Структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран при дислипопротеинемиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Бутусова Валерия Николаевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН ПРИ ДИСЛИПОПРОТЕИНЕМИЯХ

03.00.04 - биохимия

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

Новосибирск-2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Панин Лев Евгеньевич,

доктор медицинских наук, профессор Рязанцева Наталья Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович,

доктор медицинских наук, профессор Трунов Александр Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Росздрава

Защита состоится «__» _________ 2007 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «___» ___________ 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

диабет мембрана эритроцит липидный

Актуальность исследования. Многочисленные экспериментальные, клинические и эпидемиологические исследования убедительно свидетельствуют о ключевой роли дислипопротеинемий в патогенезе большого числа социально-значимых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, ожирение, гипотериоз и др.). При сахарном диабете типа 1 и 2 дислипопротеинемии связаны прежде всего с нарушением гормональной регуляции метаболических процессов и являются одним из факторов развития сосудистых осложнений, определяя тяжесть течения заболевания [Manzato E. et al., 1989; Hanefeld M., 1994; Панин Л.Е., 2000; Деменкова А.П., 2001; Яфасов К.М., Дубянская Н.В., 2001; Потеряева О.Н. и соавт., 2003; Vergиs B., 2005; Lapolla A. et al., 2006]. Важнейшим из системных изменений при патологии липидного обмена является нарушение метаболизма липидов мембранных структур [Bryszewska M. et al., 1979; Godin D.V., Herring F.G., 1981; Otsuji S. et al., 1981; Kamada T., Otsuji S., 1983; Watala C., Winocour P.D., 1992; Faloia E., 1999].

Клеточные мембраны являются одним из ключевых звеньев сложной системы обмена липидов в организме. Они не только сами содержат липиды как структурный элемент, но и участвуют в переносе последних путем пассивного транспорта и активного рецепторопосредованного эндоцитоза [Титов В.Н.,2000; Rigotti A. et al., 2003]. В самой мембране выделяют липидную фазу, состоящую главным образом из фосфолипидов и холестерина. Липидные молекулы, являясь важными структурными и функциональными компонентами клеточной мембраны, регулируют подвижность и активность мембраносвязанных белков, определяя адаптационный потенциал клетки [Крепс Е.М., 1982; Геннис Р., 1997; Титов В.Н., 2002; Болдырев А.А., 2006]. Соотношение основных липидных фракций, степень насыщенности жирных кислот, входящих в их состав, определяют такое понятие как «текучесть» липидного бислоя мембраны, влияют на упорядоченность липидных молекул, а также характер липид-липидных и белок-липидных взаимодействий [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980; Новиков К.Н., 2004; Allen H.G., 2006]. Возрастание микровязкости липидной фазы плазматических мембран закономерно приводит к снижению активности мембраносвязанных ферментов, торможению связывания рецепторов с лигандами и нарушению других важнейших для клетки процессов [Shinitzky M.,1984; Сомова О.Г. и соавт., 1997; Горошинская И.А. и соавт., 1999; Corver J. et al., 2000; Decsi T. et al., 2002].

Несмотря на очевидную роль обмена мембранных липидов в реализации многочисленных функциональных свойств клеток, в настоящее время нет четких представлений о регуляции этого процесса. Выделяют внутриклеточные механизмы регуляции метаболизма липидов плазматической мембраны, которые осуществляются через биосинтетические процессы самой клетки с участием ядра и других органелл [Геннис Р.,1997]. Однако важный вклад вносят и другие механизмы регуляции, к которым относятся действие фосфолипаз, вторичных посредников (фосфатидилинозитолтрифосфат, Са²⁺), система свободно-радикального окисления и т.д. [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999; Daleke D.L., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2004].

В мембранах наряду с липидами, прочно связанными с белками цитоскелета, существуют формы липидов, которые свободно обмениваются с плазменными липопротеинами. В связи с этим изменения состава липидов мембран, в частности клеток крови, могут быть результатом взаимодействия с липопротеинами [Quarford S.H., 1970; Faergeman O., Havel R.J., 1975; Poon R., 1981; Hollan S. et al., 1995, 1996; Broncel M. et al., 2005].

Универсальной моделью плазматических мембран, вполне подходящей для изучения влияния на них внеклеточных воздействий, в том числе и воздействия липопротеинового состава крови, является мембрана эритроцитов. Поскольку мембране эритроцитов присущи общие принципы молекулярной организации, выявленные закономерности их функционирования вполне допустимо экстраполировать на плазматические мембраны иных клеток. Кроме того, видимая простота организации эритроцита позволяет изучать метаболизм, структуру и функциональные свойства плазматической мембраны без тех помех, которые существуют в клетках с развитыми внутриклеточными мембранными образованиями и органеллами [Постнов Ю.В., Орлов С.Н.,1987].

