Експериментальне вивчення церебропротекторних властивостей глюкозаміну та його похідних

Вплив похідних глюкозаміну на виживаність, ступінь розвитку неврологічного дефіциту та рухливість на моделі гострого порушення мозкового кровообігу. Аналіз його зв'язку з морфологічною картиною та функціональними показниками головного мозку тварин.

Рубрика Медицина
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 30.09.2018
Размер файла 434,4 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Експериментальне вивчення церебропротекторних властивостей глюкозаміну та його похідних

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Незважаючи на значний прогрес у сучасній медицині, гострі цереброваскулярні розлади, в першу чергу інсульт головного мозку, залишаються глобальною медико-соціальною проблемою, зумовлюючи високий рівень смертності та інвалідизації. Згідно даним ВООЗ, цереброваскулярна патологія посідає друге місце серед неінфекційних причин смерті у світі (Brown D.L., 2007; Mathers C.D. et al., 2008). Окрім смертності, інсульт є причиною помірної та стійкої втрати працездатності, залишаючи значну кількість пацієнтів інвалідами, що потребують допомоги навіть для виконання повсякденних завдань (Tuelsen T. et al., 2001; Gijsen R. et al., 2001).

В Україні мозковий інсульт посідає друге місце у структурі смертності. Захворюваність у 2006 р. становила 281,2 випадки на 100000 населення на рік (Міщенко Т.С., 2009), що майже вдвічі перевищує цей показник у розвинених країнах західної Європи та світу (Бурчинський С.Г., 2009). Померло від інсульту в Україні у 2008 році 42 тисячі осіб (Черенько Т.М., 2009).

У загальній структурі гострих порушень мозкового кровообігу (ГПМК) у світі на долю ішемічних припадає більше 80% (Ito H. et al., 2008; AHA, 2009).

Церебральна ішемія є метаболічним етапом процесу ішемічного інсульту, в основі якого полягають універсальні реакції тканини мозку на пошкоджуючий вплив зовнішніх факторів (Скворцова В.И., 2006). Основними патобіохічічними ланками пошкодження клітин головного мозку при ішемії, згідно сучасних уявлень, є порушення вуглеводно-енергетичного обміну, розвиток лактацидозу та активація вільнорадикального окиснення (ВРО). Неконтрольоване утворення активних форм кисню призводить до перекисного окиснення ліпідів, окисної модифікації білків та змін у циклі окису азоту.

Наслідки гострої фокальної ішемії, ступінь її пошкоджувальної дії залежать від тяжкості та тривалості зниження мозкового кровотоку та активності антиоксидантної системи організму (Coleman E.A. et al., 2004).

За умов церебральної ішемії важливим фактором ушкодження клітин пенумбри є апоптотична загибель нейроцитів та активація мікроглії. За даними літератури (Владимирская Е.Б., 2002; Broughton B.R. et al., 2009), більшість апоптотичних клітин локалізуються вздовж внутрішньої межі ішемічного ядра, що віддзеркалює участь апоптозу в розширенні зони інфаркту.

Cучасна патогенетична терапія інсультів передбачає застосування нейропротекторних засобів для переривання механізмів апоптозу в зоні пенумбри (Беленичев И.Ф. и др., 2009). До основних напрямків нейропротекції відносять застосування антиоксидантів, метаботропних препаратів, ноотропів, антагоністів кальцію та засобів, що впливають на ГАМК-ергічну систему, а також засобів, що покращують мозковий кровообіг (Суслина З.А., 2000; Cottrell J.E., 2005; Зозуля І. С., 2006).

Проте можливості ефективної терапії інсультів все ще обмежені. Як зазначають сучасні вчені, існує необхідність пошуку нових ефективних засобів вторинної нейропротекції (Sincich L.C. et al., 2003; Черній В. І. та ін., 2007; Бєленічев І. Ф. та ін., 2009; Sanchez J.C. et al., 2010).

Перспективним є пошук засобів з церебропротекторною активністю серед похідних глюкозаміну. Глюкозамін є одним з найважливіших структурних компонентів організму людини, при багатьох захворюваннях змінюється його вміст у тканинах та метаболізм (Зупанець І. А та ін., 2005; Vitterlinden E.J., 2008; Зупанець К.О., 2010). Похідні глюкозаміну мають різнопланові фармакологічні властивості, серед яких окремо виділяють мембраностабілізувальні, протизапальні та антиоксидантні (Туляков В.О. та ін., 2009). Похідні глюкозаміну швидко метаболізуються в організмі (Setnikar I., 1993), мають високу біодоступність, а безпечність глюкозаміну підтверджується даними численних клінічних досліджень (Hughes R., 2000; McAlingdon T. et al., 2003; Towheed T.E. et al., 2005).

У зв'язку з вищезазначеним, актуальним вважається дослідження церебропротекторних властивостей глюкозаміну та його похідних, а також можливостей застосування цих засобів у терапії цереброваскулярної патології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету «Фармакологічні дослідження біологічно-активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування в медичній практиці» (№ державної реєстрації 0103U000478).

