоза лимфоцитов при гестозе // Медицинская иммунология.- 2009.- Т.11.- № 4-5.- С.411.

3.Кудряшова А.В., Мальгина Л.Ю. Характер экспрессии апоптоз-регулирующихгенов лимфоцитов и моноцитов/макрофагов периферической крови, децидуальной оболочки плаценты и тканях ворсинчатого хориона при гестозе // Вестник Уральской Медицинской Академической науки (Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии). - 2010. - №2/1(29) С.156.

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:

1. Kudryashova A.V., Sotnikova N.Yu., Malgina L.Yu., Panova I.A. The influence of the transforming growth factor beta (TGF-в2) upon the parameters of apoptosis of decidual lymphocytes and macrophages // New horizons in allergy, asthma and immunology / Ed. R. Sepiashvili.- Bologna, Italy.: MEDIMOND- 2009.- P.173-177.

2.Мальгина Л.Ю., Кудряшова А.В., Панова И.А. Параметры апоптоза периферических лимфоцитов при гестозе и возможности их регуляции трансформирующим фактором роста-бета2. // Вестник Российской военно-медицинской академии (Приложение). -2009. - Ч.II.- №1(25).- С.499.

3.Сарыева О.П., Мальгина Л.Ю., Панова И.А. Клинико-морфологическая характеристика плацент при различных степенях тяжести гестоза // Вестник Российской военно-медицинской академии (Приложение). - 2009. - Ч.I.- №1(25).- С.187.

4.Кудряшова А.В., Панова И.А., Мальгина Л.Ю. Дозовая зависимость регуляции этапов апоптоза периферических лимфоцитов трансформирующим фактором роста - бета2 при физиологической беременности и гестозе // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России.- Москва.- 2008.- С.135-136.

5.Мальгина Л.Ю., Сарыева О.П. Морфологические изменения в плацентах при гестозе различной степени тяжести // Материалы 89-й ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки-2009».- Иваново: 2009.- С.29.

6.Сарыева О.П., Мальгина Л.Ю., Перетятко Л.П., Панова И.А. Особенности воспаления в плаценте при беременности, осложненной гестозом различной степени тяжести // Материалы III Регионального научного форума «Мать и дитя» - М., 2009.- С.245-246.

7.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мальгина Л.Ю. Регуляция апоптоза децидуальных лимфоцитов и макрофагов трансформирующим фактором роста бета-2 // Сборник научных трудов и метериалов республиканской научно-практической «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности» - Минск.-2009.- С. 143-147.

8. Мальгина Л.Ю., Кудряшова А.В., Панова И.А. Механизмы регуляции апоптоза клеток иммунной системы при неосложненной беременности и гестозе // Проблемы репродукции (специальный выпуск по материалам IV международного конгресса по репродуктивной медицине) - Москва.- 2010.- С.93-94.

Размещено на Allbest.ru