Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях

03.00.03 - Молекулярная биология

кандидата биологических наук

Ходырев Дмитрий Сергеевич

Москва - 2009

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук Брага Элеонора Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич ГУ Медико-генетический научный центр

доктор биологических наук, профессор Сломинский Петр Андреевич Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится «10» ноября 2009г. в 14⁰⁰ часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

Автореферат разослан «____» _____________ 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук Т.Л. Воюшина

метилирование опухоль молочный онкозаболевание

Содержание работы

1. Выборка образцов и методы исследований. Для исследования уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR-beta2, SEMA3B, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1 была использована комбинация методов: 1) ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщепленной с помощью набора метилчувствительных рестриктаз (МЧРА); 2) модификация геномной ДНК бисульфитом с последующей ПЦР, специфичной к метилированному аллелю гена (МС-ПЦР), или секвенированием ПЦР-продукта исследуемого фрагмента гена (бисульфитное секвенирование). Основные статистические методы - критерий Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием t-теста Стьюдента.

Исследования были проведены с использованием 231 пары образцов ДНК, выделенных из опухолевых (Т) и морфологически нормальных (N) тканей. Выборка включала 83 случая светлоклеточного почечноклеточного рака (ПКР), 38 случаев рака легкого (НМКРЛ, наиболее представлены плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома), 110 случаев рака молочной железы (РМЖ, преимущественно представлены случаи с инфильтративно-протоковой гистологией). Все исследованные нами опухоли были классифицированы клинически по системе TNM принятой Международным противораковым союзом, UICC-2002 г., и гистологически в соответствии с ВОЗ в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН. При отборе материала проводили дополнительный гистопатологический анализ микросрезов (3-5 мкм), что обеспечило отбор образцов с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Были использованы образцы опухолей только тех пациентов, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. В качестве контролей использовали лейкоциты переферической крови от 15 здоровых доноров и образцы тканей легкого, почки и молочной железы от 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе.

2. Определение профиля метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1) в различных эпителиальных опухолях.

2.1. Изменение профилей метилирования промоторных областей генов RASSF1A и RAR-beta2 в эпителиальных опухолях.

Ген RASSF1A (Ras Association Domain Family 1A) локализован в районе 3p21.31 короткого плеча 3 хромосомы (3p). Этот ген протяженностью 7.6 т.п.н. содержит 5 экзонов и кодирует м-РНК длиной 2 т.н. Белковый продукт RASSF1A относится к цитоплазматическим белкам. Выявлено многообразие функций этого белка в клетке, например, задержка клеточного цикла (Shivakumar et al., 2002), участие в индукции апоптоза за счет взаимодействия с продуктом онкогена ras (Vos et al., 2000) или гена MST1 (Oh et al., 2006), стабилизация микротрубочек (Пфайфер и Дамманн., 2005). Супрессорная активность гена RASSF1A подтверждена и с помощью нокаут-мутаций гена в клетках мыши (Tommasi et al., 2005).

Ген RAR-beta2 локализован в районе 3р24 относится к суперсемейству ядерных рецепторов, которые служат лиганд-активирующими транскрипционными факторами (Chambon et al., 1996). Лигандами для рецепторов класса RAR являются ретиноиды - витамин А и его биологически активные метаболиты. Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим, их используют для профилактики и терапии различных опухолей (Hong et al., 1995). Во многих случаях метилирование промоторной области данного гена было обнаружено в предраковых новообразованиях, и частота метилирования возрастала с прогрессией заболевания и образованием карцином (Feng et al., 2007; Fendri et al., 2009; Garcнa et al., 2009).

Физические карты промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 представленны на рисунке 1а и 1б. На рис. 1 показаны CpG-динуклеотиды анализируемых фрагментов и позиции праймеров, использованных в данной работе. При анализе гена RASSF1A применяли метод МС-ПЦР, а RAR-beta2 - метод МЧРА, с использованием 3-х метил-чувствительных рестриктаз - HpaII, Bsh1236I, AciI и бисульфитное секвенирование. Для RASSF1A исследованы 76 случаев ПКР, 110 случаев РМЖ и 32 случая НМКРЛ, для RAR-beta2 - 61, 56 и 37,соответственно.