Поскольку эритроцитарные мембраны свободно обмениваются с липидным компонентом плазменных липопротеинов, использование в качестве модели дислипопротеинемии патологических состояний, в частности сахарного диабета типа 1 и 2 с выраженными нарушениями липопротеинового спектра, может помочь раскрыть механизмы регуляции липидного обмена в клеточных мембранах, а также уточнить роль дислипопротеинемий в изменении качественных и количественных характеристик мембранных липидов. Целесообразность проведения такого исследования продиктована тем фактом, что к настоящему времени остается неясной непосредственная роль липопротеинов различных классов и их белкового компонента в метаболизме липидов плазматических мембран и механизмах формирования мембранной патологии при дислипопротеинемиях.

Цель исследования: выявить особенности изменений структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях различного типа.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выявить особенности структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов у больных с дислипопротеинемиями при сахарном диабете типа 1 и 2.

2. Установить взаимосвязь между нарушениями липидного обмена и структурно-функциональными свойствами липидной фазы мембран эритроцитов у больных с сахарным диабетом типа 1 и 2.

3. Исследовать в эксперименте in vitro влияние липопротеинов различных классов и их белкового компонента (аполипопротеинов А-I, Е и С) на наноструктурные переходы, ответственные за липид-липидные и белок-липидные взаимодействия в эритроцитарных мембранах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения липопротеинового обмена более выражены у пациентов с сахарным диабетом типа 2 по сравнению с таковыми у больных сахарным диабетом типа 1 и характеризуются значительным увеличением содержания в крови липопротеинов очень низкой плотности, триглицеридов и общего холестерина.

2. Структурно-функциональные изменения эритроцитарных мембран при сахарном диабете развиваются как часть общих системных нарушений липидного обмена, одним из ключевых звеньев которых является развитие дислипопротеинемий.

3. Изменения структурных и функциональных свойств мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях, сопровождающих сахарный диабет типа 1 и 2, характеризуются структурной перестройкой мембранных липидов, нарушением их микровязкостных свойств и уменьшением активности мембраносвязанной Na⁺,K⁺-АТФазы.

4. В механизмах действия липопротеинов на клеточные мембраны важную роль играет не только липидный, но и белковый компонент: аполипопротеин A-I снижает микровязкость липидной фазы и изменяет характер белок-липидных взаимодействий; аполипопротеины С вызывают противоположное действие - повышают микровязкость липидного бислоя и нарушают белок-липидные взаимодействия; аполипопротеин Е не оказывает мембранотропного эффекта.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование изменений структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов с учетом особенностей нарушений липопротеинового спектра крови у больных сахарным диабетом типа 1 и 2. Показано, что липидный состав и микровязкостные свойства мембран эритроцитов существенно нарушаются при увеличении соотношения в сыворотке атерогенных и антиатерогенных фракций липопротеинов. Установлено, что выраженность нарушений липидного обмена у пациентов влияет на степень дезорганизации плазматических мембран. Рассмотрен вопрос о прямом воздействии как липопротеинов, так и аполипопротеинов на биофизические свойства плазматических мембран. Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о различном влиянии аполипопротеинов на эритроцитарные мембраны крыс: выраженное снижение микровязкости при действии аполипопротена А-I, увеличение ее при действии аполипопротеина С и отсутствие изменений при действии аполипопротеина Е.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера о состоянии мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях у больных сахарным диабетом типа 1 и 2. Выявленные закономерности позволяют говорить о связи структурных изменений клеточных мембран с их биофизическими характеристиками (микровязкость, липид-липидные и белок-липидные взаимодействия) и активностью мембраносвязанных ферментов (Na⁺,К⁺-АТФаза). Они также свидетельствуют о важной роли межсистемных взаимодействий: клеточные мембраны и липопротеины сыворотки крови, как функционально активная среда, в которой существуют и работают эти мембраны. Установленные нами закономерности указывают на необходимость разработки новых подходов к мембранотропной терапии для коррекции системных нарушений при дислипопротеинемиях.

Апробация и внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VI международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), на научно-практической межрегиональной конференции, посвященной 70-летию ГОУ ВПО НГМА Росздрава «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Новосибирск, 2005), XI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2006).

Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ по проблемам: «Молекулярные основы нарушений структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4), «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 - в центральных рецензируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы, включающего 258 источников, из них - 78 отечественных и 180 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 7 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного исследования структурно-функционального статуса мембран эритроцитов и особенностей нарушения липопротеинового спектра у 70 пациентов с сахарным диабетом типа 1 и 2 (табл. 1), проводившегося на базе эндокринологической клиники ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава» (главный врач - Заслуженный врач РФ, к.м.н. В.М. Шевелев), эндокринологического отделения ОГУЗ «Томская Областная клиническая больница» (главный врач - Заслуженный врач РФ Б.Т Серых) и городской больницы № 3 г. Томска (главный врач - М.А. Лукашов). В контрольную группу были включены 20 практически здоровых донора, не предъявлявших на момент обследования жалоб, мужчин и женщин, в возрасте от 25 до 55 лет.Следующим этапом работы явилось экспериментальное исследование in vitro, проведенное с использованием крови 27 крыс линии Вистар.