Мета та завдання дослідження. Експериментальнє обгрунтування доцільності застосування похідних глюкозаміну як церебропротекторних засобів для підвищення ефективності терапії хворих із цереброваскулярною патологією.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1. Провести фармакологічне вивчення похідних глюкозаміну на наявність антигіпоксичної активності на моделях гіпобаричної та гемічної гіпоксії, гіперволемічного набряку мозку.

2. Визначити умовно ефективну дозу похідних глюкозаміну за антиамнестичною активністю.

3. Визначити вплив похідних глюкозаміну на виживаність, ступінь розвитку неврологічного дефіциту та рухливість на моделі гострого порушення мозкового кровообігу.

4. Дослідити вплив похідних глюкозаміну на стан вуглеводно-енергетичного обміну, процеси вільно-радикального окиснення та стан антиоксидантної системи у гострому та відновлювальному періодах гострого порушення мозкового кровообігу.

5. Визначити вплив похідних глюкозаміну на морфологічну картину та функціональні показники головного мозку тварин у гострому та відновлювальному періодах гострого порушення мозкового кровообігу.

6. Визначити вплив похідних глюкозаміну на апоптоз нейронів головного мозку щурів in vivo та in vitro.

Об'єкт дослідження. Ішемічні порушення при цереброваскулярной патології.

Предмет дослідження. Церебропротекторні властивості похідних глюкозаміну.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, морфологічні та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше експериментально вивчено та визначено церебропротекторну дію похідних глюкозаміну (патент України №56015 від 27.12.2010 р. «Застосування похідних глюкозаміну як церебропротекторного засобу»). Встановлено антигіпоксичну активність похідних глюкозаміну - глюкозаміну гідрохлориду та глюкозаміну сульфату на експериментальних моделях гіпобаричної, гемічної гіпоксії та гіперволемічного набряку мозку в тварин, визначена роль ендогенного N-ацетилглюкозаміну у розвитку гіпоксичного ураження головного мозку.

Вперше встановлено наявність антиамнестичної активності глюкозаміну гідрохлориду та визначено умовно ефективну дозу - 50 мг/кг.

Вперше експериментально досліджено вплив глюкозаміну гідрохлориду на перебіг гострого порушення мозкового кровообігу в гострому та відновлювальному періодах. Визначено позитивний вплив глюкозаміну гідрохлориду на виживаність та ступінь розвитку неврологічного дефіциту при гострому порушенні мозкового кровообігу. Вперше доведено властивості глюкозаміну гідрохлориду гальмувати розвиток реакцій ВРО, а також стимулювати ферменти власної антиоксидантної системи організму за умов церебральної ішемії. Вперше встановлено захисну дію глюкозаміну гідрохлориду на морфологічну структуру головного мозку при гострому порушенні мозкового кровообігу та властивість попереджати явища апоптозу in vitro та in vivo.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи є фрагментом доклінічного вивчення церебропротекторних властивостей глюкозаміну гідрохлориду та можуть бути використані для подальшого створення засобів з церебропротекторною активністю та розробки схем комбінованої метаболічної терапії на основі глюкозаміну гідрохлориду.

Основні результати досліджень впроваджено у практичну діяльність фахівців з експериментальної та клінічної фармакології у вигляді інформаційного листа «Церебропротекторна активність глюкозаміну гідрохлориду (доклінічні дослідження)» (2010 р.).

Результати роботи впроваджені в навчальний процес у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків), ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія (м. Полтава), Дніпропетровській медичній академії, Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького, Івано-Франківському державному медичному університеті.

Особистий внесок дисертанта. Роботу виконано на базі кафедри клінічної фармакології з фармацевтичною опікою НФаУ. Разом з науковим керівником визначено мету та завдання дослідження, розроблено методичні підходи, згідно яким відібрано моделі та методи для виконання експериментальної частини дисертації. Особисто проведено: патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки дисертації. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведено результати власних експериментальних досліджень, прийнято участь в аналізі та узагальненні отриманих даних, у написанні статей. Морфологічні дослідження зразків тканини мозку експериментальних тварин проведено на базі ЦНДЛ Запорізького державного медичного університету.

Апробація матеріалів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені та обговорені на VЙ Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клінічна фармація в Україні» (м. Харків, 2007); науково-практичній конференції «Актуальні питання фармакології» (м. Вінниця, 2007); Всеукраїнській науково-практичної конференції студентів та молодих вчених «Клінічна фармація в Україні» (м. Харків, 2007); VII Всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (м. Харків, 2008); VЙЙЙ Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клінічна фармація в Україні» (м. Харків, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (м. Харків, 2009); XXVII Науково-практичної конференції «Ліки - людині» (м. Харків, 2010), Міжнародній науковій конференції студентів «Перший крок у науку - 2010» (м. Вінниця, 2010); XIV Міжнародному науковому конгресі студентів та молодих вчених (м. Тернопіль, 2010); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (м. Харків, 2010), VI Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клінічна та експериментальна фармакологія метаболічних коректорів, органопротекція, доказова медицина» (м. Вінниця, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт,

5 статей (з них 4 - у спеціалізованих наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, в тому числі 1 ? моноосібна) та 9 тез у матеріалах з'їздів, конгресів, науково-практичних конференцій та симпозіумів, патент України, інформаційний лист.