Рисунок. 1. Физические карты промоторных районов генов RASSF1A (А) и RAR-beta2 (Б). Показаны экзоны гена, начало 1-го экзона (+1). A. Праймеры для МС-ПЦР (M/U-L и M/U-R), показаны белым цветом на сером фоне. Б. Показаны праймеры использованные для бисульфитного секвенирования (Rar-m-F и Rar-m-R, белым цветом на темно-сером фоне), для МЧРА (RAR-F1 и RAR-R1) и для контроля сохранности препарата ДНК после рестрикции (RAR-F2 и RAR-R1); стрелками отмечены прямые (>) и обратные праймеры (<).

На рисунке 2 приведены примеры анализа метилирования CpG-островка гена RASSF1A (2а,2в) и гена RAR-beta2 (2б).

Рисунок 2.

А. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной области гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в 2-х образцах ПКР 199 и 333. Электрофоретическое разделение в 10%-ном ПААГ продуктов МС-ПЦР, полученных для образцов ДНК ПКР. ПЦР проводили на ДНК, конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент гена RASSF1A, 168 п.н. Показаны продукты ПЦР, специфичной к метилированному (M) и неметилированному (U) аллелю. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования ДНК, использовали ДНК плаценты (placental tissue DNA) после обработки метилтрансферазой SssI (SssI). ДНК из лимфоцитов крови использовали как контроль для неметилированных аллелей (limph). К(-) - отрицательный контроль (в отсутствии ДНК). L - маркер с шагом 10 п.н.

Б. Примеры применения МЧРА для гена RAR-beta2: Электрофоретическое разделение в 2% агарозном геле продуктов ПЦР для 2-х образцов ДНК ПКР, до(T/N) и после (T+/N+) гидролиза рестриктазой Bsh1236I. Исследуемый фрагмент гена RAR-beta2 - 680 п.н.; Контроль на полноту рестрикции (K2) - фрагмент гена beta-3А-адаптина, 445 п.н.; контроль сохранности ДНК (K1) - фрагмент экзона 3 гена RAR-beta2, 229 п.н.; К(-) - отрицательный контроль (в отсутствии ДНК). М - маркер с шагом полос 100 п.н.; T - продукт амплификации ДНК из опухолевой ткани; N - продукт амплификации ДНК из нормальной ткани.

В. Проверка полноты бисульфитной конверсии с применением праймеров, гомологичных фрагменту гена в исходной ДНК, не модифицированной бисульфитом: электрофоретическое разделение в 10%-ном ПААГ продуктов ПЦР. Исследован фрагмент гена RASSF1A, 168 п.н. ПЦР проводили на исходных препаратах ДНК (T/N) и на образцах ДНК, конвертированных бисульфитом (T(+)/N(+)). L - маркер с шагом 10 п.н.

Пример результатов анализа метилирования промоторных областей 2-х генов схематически представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. А. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метилирования CpG-островка промоторной области гена RAR-beta2. Сверху даны позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 4, 5, 6, 11, 14 и 15, исследованные двумя методами, отмечены белым шрифтом на сером фоне; с левого края приведены номера образцов ПКР. Черный прямоугольник указывает на выявление метилирования, белый прямоугольник - метилирование не выявлено. Приведены данные анализа для 9-ти образцов ДНК первичных опухолей ПКР (t) и образцов ДНК условно-нормальной ткани почки от 4-х пациентов (n). Б. Применение метода МС-ПЦР при анализе метилирования CpG-островка гена RASSF1A. Справа показаны клинико-гистологические характеристики опухоли: стадия и степень анаплазии опухоли.

Метод МС-ПЦР позволяет тестировать только 6 CpG-динуклеотидов в промоторной области гена RASSF1A, входящих в состав праймеров (M/U-L, M/U-R) (рис.1а). Для гена RAR-beta2 метод МЧРА позволил тестировать 8 CpG-динуклеотидов (рис.1б) в промоторном районе. Данные, полученные методом МЧРА, были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования. На рисунке 4 приведены примеры бисульфитного секвенирования этого фрагмента. Показан участок в 40 п.н., перекрывающий 6 CpG-динуклеотидов. Соответствие результатов бисульфитного секвенирования и МЧРА оценивали с использованием ранговой корреляции Спирмана. Результаты этих методов совпали в 44 из 78 CpG (22 с метилированием и 22 без метилирования). Корреляция результатов, полученных двумя независимыми методами для образцов ПКР, высоко достоверна: Rs=0.98, t=15,8, н=11, Р=6.52х10^-9.