Было обследовано 27 пациентов, страдающих сахарным диабетом типа 1, мужского и женского пола в возрасте от 19 до 55 лет. Длительность заболевания у больных варьировала от 1 года до 30 лет (средние значения длительности диабета - 9,9±2,1 лет), при этом 19 человек страдали СД 1 более 5 лет, а 8 пациентов имели стаж диабета менее 5 лет. Степень компенсации сахарного диабета была определена с учетом содержания глюкозы в сыворотке крови утром натощак и концентрации гликированного гемоглобина (НbА_1с). Согласно “Национальным стандартам сахарного диабета” (Федеральная целевая программа “Cахарный диабет”, 2002), компенсацию углеводного обмена у пациентов с СД 1 считали при показателе НbА_1с ниже 7,0%, субкомпенсацию - от 7,0 до 7,5% включительно, декомпенсацию - выше 7,5%. В связи с этим были выделены группы пациентов с субкомпенсацией (12 человек) и декомпенсацией углеводного обмена (13 пациентов), 2 больных имели компенсированное течение СД 1. У пациентов с СД 1 верифицировали наличие диабетической ретинопатии с использованием классификации С. Mongensen et al. [1983]. Диагностику диабетической ретинопатии осуществляли с помощью критериев Е. Koner и M. Porta [1992].

Обследовано 43 больных СД 2 (10 мужчин и 33 женщины) в возрасте от 39 до 60 лет. Длительность диабета у пациентов варьировала от 1 месяца до 21 года, при этом 19 человек страдали СД 2 менее 5 лет, а 24 - более 5 лет. Показатели метаболизма глюкозы указывали на декомпенсированное течение заболевания у всех пациентов с СД 2 (декомпенсацию углеводного обмена у пациентов с СД 2 считали при показателе НbА_1с выше 7,0%). Среди пациентов с СД 2 была выделена группа больных (17 человек), у которых верифицирован диагноз ишемическая болезнь сердца (ИБС). Из них только 2 больных имели нормальный индекс массы тела, 9 человек страдали ожирением 1 степени (индекс массы тела 30,0-34,9 кг/м²), 4 пациента - ожирением 2 степени (35,0-39,9 кг/ м²), 1 человек - ожирением 3 степени. 14 пациентов с СД 2 страдали только ожирением без ИБС, причем у 4 пациентов было отмечено ожирение 1 степени, у 5 больных - 2 степени и у 5 человек - 3 степени.

Таблица 1

Распределение здоровых доноров, больных сахарным диабетом типа 1 и 2, экспериментальных животых на группы в соответствии с использованными методами исследования липидного спектра крови и структурно-функциональных особенностей мембраны эритроцитов

Все пациенты обследованы в момент диспансеризации на фоне проведения коррегирующей углеводный обмен терапии (препараты групп сульфанилмочевины и бигуанидов для больных СД 2 и инсулинотерапия для пациентов с СД 1). Материалом исследования явилась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром натощак после шестнадцатичасового воздержания от приема жирной пищи. Для получения плазмы кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).

Определение фракционного и субфракционного составов липопротеинов сыворотки крови было проведено с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния, предложенного Ф.В. Тузиковым и соавт. [1997]. Нами учитывались концентрации липопротеинов 6 основных подклассов (2 субфракции ЛПВП, 2 субфракции ЛПНП и 2 субфракции ЛПОНП) и величина таких интегральных показателей как общий холестерин и общие триацилглицериды. Также были рассчитаны отношение общих фосфолипидов к общему холестерину и индекс атерогенности. Индекс атерогенности рассчитывался как отношение (ОХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП, где ОХС - общий холестерин, а ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности. При этом больные с нарушенным липидным обменом были распределены по типу ДЛП по классификации, предложенной D. Fredricson. IIa тип ДЛП регистрировали, если в сыворотке крови значения содержания ХС ЛПНП превышали 175 мг/дл при нормальных величинах концентрации ТГ, IIб тип - если было повышено содержание ХС ЛПНП и ТГ (свыше 175 мг/дл для лиц моложе 40 лет и свыше 210 мг/дл для пациентов 40 лет и старше), IV тип - если значения ХС ЛПНП были в пределах нормы, а концентрация ТГ была повышенной.

Мембраны эритроцитов выделяли путем гипоосмотического гемолиза [Dodge J.T. et al. 1963]. В полученной взвеси мембран определяли микробиуретовым методом содержание белка.

Липиды мембран эритроцитов экстрагировали хлороформ-метаноловой смесью по методу J. Folch et al. [1957]. Общее содержание липидов в мембране эритроцитов определяли методом Н.А. Тарановой [1987]. Препаративное разделение общих липидов проводили методом тонкослойной хроматографии [Финдлей Дж.Б., Эванз У.Г., 1990] в системе растворителей гептан: диэтиловый эфир: этилацетат (в соотношении 80:20:1,5) на пластинках “Sorbfil” (Россия). Разделение фракций фосфолипидов мембран эритроцитов методом тонкослойной хроматографии [Прохорова М.И., 1982] осуществляли в системе хлороформ : метанол : вода (в соотношении 32:12,5:2) на пластинках “Sorbfil”(Россия). Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов (фирма “Sigma”, США). Количественную оценку хроматограмм проводили с помощью разработанной компьютерной программы.