Обсяг та структура дисертації.

Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 4-х розділів власних експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 190 сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 25 таблицями та 24 рисунками. Перелік використаних джерел містить 249 найменувань, з яких 114 - кириличною, а 135 - латинською графікою.

Основний зміст роботи

глюкозамін неврологічний мозковий кровообіг

Матеріали та методи досліджень. В експерименті всього використано 296 щурів та 50 мишів, отриманих із розплідників ЦНДЛ НФаУ та ІФТ АМН України. Усі експериментальні процедури та оперативні втручання проводили відповідно до «Положення про використання тварин у біомедичних дослідженнях». Усі тварини утримувались на стандартному раціоні харчування віварію, у відповідності до санітарно-гігієнічних норм (Кожем'якін Ю. М та ін., 2002). Об'єктами дослідження були обрані похідні глюкозаміну: глюкозаміну гідрохлорид (ГА г/х), глюкозаміну сульфат (ГА сульфат).

На першому етапі проведено фармакологічний скринінг антигіпоксичної активності похідних глюкозаміну на декількох моделях. Гіпобаричну гіпоксію в мишей моделювали вакум-аспірацією повітря до рівня, який відповідає підйому на висоту 11 000 м зі швидкістю 30 м/с (Метод. рекоменд., 1990). Дослідження проводили у порівнянні з пірацетамом (200 мг/кг).

Гемічну гіпоксію відтворювали шляхом внутрішньоочеревинним введенням 1,5% водного розчину натрію нітриту в летальній дозі (LD100) 300 мг/кг (Стефанов А.В. и др., 2002). Дослідження проводили у порівнянні з пірацетамом (200 мг/кг).

Гіперволемічний набряк головного мозку моделювали шляхом введення тваринам дистильованої води внутрішньочеревинно в об'ємі, рівному 20% від маси тіла (Квитницкий-Рыжов Ю.Н., 1988). Препаратом порівняння був обраний диклофенак натрію (у дозі 8 мг/кг).

На етапі II оцінювали антиамнестичну активність ГА г/х та проводили пошук умовно ефективних доз. Для цього виробляли у тварин умовний рефлекс пасивного уникнення (УРПУ) (Буреш Я. и др., 1991), вводили ГА г/х (у дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг). Антероградну амнезію моделювали шляхом введення атропіну в дозі 40 мг/кг внутрішньочеревинно та через 24 години відтворювали УРПУ.

На етапі III у двох серіях щурів моделювали гостре порушення мозкового кровообігу шляхом білатеральної оклюзії загальних сонних артерій під тіопентал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) (Гацура В.В., 1974). Тварин 1-ї серії виводили з експерименту на 4 добу після ГПМК, а тварин 2-ї серії ? на 18 добу. Дослідження проводили у порівнянні з мексидолом (100 мг/кг).

Протягом експериментальних досліджень використовували наступні методи визначення біохімічних та морфологічних показників тканини головного мозку щурів.

Вміст N-ацетилглюкозаміну (N-ацГА) у печінці та головному мозку визначали за модифікованим методом Ельсона-Моргана (Зупанець І. А. та ін., 2005).

Вираженість неврологічного дефіциту оцінювали за шкалою stroke-index McGrow (McGrow C.P., 1977). Рухову активність визначали за тестом «відкрите поле» (Стефанов А.В. и др., 2002).

Для біохімічних досліджень використовували лобні долі кори головного мозку експериментальних тварин. Екстракцію ліпідів проводили за методом Кейтса (1974).

Стан вуглеводно-енергетичного обміну та окиснення у циклі Кребса у головному мозку оцінювали за рівнем аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ), які визначали методом тонкошарової хроматографії (Захарова Н.Б., 1980). Додатково розраховували показники стану енергетичного обміну у клітинах головного мозку (Лук'янчук В.Д. та ін., 2000). Концентрацію пірувату та лактату визначали за методом Цока-Лампрехта, малату - за методикою Хохорста (Коган В.С. и др., 1988). Концентрацію церебрального ізоензиму ВВ-КФК (мМ/л/год) у сироватці крові визначали за оптичним тестом Варбурга (Allan S.M., 2000).