Рисунок 4. Примеры бисульфитного секвенирования фрагмента гена RAR-beta2 (280 п.н.). Показан участок в 40 п.н. СрG-динуклеотиды подчеркнуты и пронумерованы в соответствии с рис 1б. (А) Исходный фрагмент до обработки бисульфитом (образец ПКР 500). (Б) Модифицированный неметилированный фрагмент (образец ПКР 703): все остатки цитозинов дезаменированы и превращены в тимин. (В) Модифицированный метилированный фрагмент (образец ПКР 500): цитозин в СрG-динуклеотидах остался не измененным, остальные остатки цитозина конвертированы в тимин.

Данные по частоте метилирования промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 представленны в таблице 1.

Таблица 1. Частота метилирования промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 в образцах ДНК ПКР, РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

*Под частотой метилирования подразумевали долю образцов, в которых данный ген метилирован.

Итак, в данной работе впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена RAR-beta2 при ПКР, данные по частоте метилирования при РМЖ и НМКРЛ согласуется с данными литературы (Karray-Chouayekh et al., 2009; Onay. et al., 2009; De Jong et al., 2009). Результаты данной работы подтверждают высокую частоту метилирования промоторного района гена RASSF1A в этих эпителиальных опухолях и весьма близки с данными других авторов (Dammann et al., 2005; Karray-Chouayekh S. et al., 2009). В ДНК из крови 15-ти здоровых доноров, а также 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе, не выявлено ни одного случая метилирования CpG-островка гена RASSF1A и RAR-beta2.

2.2. Изменение профилей метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B в эпителиальных опухолях.

Ген SEMA3B локализован в области 3р21.31. Он состоит из 18-ти экзонов, (9533 п.н., NCBI, Build 36), кодирует мРНК длинной 3.4 т.н. и белок 750 а.е. (Lerman&Minna, 2000). Функции гена SEMA3B разнообразны и связаны с онкогенезом. Ген SEMA3B может подавлять рост клеточной линии рака легкого NCI-H1299 и образование опухолей в мышах с иммунодефицитом (Tomizawa et al., 2001; Tse et al., 2002). Белок SEMA3B способен ингибировать активацию онкобелков MET и RON, индуцировать апоптоз и подавлять неоангиогенез в опухолях (Киселев и др., 2005). Во многих линиях клеток мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого выявлено метилирование CpG-островка в 5'области гена (Tomizawa et al., 2001; Kuroki et al., 2003; Ito et al., 2005), которая, как выяснилось позднее, соответствовала области первого интрона гена (NCBI, Build 36). Мы обнаружили локализованный в промоторной области протяженный CpG-островок (дистальный)(рис.5) с более высокой плотностью CpG-динуклеотидов (22 CpG/772 п.н.) по сравнению с проксимальным (8 CpG/400 п.н.), способный к связыванию ряда факторов транскрипции, содержащих участки взаимодействия с CpG-динуклеотидами (NCBI Build 36). В связи с этим представлялось целесообразным изучить и сравнить частоту метилирования двух CpG-островков в различных видах рака.

На рисунке 5 показана структурная организация гена SEMA3B, включая расположение промоторного (1-го) и интронного (2-го) CpG-островков.

Рисунок 5. Структурная организация гена SEMA3B. Показаны 2 CpG-островка: проксимальный (2-й CpG-островок) - в области интрона между нетранслируемым экзоном 1 и транслируемым экзоном 2 (перед ATG1, по Tomizawa et al., 2001), и дистальный (1-й CpG-островок) - в промоторной области гена (перед ATG2 по базе данных NCBI, версия 36). 1-й CpG-островок содержит 22 CpG-динуклеотида на участке 772 п.н., а 2-й CpG-островок - восемь CpG на участке 400 п.н.

В данной работе исследованно 83 парных (T/N) образца почечноклеточного рака, 61 образцец рака молочной железы и 38 образцов немелкоклеточного рака легкого. Методом МС-ПЦР определяли статус метилирования 6-ти CpG-динуклеотидов в дистальном CpG-островке и 3-х CpG-динуклеотидов - в интронном. Данные по частотам метилирования обоих CpG-островков представлены в таблице 2.

Таблица 2. Частота метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B в опухолях почки (ПКР), молочной железы (РМЖ) и немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ).