Характеристика структурных свойств липидной фазы мембран эритроцитов проводилась с использованием измерения собственной флуоресценции теней эритроцитов и определения спектральных характеристик взаимодействия мембран с флуоресцентным зондом пирен на спектрофлуориметре “Hitachi-MPF-4” (Япония). Микровязкостные свойства мембраны в области анулярных и общих липидов оценивали по степени эксимеризации пирена, вычисляя отношение интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров (J₄₇₀/J₃₇₀) при длине волны возбуждающего света (в) 285 и 340 нм, соответственно. Полярность окружения молекул пирена оценивали по отношению J₃₇₀/J₃₉₀ при в=340 нм [Добрецов Г.Е., 1989]. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофановых остатков на пирен по формуле, предложенной Ю.А. Владимировым и Г.Е. Добрецовым [1980].

Определение активности Na⁺,K⁺-АТФазы в мембранах эритроцитов определяли методом, разработанным А.М. Казенновым и соавт. [1984] и основанном на накоплении неорганического фосфора (Рi) в среде, содержащей АТФ, в результате его гидролиза под действием АТФазы. Содержание Рi определяли по методу Р.S. Chen et al. [1956].

В рамках диссертационной работы был выполнен экспериментальный блок, связанный с исследованием структурной организации эритроцитарных мембран у крыс в условиях инкубации взвеси теней эритроцитов с липопротеинами основных классов (ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП), а также их апобелками (аполипопротеинами А-I, С и Е) in vitro. Липопротеины выделяли из сыворотки крови крыс с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr [Hatch F.T., Lees R.S., 1968]. Для получения аполипопротеинов проводили делипидирование липопротеинов охлажденной смесью хлороформ-метанол (2:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Фракции, содержащие аполипопротен A-I, С и Е, очищали с помощью ионообменной хроматографии с использованием ионообменника «DEAE-Toyopeare 650 М-TSK» (Япония) [Laemli U.K., 1970]. Инкубацию теней эритроцитов с липопротеинами и их апобелками проводили при 37°С в течение 20 мин с последующим однократным отмыванием и исследованием структурных свойств мембран эритроцитов с помощью флуоресцентного зонда пирен. Параллельно каждой опытной пробе ставилась контрольная проба, содержавшая тени эритроцитов того же животного с инкубационной средой (10 мМ трис-HCl буфер, рН 7.4).

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием методов статистического анализа. Проверка на нормальность распределения была осуществлена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для проверки гипотезы о значимости различий законов распределения исследуемых признаков для отдельных групп пациентов был применен критерий Манна-Уитни (U-тест) для несвязанных выборок, для обработки результатов экспериментальных данных - критерий Вилкоксона для попарносвязанных выборок. Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров использовали вычисление коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Распределение общей группы больных по категориям было осуществлено с помощью кластерного анализа методом К-средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день имеется немало данных, свидетельствующих о том, что зрелые эритроциты обновляют свой липидный состав благодаря взаимодействию с ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП [Quarford S.H., 1970; Faergeman O., Havel R.J., 1975; Poon R., 1981; Hollan S. et al., 1995, 1996; Broncel M. et al., 2005]. Подтверждением наличия обменных процессов между плазменными липопротеинами и мембраной эритроцитов является и установление факта дезорганизации липидного бислоя красных кровяных клеток у больных с дислипопротеинемиями.

Многочисленные данные литературы говорят о широкой распространенности нарушений липидного обмена у больных сахарным диабета как типа 1, так и типа 2, связанных прежде всего с нарушением гормональной регуляции метаболических процессов [Manzato E. et al., 1989; Hanefeld M., 1994; Деменкова, 2001; Яфасов К.М., Дубянская Н.В., 2001; Потеряева О.Н. и соавт., 2003; Vergиs B., 2005; Lapolla A. et al., 2006]. Согласно данным наших исследований, у больных СД 1 липопротеиновый спектр сыворотки крови характеризовался повышением концентрации общего ХС, изменением субфракционного состава ЛПВП и повышением индекса атерогенности. При этом выраженность метаболических нарушений у пациентов с СД 1 зависела от длительности диабета, стадии компенсации углеводного обмена и наличия сосудистых осложнений: было отмечено выраженное повышение содержания общего ХС у пациентов с течением заболевания более 5 лет или с сосудистыми осложнениями II и III стадии (рис. 1.). Пациенты с СД 2 характеризовались более выраженными и разнообразными отклонениями показателей липидного обмена: повышение содержания общего холестерина и триацилглицеридов в сыворотке крови наряду со снижением концентрации ХС ЛПВП (табл. 2).

Механизмы развития гиперхолестеринемии, как было указано выше, при сахарном диабете связаны с нарушением гормональной регуляции. При этом инсулярная недостаточность проявляется не только в нарушении углеводного и жирового обмена, но и активацией контринсулярных гормонов. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания ЛПОНП. У пациентов, страдающих СД типа 2, в сыворотке крови было обнаружено увеличение концентрации всех подфракций ЛПОНП (табл. 2). Так, содержание ЛПОНП₁ у больных СД 2 превышало соответствующий показатель у здоровых доноров в 1,8 раз (р<0,01), а концентрация ЛПОНП₂ был выше в 2,2 раза (р<0,001) (табл. 2).