Для оцінки інтенсивності ВРО у тканинах головного мозку визначали ступінь окисної модифікації білків (ОМБ) - альдегідфенілгідразони та кетонфенілгідразони (АФГ, КФГ) за методом Halliwell B (Камышников В.С., 2003). Пероксидне окиснення ліпідів оцінювали за рівнем початкових та кінцевих продуктів цього процесу ? ТБК-реактантів, диєнові кон`югати (ДК) та трієнові кон`югати (ТК), вміст яких визначали спектрофотометрично (Коган В.С. и др., 1988). Стан циклу оксиду азоту в головному мозку оцінювали за концентрацією його стабільних метаболітів NO2-, які визначали за якісною реакцію з реактивом Гріса. Активність NO-синтази визначали флюориметрично, а L-аргініну за загальноприйнятою методикою (Горбунов Н.В., 1995). Стан антиоксидантної системи тканини головного мозку оцінювали за активністю супероксиддисмутази (СОД) (Чеварі С. та ін. 1988) та каталази, яку визначали спектрофотометрично після реакції з молібдатом амонію (Королюк М.А., 1989).

Для морфологічних досліджень мозок тварин фіксували 24 години у фіксаторі Карнуа та за стандартною схемою заливали у парафінові блоки, з яких готували серійні фронтальні 5-мікронні гістологічні зрізи в області постцентральної звивини (сомато-сенсорної кори).

Для вивчення морфо-функціонального стану нейронів IV-V шарів кори зрізи депарафінували за стандартною методикою, фарбували галоціан-хромовими галунами за Ейнарсоном для специфічного виявлення РНК (Прохорова М.И., 1982). Зображення кори отримували на мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина) та з допомогою 8-бітної CCD-камери COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили у комп'ютерну систему аналізу зображень VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Морфометричний аналіз клітин мозку проводили автоматично (Kolesnik Y.M. et al., 2002). Визначали наступні показники: щільність, площа тіл нейронів та гліальних клітин (кількість клітин на 1мм2) та вміст в них РНК (одиниці оптичної щільності, ЕОП), щільність апоптотичних та деструктивно змінених нейронів (кількість клітин на 1мм2), та їх доля (у%). Для дослідження антиапоптичної активності ГА г/х in vitro використовували збагачені фракції нейронів, та агенти, що ініціюють апоптоз (TNF 0,001 мкг/3 мл суспензії). Суспензію нейронів фарбували флуоресцентним барвником Hoechst 33342 (1% на фосфатному буфері рН 7,4+ акрихін оранжевий 0,5%) (Чекман И.С. и др., 2010) та з допомогою флюоресцентоного мікроскопу Axioskop (Zeiss, Німеччина) підраховували кількість апоптотичних клітин.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою комп'ютерних програм з використанням критеріїв Фішера-Ст'юденту та непараметричних методів аналізу (Лапач С.Н. и др., 2001; Герасимов А.Н., 2007).

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження антигіпоксичної активності похідних глюкозаміну на моделі гіпобаричної гіпоксії показало, що їх застосування достовірно збільшувало тривалість життя тварин порівняно до контролю - у групі ГА г/х більше, ніж у 2 рази. Разом з цим, похідні глюкозаміну ГА г/х та ГА сульфат запобігали набряку-набуханню головного мозку, про що свідчив МКМ, який у цих групах був на 13% та 25% відповідно менше, ніж у групі контролю (рис. 1).

Рис. 1. Масовий коефіцієнт мозку щурів за умов гіпобаричної гіпоксії

Примітки: 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології.

Вміст ендогенного N-ацетилГА у групах, що отримували ГА г/х та ГА сульфат, був вище за такий у контролі (у групі ГА сульфату - достовірно).

Дослідження антигіпоксичної активності похідних глюкозаміну на моделі гемічної гіпоксії у щурів, викликаної введенням натрію нітриту. Результати досліджень показали збільшення тривалості життя тварин, що отримували похідні глюкозаміну. Так, у групі ГА сульфату тривалість життя була на 20%, а у групі ГА х/л - на 25% більше (табл. 1).

Таблиця 1. Вплив похідних глюкозаміну на тривалість життя щурів за умов гемічної гіпоксії

Умови досліду

Тривалість життя (хв)

Інтактний контроль

-

Патологія

21,57 0,16

Пірацетам

30,37 0,09 **

ГА сульфат

25,73 0,14 **/?

ГА г/х

26,25 0,07 **/?

Примітки:

1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи пірацетаму

Рис. 2. Вміст ендогенного N-ацетилГА у головному мозку щурів за умов гемічної гіпоксії

Примітки: 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи пірацетаму

Введення похідних глюкозаміну достовірно збільшувало вміст ендогенного N-ацетилГА у головному мозку щурів, майже у 2 рази за умов введення ГА сульфату, та майже у 4 рази - у групі ГА г/х, порівняно з групою контрольної патології, де цей показник знижувався. Таким чином, на моделі гемічної гіпоксії встановлено захисну, антигіпоксичну дію похідних глюкозаміну, що виявляється у подовженні тривалості життя експериментальних тварин та запобіганні набряку головного мозку. Дещо більш вираженою антигіпоксичною активністю серед похідних глюкозаміну володіє ГА г/х.