В данной работе впервые проведено сравнение частоты метилирования промоторного и интронного CpG-островков гена SEMA3B в опухолях почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого, показано, что частота метилирования промоторного островка выше в 1,5 раза во всех из представленных видов опухолей. Кроме того, получены данные для ПКР о понижении содержания мРНК гена SEMA3B при появлении метилирования в промоторном CpG-островке (Пронина и др., 2009), что позволяет предположить роль промоторного CpG-островка в инактивации гена-супрессора SEMA3B при почечноклеточном раке. По данным литературы метилирование интронного CpG-островка наблюдали ранее при раке легкого (Tomizawa et al., 2001; Kuroki et al., 2003; Ito et al., 2005), а также при нейробластоме, раке печени и желчного пузыря (Tischoff et al., 2005; Nair et al., 2007; Riquelme et al., 2007). Однако не было сообщений о метилировании промоторного CpG-островка этого гена в каких-либо видах эпителиальных опухолей.

2.3. Изменение профилей метилирования промоторных областей генов RHOA/ARHA, USP4 и GPX1 в эпителиальных опухолях.

Нами проведен предварительный анализ уровней мРНК ~30 генов из открытого нами нового «критичного» района между маркерами D3S2409 и D3S3667 (3p21.31, 600 т.п.н., Логинов и др., 2008) в эпителиальных опухолях. Использована информация, представленная в базах данных SAGE (серийный анализ экспрессии генов). В эпителиальных опухолях выявлены изменения уровня мРНК более 10-ти генов. Среди этих генов были отобраны три близко расположенных гена (RHOA/ARHA, USP4 и GPX1), которые согласно данным литературы, связаны с важными функциями клетки и предположительно участвуют в процессах онкогенеза.

Ген RHOA кодирует белок суперсемейства Ras-гомологичных малых гуанозинтрифосфатаз (Sahai and Marshall, 2002). Играет роль в адгезии, в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также в сигнальных путях клетки (Vial et al., 2003; Liu et al., 2004). Вызывает онкогенную трансформацию клеток in vitro и in vivo; усиливает инвазию опухолей (Kamai et al., 2003, 2004).

Ген USP4 кодирует убиквитин-специфическую протеазу 4-го типа (Unp), которая отщепляя убиквитин (76 а.о.), может на время останавливать процесс протеолитической деградации в протеасомах коротко-живущих белков, в том числе, регуляторных белков и компонентов сигнальных путей клетки, включая циклины A, B, E, p27, р53 и pRb, транскрипционные факторы E2F, NF-кB, протоонкогены c-myc, c-jun, c-fos, а также Ser/Thr-киназа c-mos (DeSalle et al., 2001). Ген USP4 на 90% идентичен мышиному протоокогену Unp, кодирующему ядерную убиквитин-специфическую протеазу, увеличение экспрессии которой приводит к онкогенной трансформации NIH3T3 клеток (Gupta et al., 1994). В одной из работ показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях легкого, а также онкогенная трансформация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et al., 1995). В другой работе, напротив, обнаружено снижение уровня Unp-белка в клеточных линиях МКРЛ и наличие двух изоформ в клеточных лизатах: 105 и 110 кД (Frederick et al., 1998).

Продукт гена GPX1 (glutathione peroxidase 1) восстанавливает перекись водорода и ее производные и представляет наиболее распространенный член семейства глутатионпероксидаз. Этот белок локализован в митохондриях, ядре и цитоплазме (Diwadkar-Navsariwala and Diamond, 2004). Как антиоксидантный селенопротеин он играет центральную роль в защите клеток от окислительного стресса и разрушения. Выявлено снижение белкового продукта гена GPX1 в злокачественных опухолях легкого (плоскоклеточный рак и аденокарцинома, Korotkina et al., 2002) и снижение мРНК в опухолях щитовидной железы (Hasegawa et al., 2002), а также способность подавлять рост эндотелиальной линии клеток ECV304 (Faucher et al., 2003). Показана связь определенных полиморфных аллелей гена с развитием разных форм рака, например, рака молочной железы (Hu et al., 2003). Предполагается, что промоторная область гена GPX1 связывает p53 (как транскрипционный фактор), что сопровождается повышением экспрессии GPX1 и стимуляцией апоптоза (Hussain et al., 2004).

Анализ метилирования CpG-островков в промоторных областях генов GPX1, RHOA и USP4 был выполнен методом МЧРА с применением 2-х метил-чувствительных рестриктаз HpaII и HhaI. Исследование проведено на образцах ПКР от 39 пациентов, РМЖ от 54 пациентов и на образцах НМКРЛ от 37 пациентов. Структурная организация генов, рестрикционная карта исследованных фрагментов и позиции праймеров показаны на рисунке 6.