Как полагают исследователи, повышение образования ЛПОНП в печени происходит благодаря увеличенному поступлению жирных кислот [Cummings M.H., 1995], а также отсутствию ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП [Reaven G.M., 1981; Tobey T.A., 1981; Malmstrцm R., 1997]. Кроме того, обсуждается возможность увеличения синтеза жирных кислот в печени de novo [Shimomura I., 2000; Tobe K., 2001].

Таблица 2

Результаты исследования липопротеинового спектра сыворотки крови у больных сахарным диабетом типа 1 и 2, Me(Q₁-Q₃)

Примечание. Здесь, и в табл. 3: p₁ - уровень значимости различий по сравнению со значениями у здоровых доноров; p₂ - уровень значимости различий по сравнению со значениями у пациентов сахарным диабетом типа 1. ЛПНП - липопротеины низкой плотности, ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности, ЛПВП - липопротеины высокой плотности, ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности

а) б) в)

Рис. 1. Содержание подфракции 2 липопротеинов высокой плотности (ЛПВП2), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП), суммарных апобелков липопротеинов высокой плотности (апо ЛПВП) и общего холестерина у больных сахарным диабетом типа 1 в зависимости от длительности сахарного диабета (а), степени компенсации углеводного обмена (б) и степени сосудитых осложнений (в).

Примечания. Здесь, и в рис. 2-3: * p<0,05 по сравнению со значениями здоровых доноров; ** p<0,01 по сравнению со значениями здоровых доноров; *** p<0,001 по сравнению со значениями здоровых доноров.

Анализируя данные изменения основных показателей липидного спектра сыворотки крови у больных сахарным диабетом в соответствии с классификацией D. Fredrikson, нами было отмечено частое развитие ДЛП IIб типа (у 29,4 % больных СД 1 и у 40,6 % больных СД 2) и IIа типа (22,2 % больных СД 1 и 40,6 % больных СД 2); IV тип ДЛП (12,5% больных СД 2) встречался реже. Таким образом, были выделены категории пациентов СД с различными нарушениями липидного обмена с учетом типа и степени их выраженности.

К настоящему времени сформировалось мнение, что при сахарном диабете патология липидного обмена создает основу для дезорганизации структуры и функции мембран эритроцитов [Кондратьева Е.И., 2001; Broncel M. et al., 2005] В этой связи особый интерес представляет выявление общих закономерностей и особенностей модификации мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом с различными нарушениями липидного метаболизма.

Рис. 2. Содержание фракций фосфолипидов в мембране эритроцитов у больных сахарным диабетом типа 1 и 2

Как показали хроматографические исследования, изменения относительного содержания фракций мембранных липидов эритроцитов у всех пациентов с сахарным диабетом были практически однонаправленными и характеризовались увеличением доли ХС и его эфиров, снижением содержания ФЛ. При этом среди ФЛ преобладали легкоокисляемые формы (фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитолы) на фоне значительного уменьшения доли ФХ, составляющего основу липидной фазы мембран эритроцитов у здоровых доноров, повышалось содержание лизофосфолипидов (рис. 2.).

Известно, что стабильное соотношение между фракциями фосфолипидов является необходимым условием оптимального функционирования мембраны эритроцита [Черняк Н.Б., 1976; Крепс Е.М., 1982]. Увеличение содержания ФС и ФИ на фоне уменьшения доли ФХ приводит к значительной дезорганизации липидного бислоя, проявляющейся прежде всего нарушением асимметрии мембраны. Выявленное у пациентов с СД повышение содержания лизофосфолипидов может быть связано как с повышением гидролиза ФЛ, так и со снижением активности лизо-фосфолипазы. В литературе есть данные, позволяющие считать, что ЛПВП принимают участие в «регенерации» бислоя, удаляя перекисномодифицированные остатки ФЛ, тем самым участвуя в восстановлении липидной фазы [Климов А.Н. и соавт., 2001]. Таким образом, недостаточность ЛПВП способствует усугублению дегенеративных процессов, протекающих в мембране. У пациентов с СД 2 наибольшее повышение содержания лизофосфолипидов в мембранах красных клеток крови было отмечено у больных с сопутствующим ожирением и оказалось равным 12,5 (6,0-20,0) %.

Полагают, что деградация фосфолипидного остова является одной из причин повышения содержания ХС в мембране эритроцитов при патологии. В результате повышенной активности фосфолиполиза и свободно-радикального окисления происходит разрушение фосфолипидных молекул, вследствие чего уменьшается их содержание в мембране, замещаясь на молекулы ХС [Болдырев А.А., 1990, 2006] . При дислипопротеинемиях наибольшее значение приобретает нарушение взаимодействия липопротеинов и плазмалеммы. В кровотоке постоянно происходит обмен липидными компонентами между мембраной эритроцитов и плазменными липопротеинами, причем ХС переходит в мембрану от ЛПОНП и ЛПНП, откуда возможно его включение в состав ЛПВП. Тем самым формируется равновесная система липопротеинов и плазмалеммы красных кровяных клеток, участвующая в регуляции структурного состояния последней [Bruckdorfer K.R., 1967; Quarford S.H., Hilderman H.L. 1970; Hollan S. et al., 1995, 1996; Broncel M. et al., 2005]. Изменение соотношения липопротеиновых комплексов приводит к нарушению равновесия миграции ХС, при этом значительное превалирование количества липопротеинов атерогенных классов над содержанием ЛПВП создают условия для преимущественного поступления ХС в мембраны эритроцитов.