Дослідження антигіпоксичної, антиоксидантної активності похідних глюкозаміну на моделі гіперволемічного набряку головного мозку в щурів. Результати дослідження свідчать, що введення дослідним тваринам похідних глюкозаміну збільшувало виживаність (табл. 2). Тривалість життя тварин, що загинули, на тлі введення ГА г/х подовжувалась майже вдвічі, а МКМ був достовірно нижчим за такий у групі контрольної патології та в групі диклофенаку натрію.

Таблиця 2. Вплив похідних глюкозаміну на перебіг гіперволемічного набряку у щурів

Умови досліду

Час життя, хв

МКМ

Ендоген.

N-ацГА,

мг/г тканини

ТБК-реакт., нМ/мг тканини

Інтактний контроль

-

0,580,05

0,130,01

13,05 0,31

Патологія

80,700,69

1,030,03 *

0,0750,05 *

41,5 1,04 *

Диклофенак натрію

113,019,8

0,950,09 *

0,120,02 **

23,55 1,7 *

ГА сульфат

91,005,40

0,920,08 *

0,140,02 **

25,18 2,01 **

ГА г/х

159,0+3,87**/?

0,740,01**/?

0,20,05 **/?

16,12 0,6 **/?

Примітки: 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи диклофенаку натрію.

На тлі введення похідних глюкозаміну вміст ендогенного N-ацетилГА збільшувався, майже у 3 рази в групі ГА г/х та майже вдвічі в групі ГА сульфату, достовірно перебільшуючи аналогічний показник у групі контрольної патології. Концентрація ТБК-реактантів у групах ГА сульфату та ГА г/х була на 40% та майже 60% відповідно менше за таку в групі контрольної патології. Вплив ГА сульфату на перебіг гіперволемічного набряку мозку мав характер тенденції, а ГА г/х забезпечував порівняну з диклофенаком натрію виживаність тварин, та достовірно ефективніше збільшував тривалість життя щурів, знижував МКМ та вміст ТБК-реактантів.

Дослідження на трьох моделях виявило, що разом зі збільшенням тривалості життя похідні глюкозаміну збільшували вміст ендогенного N-ацетилГА у головному мозку тварин, що дозволяє припустити його роль у забезпеченні антигіпоксичних властивостей ГА сульфату та ГА г/х. Комплексний аналіз результатів досліджень антигіпоксичних властивостей похідних глюкозаміну дозволив зробити висновок про раціональність подальших досліджень саме ГА г/х.

Дослідження антиамнестичної активності глюкозаміну гідрохлориду та пошук умовно ефективних доз із використанням методу УРПУ. Результати дослідження антиамнестичної активності ГА г/х у різних дозах (50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг) свідчать про те, що він обумовив збереження пам'ятного сліду: латентний період (ЛП) входу до темної камери майже в 3 рази перевищував такий у групі контрольної патології (рис. 3). Дещо більшу антиамнестичну активність чинив ГА г/х у дозі 50 мг/кг, у цій групі ЛП відтворення УРПУ був найдовшим. Отримані дані обумовили раціональність подальших досліджень церебропротекторних властивостей ГА г/х у дозі 50 мг/кг.

Рис. 3. Латентний період при відтворенні УРПУ після амнезії

Примітки: 1.* - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2.** - p?0,05 відносно групи контрольної патології

Дослідження церебропротекторних властивостей глюкозаміну гідрохлориду в гострому та відновлювальному періодах церебральної ішемії, викликаної білатеральною перев'язкою загальних сонних артерій.

Результати дослідження свідчать, що розвиток ГПМК супроводжувався високим рівнем смертності та значним ступенем неврологічного дефіциту. На

4 добу ГПМК вижило 30% тварин, а стан тих, що вижили, був тяжким (табл. 3).

Застосування ГА г/х супроводжувалось двократним збільшенням виживаності щурів як у гострому (4 доба), так і у відновлювальному періодах (18 доба) церебральної ішемії. Тварини, що отримували ГА г/х, були більш рухливими ? кількість перетнутих квадратів у тесті «відкрите поле» достовірно перебільшувала цей показник у групі контрольної патології.

Таблиця 3. Вплив ГА г/х на виживаність, розвиток неврологічного дефіциту та рухову активність щурів у різні періоди гострого порушення мозкового кровообігу

Умови досліду

Доза, мг/кг

Вижив-ть, %

Неврологічний дефіцит, бали McGrow skale

Кількість

перетнутих квадратів

4 доба

18 доба

4 доба

18 доба

4 доба

18 доба

Інтактний контроль

-

100

100

-

-

24,8±2,15

28,1±1,97

Патологія

-

30

30

17,66±2,02

3,17±0,37

3,66±0,75*

6,67±2,05*

Мексидол

100

70

65

6,71±0,47**

1,69±0,75**

8,71±1,16**

18,7±4,33**

ГА г/х

50

70

60

5,62±0,59**

1,46±0,43**

9,92±1,03**

27,6±4,9**/?

Примітки: 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи мексидолу

Ефективність ГА г/х була порівняною з такою мексидолу на 4 добу, а на 18-ту добу ГА г/х достовірно перевищив референтний препарат.