Рисунок 6. Структурная организация генов USP4(А), GPX1(Б) и RHOA(В). Показаны положение ATG кодонов и CpG-островков. Также показаны, позиции праймеров, использованных при МЧРА для амплификации фрагмента USP4 (USP4-F и USP4-R; 598 п.н.)(А), для фрагмента GPX1 (GPX1-F и GPX1-R; 437 п.н.)(Б) и для фрагмента RHOA (RHOA-F, RHOA-R; 416 п.н.)(В). (>) - прямой праймер; (<) - обратный праймер.

Методом МЧРА определяли профиль метилирования 6 CpG-динуклеотидов в CpG-островке гена USP4, 12 CpG-динуклеотидов в CpG-островке гена GPX1 и 11 CpG-динуклеотидов в CpG-островке гена RHOA. Данные по частотам метилирования CpG-островков этих генов представлены в таблице 3. Для более полной картины был определен уровень метилирования каждого из генов, который рассчитывали как долю метилированных CpG-динуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК в данной выборке образцов(табл.3).

Таблица 3. Частоты и уровни метилирования CpG-островков генов USP4, GPX1 и RHOA в образцах ДНК ПКР, РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

* Под уровнем метилирования подразумевали долю метилированных CpG-динуклеотидов из суммарно исследованных для конкретного CpG-островка в расчете на все образцы данной выборки. За 100% принимали произведение количества CpG, исследованных в конкретном CpG-островке, на число случаев в соответствующей выборке. Уровень метилирования включает в себя как частоту встречаемости случаев метилирования, так и плотность метилирования (долю метилированных CpG в каждом случае).

При РМЖ выявлено достоверное повышение частоты метилирования гена USP4, а при ПКР уровня метилирования гена GPX1. Эти данные указывают на возможное участие этих генов в супрессии данных видов опухолей. При НМКРЛ, напротив, отмечено понижение частоты метилирования для гена USP4 и уровня метилирования для гена RHOA. Эти данные указывают на возможное участие этих генов в роли протоонкогенов при НМКРЛ. Вызывает интерес ген USP4, для которого в случае ПКР и НМКРЛ наблюдается деметилирование CpG-островка промоторной области гена, в то время как при РМЖ наблюдается прямо противоположная картина. Это может быть связано с ткане-специфичным характером метилирования CpG-островка гена USP4. Полученные данные согласуются с приведенными выше данными литературы по функциям этих генов в опухолевой клетке. В литературе нет сообщений по характеристике метилирования генов GPX1, RHOA и USP4 в опухолях. Таким образом, результаты по изменению метилирования этих генов при ПКР, РМЖ и НМКРЛ представлены нами впервые.

2.4. Изменение профиля метилирования трех участков протяженного CpG-островка гена NKIRAS1 в эпителиальных опухолях.

Ген NKIRAS1 - NFKB inhibitor interacting Ras-like 1, или гомолог онкогена Ras, взаимодействующий с фактором некроза NF-kappaB. Его другие названия: KBRAS1 и kappaB-Ras 1. Белковый продукт гена функционирует как G-белки, связанные с GTP/GDP и проявляющие GTP-азную активность. Показано, что белок NKIRAS1 участвует в регуляции деградации IkappaB (Fenwick et al., 2000) и в комплексе с IkappaB подавляет активность NF-kappaB (Chen et al., 2004). Ген NKIRAS1 содержит протяженный CpG-островок (1800 п.н.), окружающий 1-ый нетранслируемый экзон (рис.7). В этом островке мы выбрали три фрагмента, доступные для анализа методом МЧРА. Метилирование каждого из трех фрагментов CpG-островка данного гена было исследовано в 26 случаях РМЖ и 30 случаях НМКРЛ. Структурная организация гена, рестрикционная карта и позиции праймеров, использованных в работе, показаны на рисунке 7.

Рисунок 7. Структурная организация гена NKIRAS1: Показаны экзоны гена, начало 1-го экзона (+1), положение CpG-островка и расположение участков узнавания двух метилчувствительных рестриктаз : HpaII (9 участков) и HhaI (11 участков) - в протяженном CpG-островке. Показаны также позиции праймеров, использованных при МЧРА, трех исследованных фрагментов: фрагмента №1 (F1 и R1, 423 п.н.), фрагмента №2 (F2 и R2, 522 п.н.) и фрагмента №3 (F3 и R3, 472 п.н.); (>) - прямой праймер; (<) - обратный праймер.