По данным нашего исследования у пациентов с сахарным диабетом повышение содержания ХС в мембранах эритроцитов было достоверно значимым; причем степень увеличения доли ХС в мембранах не различалась у больных СД 1 и СД 2 (рис. 3.). Следует отметить, что у этих пациентов выявлялось увеличение значений индекса атерогенности и отношения ХС/ФЛ в сыворотке крови. Тем не менее обращало на себя внимание, что значительное повышение доли ХС в мембранах эритроцитов у пациентов с СД 1 не коррелировало с какими-либо особенностями клинического течения заболевания. Однако у больных СД 2 было отмечено увеличение доли эстерифицированного ХС по сравнению с его содержанием у пациентов СД 1 и здоровых доноров. Как известно, эстерификация ХС - один из способов его модификации, способствующий последующей акцепции ЛПВП [Болдырев А.А., 1990]. Поэтому накопление эфиров ХС в мембранах эритроцитов у больных с наибольшими значениями концентрации сывороточного ХС свидетельствует о недостаточной функции ЛПВП.

Считается, что увеличение доли ХС неблагоприятно сказывается на динамических свойствах липидов мембраны, так как благодаря своему влиянию на подвижность жирнокислотных хвостов липидного окружения, он способствует повышению микровязкости мембраны. Накопление холестерина в бислое может приводить к ингибированию пероксидации структурированных липидов за счет ограничения молекулярной подвижности жирнокислотных остатков фосфолипидного бислоя. В этом случае ХС выступает в роли структурного антиоксиданта и делает фосфолипидные молекулы более устойчивыми к действию свободных радикалов, которые в свою очередь способны разрыхлять мембранные образования [Горбунов Н.В., 1993; Клебанов Г.И., 1998]. Поэтому поддержание необходимой жесткости мембраны холестерином подчас рассматривается как адаптивная реакция в условиях развития ряда патологических процессов.

Таблица 3

Результаты флуоресцентного зондирования флуорофором пирен и исследования активности Nа⁺,K⁺- ATФазы в мембранах эритроцитов у больных сахарным диабетом типа 1 и 2, Me(Q₁-Q₃)

Наряду с этим динамические свойства липидов, входящих в состав бислоя, определяются большим количеством факторов, среди которых имеют значение степень насыщенности и длина ацильных цепей, состояние и количество белка в мембране, pH и ионная сила [Кагава Я., 1985; Болдырев А.А., 1990]. Для определения роли нарушения липопротеинового обмена в механизмах структурных изменений липидного бислоя мембран эритроцитов нами была проведена оценка их микровязкостных свойств у больных с ДЛП. Результаты наших исследований подтвердили наличие нарушения динамических свойств липидной фазы мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом (табл. 3). Так, было установлено достоверное снижение соотношения интенсивностей флуоресценции эксимерных и мономерных молекул пирена (J₄₇₀/J₃₇₀), регистрируемых при длине волны возбуждающего света 340 нм (на 25% по сравнению с нормой), что является отражением возрастания микровязкости липидной фазы мембран. При исследовании структуры мембран эритроцитов у больных СД 1 в области белок-липидных контактов также было выявлено возрастание их микровязкости, на что указывало снижение (на 23% по сравнению с нормой) степени эксимеризации пирена при л_В=285 нм.

В ходе исследования было также показано, что выраженность выявленных изменений микровязкости мембраны зависела от длительности диабета. В частности, параметры флуоресценции зонда пирен у пациентов СД 1 со стажем диабета менее 5 лет значимо не отличались от аналогичных показателей у здоровых доноров (величина коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ при л_В=285 нм составила 0,323 (0,227-0,348) усл. ед., а при л_В=340 нм - 0,371 (0,342-0,417) усл. ед.). Повышение микровязкости мембран эритроцитов у пациентов с более длительным течением СД 1 по сравнению со здоровыми лицами было более выраженным, о чем свидетельствовали значимо более низкие показатели степени эксимеризации пирена как при л_В=285 нм (величина коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ составила 0,248 (0,203-0,293), p<0,01), так и при л_В=340 нм (величина коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ составила 0,321 (0,304-0,376) усл. ед., p<0,01). В группе пациентов с декомпенсацией углеводного обмена было отмечено достоверное увеличение коэффициента J₃₇₀/J₃₉₀ (0,962 (0,960-0,970) усл. ед., p<0,01) при л_в=340 нм, отражающего степень полярности окружения зонда пирен. Изменение других параметров флуоресценции у больных СД 1 с различной компенсацией углеводного обмена имело одинаковую степень выраженности.