Енергетичний метаболізм страждав у гострому періоді ішемії, на 4 добу після моделювання ГПМК вміст АТФ, сума аденілових нуклеотидів (САН) та індекс фосфорилування (ІФ) знижувались, розвивалась гіперферментемія ВВ-КФК (табл. 4).

Таблиця 4. Енергетичний метаболізм та концентрація ВВ-КФК у головному мозку щурів на 4 добу гострого порушення мозкового кровообігу

Умови досліду

Доза, мг/кг

АТФ, мкмоль/г

САН, мкмоль/г

ІФ

ВВ-КФК, мМ/л/год

Інтактний контроль

-

2,86±0,06

3,46±0,21

4,86±0,53

0,023±0,001

Патологія

-

0,89±0,05*

1,37±0,13*

1,87±0,26*

0,146±0,001 *

Мексидол

100

2,12±0,08*/**

2,56±0,13**

4,92±1,08**

0,1±0,002 */**

ГА г/х

50

2,59±0,06*/**/?

3,1±0,17**/?

5,2±0,67**

0,046±0,001**/?

Примітки (табл. 4, рис. 4): 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи мексидолу

Введення ГА г/х супруводжувалось достовірно більшим вмістом АТФ, САН перебільшувала таку в групі мексидолу достовірно, а ІФ не відрізнявся достовірно від такого в інтактному контролі. Вміст ВВ-КФК у групі ГА г/х був майже у 3 рази менше за такий у групі контрольної патології та достовірно менше за такий на тлі мексидолу.

При введенні щурам з ГПМК досліджуваного ГА г/х рівень лактату був достовірно нижчим, а пірувату - достовірно вищим порівняно до групи контрольної патології та референтного препарату (рис. 4).

Рис. 4. Концентрація лактату та пірувату у тканині головного мозку щурів на 4 добу гострого порушення мозкового кровообігу

Введення ГА г/х щурам з ГПМК протягом відновлювального періоду (2-га серія) супроводжувалось гальмуванням процесів ВРО у головному мозку та активізацією власної АОС, про що свідчили показники, наведені у таблиці (табл. 5).

Таблиця 5. Показники інтенсивності реакцій ВРО та активності АОС у головному мозку щурів на 18 добу гострого порушення мозкового кровообігу

Досліджуваний показник

Умови досліду

Інтактний контроль

Патологія

Мексидол

ГА г/х

ТБК-реакт., мкмоль/г

0,53±0,02

1,15±0,02*

0,75±0,06**

0,56±0,03**/?

АФГ, у.о./г білка

0,86±0,11

2,18±0,2*

1,21±0,13**

0,65±0,1**/?

NO2-, мкмоль/г білка

3,77±0,11

9,93±0,89*

7,08±0,26**

5,92±0,42**/?

NOS, нмоль/г тк/хв

2,26±0,23

4,13±0,27*

3,08±0,33**

2,56±0,39**

Каталаза, нмоль/л

7,7±0,23

2,87±0,29*

4,73±0,42**

5,02±0,18**

СОД, у.о./мг білку/хв

208,44±9,9

79,73±8,74*

127,94±4,26**

172,72±13,23**/?

Примітки (табл. 5, рис. 5): 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи мексидолу

Згідно результатів дослідження біохімічних показників тканини головного мозку у відновлювальному періоді ГПМК, застосування ГА г/х забезпечувало достовірне гальмування процесів ВРО, рівень ТБК-реактантів був майже вдвічі нижчий за такий у групах контрольної патології та мексидолу та не перевищував достовірно показник групи інтактних тварин. При застосуванні ГА г/х майже втричі знижувався показник ОМБ - АФГ, який був достовірно нижче за такий у групі контрольної патології та мексидолу. Відбувалась також стабілізація інтермедіатів циклу окису азоту - зниження активності NOS та концентрації NO2- Активність ферментів АОС натомість зростали у групі ГА г/х, за впливом на каталазу ГА г/х виявив порівняну до мексидолу ефективність, а за впливом на СОД перевершив препарат порівняння. Результати морфологічного дослідження наведені на рис. 5.

Рис. 5. Щільність нейронів, гліальних клітин, апоптотичних та деструктивно-змінених клітин на 18 добу гострого порушення мозкового кровообігу

Результати морфологічного дослідження тканини мозку щурів на 18 добу ГПМК свідчили, що наприкінці відновлювального періоду кількість нейронів майже на 40%, а гліальних клітин майже на 30% були нижче за такі у інтакті. Разом з явищами некрозу та деструкції клітин нервової тканини головного мозку відбувалась активація апоптозу нейроцитів, щільність апоптотичних та деструктивно змінених клітин в умовах ГПМК зростала, залишаючись досить високою навіть на 18 добу, більше ніж вдвічі перебільшуючи аналогічний показник тварин без ГПМК. Застосування ГА х/л у лікувальному режимі забезпечувало відновлення кількісного складу нервової тканини головного мозку щурів із ГПМК, а також зниження щільності апоптотичних та деструктивно змінених клітин до рівня інтактних тварин, достовірно порівняно до контрольної патології та достовірно ефективніше за препарат порівняння.

Функціональні показники клітин тканини головного мозку в умовах церебральної ішемії знижувались. На 18 добу площа тіл нейронів була на 20%, а вміст РНК у нейронах ? на 40% нижче за такі в інтактних тварин (табл. 6).

Таблиця 6. Функціональні показники та доля апоптотичних клітин у тканині головного мозку щурів на 18 добу гострого порушення мозкового кровообігу

Умови досліду

Площа тіл нейронів,

мкм2

Вміст РНК у нейронах, ЕОП

Вміст РНК у гліальних клітинах, ЕОП

Доля апоптотичних клітин, %

Інтактний контроль

103,76±3,14

13,00±0,36

3,89±0,17

2,11 ±0,47

Патологія

83,7±0,52*

7,72±0,2*

4,5±0,01*

20,6±3,1*

Мексидол

87,1±0,23*/**

8,32±0,11*/**

4,6±0,02**

9,6±1,4**

ГА г/х

105,4±0,51**/?

9,65±0,07**/?

5,6±0,01**/?

5,3±0,74**/?

Примітки: 1. * - p?0,05 відносно групи інтактного контролю;

2. ** - p?0,05 відносно групи контрольної патології;

3. ? - p?0,05 відносно групи мексидолу.

Внаслідок активації процесів відновлення вміст РНК у гліальних клітинах зростав, проте доля апоптотичних клітин залишалась досить високою. Застосування ГА г/х на протязі відновлювального періоду ГПМК забезпечувало нормалізацію площі тіл нейронів та процесів білкового синтезу в головному мозку щурів. Разом з цим знижувалась доля апоптотичних клітин. За впливом на морфологічні та функціональні показники тканини головного мозку ГА г/х достовірно перевершив препарат порівняння мексидол.

Для уточнення механізму церебропротекторної дії ГА г/х були проведені дослідження in vitro з використанням фактору, що ініціює апоптоз - TNF-б на виділеній фракції нейронів (табл. 7).

Таблиця 7. Дослідження антиапоптичної активності ГА г/х in vitro

Умови досліду

Інтактний контроль

Патологія

Мексидол

ГА г/х

Кількість Hoechst 33342-позитивних клітин

3,1 ±1,19

20,7±4,6*

14,8±3,7**

9,2 ±3,1**/?

Примітки: 1. * - p?0,05 відносно інтактної серії;

2. ** - p?0,05 відносно контрольної серії;

3. ? - p?0,05 відносно серії з мексидолом.

Результати дослідження дозволяють зробити висновок, що одним з важливих механізмів церебропротекторної дії ГА г/х реалізується через запобігання утворення АФК шляхом гальмування TNF-б.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у експериментальному обгрунтуванні застосування похідних глюкозаміну, а саме глюкозаміну гідрохлориду, в якості церебропротекторного засобу.

1. Похідні глюкозаміну (гідрохлорид та сульфат) на моделях гіпобаричної гіпоксії у мишей, гемічної гіпоксії та гіперволемічного набряку в щурів виявляють антигіпоксичний ефект та нормалізують обмін ендогенного N-ацетилглюкозаміну ефективніше за референтні препарати пірацетам та диклофенак натрію.

2. Умовна ефективна доза глюкозаміну гідрохлорид за антиамнестичною активністю ? 50 мг/кг.

3. При гострому порушенні мозкового кровообігу в щурів глюкозаміну гідрохлорид забезпечує збільшення виживаності дослідних тварин та регрес проявів неврологічного дефіциту в гострому та відновлювальному періодах, не поступаючись препарату порівняння мексидолу.

4. У гострому та відновлювальному періодах гострого порушення мозкового кровообігу глюкозаміну гідрохлорид нормалізує вуглеводно-енергетичний обмін, гальмує розвиток вільно-радикального окиснення, нормалізує цикл оксиду азоту та збільшує активність власних антиоксидантних ферментів - каталази та супероксиддисмутази, за деякими показниками перевершуючи препарат порівняння мексидол.

5. У гострому та відновлювальному періодах гострого порушення мозкового кровообігу глюкозаміну гідрохлорид виявляє нейро - та гліопротекторні властивості, забезпечує збереження якісної та кількісної структури тканини головного мозку, запобігає некрозу, гальмує апоптоз, забезпечує збереження функціональних можливостей нейронів у зоні ішемії та клітин пенумбри.

6. Імовірний механізм церебропротекторної дії глюкозаміну гідрохлориду полягає в гальмуванні процесів утворення АФК, активації власної антиоксидантної системи головного мозку та захисті енергетичного метаболізму клітини внаслідок стабілізації біологічних мембран.

Перелік опублікованих праць за темою дисертації

1. Зупанець І. А. Вплив глюкозаміну гідрохлориду на вуглеводно-енергетичний обмін у тканинах головного мозку при експериментальній гострій церебральній ішемії / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Запорізький медичний журнал. - 2010. - Т. 12, №2. - С. 19-22. собистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка статті).