Липопротеины, участвуя в регуляции химического состава липидного компонента мембраны, влияют и на её структурные свойства, что подтверждается данными корреляционного анализа. Так, при обследовании больных СД 1 были выявлены корреляционные взаимосвязи между параметрами флуоресценции зонда пирен и показателями липидного спектра сыворотки крови. При этом у больных сахарным диабетом отмечалась положительная корреляция между коэффициентом полярности окружения зонда пирен и содержанием подфракции ЛПОНП₁ (r=0,79, р<0,01). Было также обнаружено, что ЛПВП оказывают благоприятное влияние на величину микровязкости интегрального слоя липидной фазы мембран эритроцитов, на что указывало наличие прямой корреляции между содержанием ЛПВП и коэффициентом эксимеризации пирена при л_в=340 нм (r=0,73, р<0,05).

Весьма интересные результаты были получены при оценке микровязкости липидной фазы мембран эритроцитов у пациентов с СД 2, отличавшихся существенными нарушениями липидного спектра сыворотки крови. Так, у обследованных больных СД 2 медиана значений параметров флуоресценции зонда пирен при взаимодействии с мембраной эритроцитов статистически не отличалась от соответствующего параметра в группе здоровых доноров (табл. 2). Однако анализ полученных данных методом К-средних позволил выявить среди пациентов СД 2 кластеры с разнонаправленными изменениями текучести мембран эритроцитов. Классификация данных проводилась с учетом коэффициента эксимеризации зонда пирен при л_в=340 нм и л_в=285 нм, а также коэффициента полярности J₃₇₀/J₃₉₀. В первый кластер были объединены 36% пациентов со сниженными величинами коэффициентов J₄₇₀/J₃₇₀ при л_в=340 нм (средние значения составили 0,220±0,025 усл. ед.) и л_в=285 нм (средние значения - 0,182±0,014 усл. ед.), а также уменьшенными значениями коэффициента полярности окружения зонда пирен (средние значения - 0,914±0,027 усл. ед.). У пациентов этого кластера было отмечено менее выраженное повышение индекса атерогенности по сравнению с больными других групп (значения составили 4,25 (3,83-5,76)). Особенностью данного кластера пациентов явилось высокое содержание в крови ТГ и ЛПОНП (содержание ТГ составило 248,57 (181,44-269,43) мг/дл, ЛПОНП - (285,68 (116,87-291,95) мг/дл)). ЛПОНП включают много насыщенных жирных кислот, что, вероятно, может обеспечивать дезорганизацию структуры мембран эритроцитов в связи с уплотнением липидных молекул относительно друг друга. При этом важно отметить снижение коэффициента полярности окружения зонда пирен в мембране эритроцитов J₃₇₀/J₃₉₀ (средние значения - 0,914±0,027 усл. ед.) у данной группы пациентов, свидетельствующее об уменьшении количества полярных групп интегральной зоны.

Наряду с этим была выделена группа больных СД 2, у которых мембрана эритроцитов характеризовалась повышенной текучестью и высокой полярностью гидрофобного слоя. У пациентов этой группы были зарегистрированы увеличенные значения J₄₇₀/J₃₇₀ при л_в=340 нм (средние значения - 0,548±0,057 усл. ед.) и при л_в=285 нм (средние значения - 0,574±0,040 усл.ед.). При этом средняя величина коэффициента полярности J₃₇₀/J₃₉₀ оказалась выше, чем у пациентов первого класса (0,955±0,007 усл. ед., p<0,05). В этот кластер были включены 25% больных СД 2 с наибольшими значениями индекса атерогенности (8,73 (5,37-12,30)) и наименьшим содержанием ЛПВП (243,03 (120,64-330,95) мг/дл). Вероятно, гидрофильные продукты ПОЛ в больших количествах, накапливаясь в мембранах при недостаточном содержании в плазме ЛПВП, обладают детергентным действием и способствуют повышению разупорядоченности липидного бислоя [Каган В.Е. и соавт., 1975; Новиков К.Н., 2004]. Это в свою очередь вызывает увеличение подвижности полипептидных цепей интегральных белков в мембране. Высокая полярность группировок (гидроперекисных, гидроксильных, карбонильных), появляющихся в результате индукции ПОЛ в полиеновых “хвостах” фосфолипидов, нарушает гидрофобные белок-липидные взаимодействия в мембране. Таким образом, из-за увеличения степени ненасыщенности, избыточной пероксидации изменяется направленность ацильных остатков.

Показатели микровязкостных свойств мембраны эритроцитов у пациентов третьей группы, в состав которой были включены 39% обследованных пациентов СД 2, соответствовали следующим значениям: средние величины коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ составили 0,434±0,018 усл. ед. при л_в=340 нм и 0,348±0,016 усл. ед. при л_в=285 нм. Выраженность нарушений липидного обмена у этих больных также носила практически промежуточный характер. Таким образом, отмеченное нами разнообразие структурных нарушений мембран эритроцитов, видимо, определяется различными проявлениями воздействия ряда факторов, имеющих влияние на биофизические свойства мембраны. К их числу, на наш взгляд, правомерно отнести нарушения липидного обмена.