2. Зупанець І. А. Перекисне окиснення ліпідів в умовах експериментальної гострої церебральної ішемії на тлі застосування глюкозаміну гідрохлориду / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Вісник фармації. - 2010. - №2 (62). - С. 64-67. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка статті).

3. Зупанець І. А. Церебропротекрорна дія похідних глюкозаміну в умовах експериментальної гіпоксії у щурів / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Український біофармацевтичний журнал. - 2010. - №1 (6). - С. 26-29. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка статті).

4. Грінцова О. Є. Вплив глюкозаміну гідрохлориду на активність окислювальної модифікації білків та стан антиоксидантної системи за умов експериментальної гострої церебральної ішемії / О. Є. Грінцова // Медична хімія. - 2010. - №3. - С. 71-75.

5. Патент України на корисну модель №56015, МПК А 61К 31/7008, А61Р 9/10. Застосування похідних глюкозаміну як церебропротекторного засобу / Зупанець І. А., Попов С.Б., Грінцова О. Є., Грінцов Є. Ф.; заявник та власник патенту Національний фармацевтичний університет (Україна). - заявл. 23.03.2010; опубл. 27.12.2010 р.; бюл. №24. - 14 с. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, участь в аналізі даних, підготовка патенту).

6. Зупанець І. А. Церебропротекторні властивості глюкозаміну гідрохлориду (доклінічні дослідження): інформ. лист / І. А. Зупанець,

7. О. Є. Грінцова. - К., 2010. - №213-2010. - З пробл. «Клінічна фармакологія і клінічна фармація» ? 7 с. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка інформаційного листа).

8. Грінцова О. Є. До питання про механізми церебропротекторної дії глюкозаміну гідрохлориду / О. Є. Грінцова / Клінічна експериментальна фармакологія метаболічних коректорів, органопротекція та доказова медицина: матеріали VI Всеукр. наук.-практ. конф. з міжнар. участю з клінічної фармакології, присвяч. 90-річчю проф. О.О. Столярчука: стаття. - Вінниця, 2010. ? С. 67-76.

9. Грінцова О. Є. Вплив глюкозаміну на перебіг експериментальної гіпобаричної гіпоксії / О. Є. Грінцова, І. А. Зупанець // Клінічна фармація в Україні: матеріали VЙ Всеукр. наук.-практ. конф. - Х., 2007. - С. 146-147. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка тез).

10. Зупанець І. А. Вплив глюкозаміну на перебіг експериментального набряку мозку у щурів / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Актуальні питання фармакології: матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю. - Вінниця, 2007. - С. 768 - 769. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка тез).

11. Зупанець І. А. Вплив похідних глюкозаміну на перебіг експериментальної гемічної гіпоксії / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Сьогодення та майбутнє фармації: матеріали VII Всеукр. конгресу. - Х., 2008. - С. 379. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка тез).

12. Зупанець І. А. Динаміка вмісту ендогенного N? ацетилглюкозаміну в умовах експериментальної гіпоксії / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Клінічна фармація в Україні: матеріали VЙЙЙ Всеукр. наук.-практ. конф. за участю міжнар. спеціалістів. - Х., 2008. - С. 95-96. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка тез).

13. Зупанець І. А. Деякі аспекти морфологічної картини на тлі застосування глюкозаміну за умов експериментальної церебральної ішемії / І. А. Зупанець, О. Є. Грінцова // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. студентів та молодих вчених. - Х., 2009. - С. 216. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка тез).

14. Грінцова О. Є. Вміст аденілових нуклеотидів у тканинах головного мозку щурів на тлі застосування глюкозаміну за умов експериментальної церебральної ішемії / О. Є. Грінцова // Ліки ? людині. Сучасні проблеми створення та апробації лікарських засобів: матеріали XXVII наук.-практ. конф. з міжнар. участю. - Х., 2010. - С. 35-36.

15. Грінцова О. Є. Стан антиоксидантої системи мозку за умов експериментальної гострої церебральної ішемії та її зміни під впливом глюкозаміну гідро хлориду / О. Є. Грінцова // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: матеріали Всеукр. наук.-практ. конфер. студентів та молодих вчених. - Х., 2010. - С. 309.

16. Грінцова О. Є. Вплив глюкозаміну гідрохлориду на виживаність та розвиток неврологічного дефіциту у щурів за умов експериментальної гострої церебральної ішемії / О. Є. Грінцова // Матеріали III Міжнар. наук. конгресу молодих вчених та студентів-медиків. - Тернопіль, 2010. - С. 283.

17. Грінцова О. Є. Вплив глюкозаміну гідрохлориду на перекисне окиснення ліпідів в умовах експериментальної гострої церебральної ішемії / О. Є. Грінцова // Перший крок у науку - 2010: матеріали VII Міжнар. наук. конф. - Вінниця, 2010. - С. 127.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.