При рассмотрении изменений структурных свойств мембран эритроцитов у пациентов с различными типами ДЛП отмечено увеличение микровязкости мембран эритроцитов у больных с повышенным содержанием в сыворотке крови ЛПОНП. Структурные свойства мембран красных кровяных клеток у больных с другими типами ДЛП не различались ни между собой, ни с соответствующими параметрами у здоровых доноров.

Как показало проведенное нами исследование, в мембранах эритроцитов у больных СД угнетена активность Na⁺,K⁺-ATФазы (табл. 3). Не исключено, что ингибирование активности Na⁺,K⁺-ATФазы является результатом выявленной структурной модификации липидного матрикса мембран эритроцитов. Общепринятой является точка зрения о том, что регулирующая роль липид-белковых взаимодействий для Na⁺,K⁺-ATФазы сводится к обеспечению ее каталитических функций и переходов между различными конформационными состояниями посредством поддержания определенной микровязкости мембраны, а также за счет взаимодействия заряженных боковых цепей этих ферментов с полярными головками мембранных липидов [Грибанов Г.А., 1991; Зелинский Б.А., 1994; Успенская Ю.А., 2002].

Рассматривая механизмы структурной модификации мембраны эритроцитов, важно отметить множественность внутри- и внеклеточных эффекторов, которые могут индуцировать друг друга или оказывать свое влияние изолированно. При СД имеют значение гипергликемия, стадия ее компенсации, активация свободно-радикального окисления и недостаточность антиоксидантных систем, а также нарушения липидного обмена. В частности известно, что липопротеины как одна из регуляторных систем организма имеет значение для поддержания структурного гомеостаза клеточных мембран. Нарушение транспорта липидов может привести к срыву реакций адаптации и формированию необратимых нарушений в мембранах. Именно поэтому изучение изолированного действия липопротеинов на мембрану эритроцитов в опытах in vitro представилось нам весьма интересным.

Выше было указано на важную роль липопротеинов в обновлении мембранных компонентов, причем ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП могут оказывать разнонаправленные эффекты, меняя тем самым структурно-функциональные свойства мембраны. Некоторые авторы предполагают факт возникновения комплекса эритроцит-липопротеин, в котором и происходит свободная диффузия ХС [Болдырев А.А., 1990]. Изучая спектральные характеристики взаимодействия липотропного зонда пирен с мембраной эритроцитов крыс до и после инкубации мембранной взвеси с липопротеинами основных классов (ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП), мы обнаружили модифицирующее влияние, проявляющееся в изменении текучести липидной фазы и характера белок-липидных взаимодействий (табл. 4). Очевидно, что образование комплекса липопротеин-мембрана сопровождается кратковременными локальными изменениями физико-химических свойств бислойной структуры, которые способствуют молекулярному обмену липидов. Сформировавшийся комплекс, вероятно, представляет собой особую структуру с существованием раздела фаз, преодолевать который помогают силы гидрофобного взаимодействия.

Таблица 4

Результаты флуоресцентного зондирования флуорофором пирен мембраны эритроцитов у крыс при инкубации с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП), липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОНП), Me(Q₁-Q₃)

Примечание: р - уровень значимости различий по сравнению со значениями параметров, характеризующих состояние мембран эритроцитов у крыс до инкубации с липопротеинами

Ранее отмечалось, что мембрану ХС покидает в этерифицированном виде. Будучи менее полярными соединениями, эфиры ХС легче проходят через границу раздела фаз, где связываются с ЛПВП и подвергаются дальнейшему метаболизму. Возможно, приток ХС от ЛПНП и ЛПОНП в мембрану проходит похожим образом, только в обратном направлении. Важное значение в этих перемещениях имеют входящие в состав липопротеинов апобелки. Известно, что белки снижают энергию активации, необходимую для десорбции липидов в жидкую фазу, тем самым облегчая процесс переноса амфипатной молекулы [Sprong H., 2001]. Кроме того, особенности строения аполипопротеинов, высокая степень спирализации структуры и наличие амфипатных областей, ответственных за связывание с липидами, обусловливает их детергентные свойства [Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000]. На наш взгляд, изучение влияния очищенных аполипопротеинов (А-I, С и Е) при ДЛП является закономерным продолжением исследования механизмов модификации мембраны эритроцитов. Нами были обнаружены принципиальные различия воздействия этих апобелков. В частности, аполипопротеин А-I, наибольшее количество которого присутствует в ЛПВП, оказывал «разжижающее» действие на мембрану эритроцитов. Об этом свидетельствовали достоверное повышение отношения интенсивностей флуоресценции димерной и мономерной форм флуорофора пирен (J₄₇₀/J₃₇₀) после инкубации с раствором апобелка как при длине волны возбуждающего света 340 нм (значения коэффициента до инкубации составили 0,240 (0,237-0,253) усл. ед., после - 0,353 (0,318-0,403) усл.ед. при, p<0,05), так и при 285 нм (значения коэффициента до - 0,167 (0,159-0,190) усл. ед., после инкубации составили 0,283 (0,214-0,322) усл.ед., p<0,05). При этом в мембране изменялся характер белок-липидных взаимодействий. Медиана величины миграции энергии с триптофана на пирен увеличилась с 42,63 (40,00-43,75) % до и до 46,06 (44,64-47,62) % - после инкубации (p<0,05).