Метод МЧРА с использованием 2-х метилчувствительных рестриктаз - HpaII и HhaI позволил определить профиль метилированя 8 CpG-динуклеотидов в первом фрагменте, 7 во втором и 10-ти в третьем. А для более полной картины был определен уровень метилирования каждого из трех фрагментов гена NKIRAS1. Данные по частоте и уровню метилирования 3-х фрагментов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Частота и уровень метилирования 3-х фрагментов CpG-островка гена NKIRAS1 в образцах ДНК РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

Согласно данным МЧРА наблюдается деметилирование каждого из фрагментов гена NKIRAS1, а т.к. данный ген имеет гомологию с онкогеном RAS и взаимодействует с фактором некроза опухолей NF-kappaB (Chen et al., 2004) можно предположить онкогенные функции данного гена при РМЖ и НМКРЛ. Причем, при РМЖ фрагменты 1 и 2 показывают достоверные различия с учетом уровня метилирования, в то время как при НМКРЛ наиболее дистальные фрагменты показывают статистически достоверные различия как частоты, так и уровня метилирования CpG-динуклеотидов этих фрагментов. Данные о метилировании гена NKIRAS1 получены впервые.

Следует также сказать, что в случае генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, GPX1 не было выявлено методами МС-ПЦР и МЧРА ни одного случая метилирования в лейкоцитах переферической крови от 15 здоровых доноров и в образцах тканей легкого, почки и молочной железы от 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе. Напротив, метилирование было выявлено во всех образцах контролей в случае генов RHOA и NKIRAS1. В случае гена USP4 ситуация неоднозначная, т.к. было выявлено, что изменение метилирования этого гена обладает ткане-специфичным и опухоль-специфичным характером. Ген USP4 метилирован в ДНК лейкоцитов от 15 здоровых доноров. Представляет интерес выявление метилирования промоторных районов, данных генов в образцах ДНК из гистологически нормальной ткани онкологического пациента, что может указывать на возможность молекулярных изменений в эпителиальных тканях еще до появления морфологически выраженной патологии. Для ряда генов (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA) в нашей лаборатории проведено исследование на наличие гомозиготных делеций в промоторных областях этих генов, гомозиготные делеции выявлены с частотой 5-10% (данные не представленны). Образцы с гомозиготными делециями были исключены из соответствующих выборок при исследовании метилирования.

3. Анализ корреляций между изменением метилирования CpG-островков генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, GPX1, USP4, RHOA и NKIRAS1 и клинико-гистологическими характеристиками исследованных опухолей ПКР, РМЖ и НМКРЛ.

Во второй части работы на основе полученных результатов проводили выявление возможных корреляций частоты и уровня метилирования промоторных CpG-островков представленных генов с клинико-гистологическими характеристиками опухолей, такими как стадия, степень анаплазии и размер опухоли, а также метастазирование в регионарные лимфатические узлы.

3.1. Связь метилирования промоторных CpG-островков генов RASSF1A и RAR-beta2 с прогрессией эпителиальных опухолей.

Для генов RASSF1A и RAR-beta2 исследована корреляция частоты метилирования промоторных CpG-островков с клинической стадией, степенью анаплазии, метастазированием в регионарные лимфатические узлы и размером опухолей почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого; результат представлен на рисунке 8.

Рисунок 8. Корреляция частоты метилирования гена RAR-beta2 с прогрессией почечноклеточного рака (ПКР), уровня метилирования с прогрессией рака молочной железы; частоты метилирования гена RASSF1A с прогрессией рака молочной железы (РМЖ) Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

Для гена RASSF1A связь между степенью метилирования и зависимостью от прогрессии наблюдали в нескольких видах рака: мочевого пузыря, головного мозга, предстательной железы, желудка и носоглотки, хотя всего анализировали более 20 видов опухолей (Dammann et.al., 2005; Fendri et al., 2009). Нами была устанавленна достоверная корреляция увеличения частоты метилирования промоторного района гена RASSF1A с увеличением стадии и степени анаплазии опухоли молочной железы, что согласуется с данными других авторов, установивших связь степени метилирования гена RASSF1A с плохим уровнем выживания пациентов при раке молочной железы (Karray-Chouayekh et al., 2009). Все это позволяет рассматривать ген RASSF1A как молекулярный маркер неблагоприятного прогноза РМЖ. В случае гена RAR-beta2 нами была выявлена зависимость частоты метилирования с прогрессией почечноклеточного рака и рака молочной железы, позволяющая включить ген RAR-beta2 в панель эпигенетических онкомаркеров для прогноза течения заболевания ПКР и РМЖ.

3.2. Связь метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B с прогрессией эпителиальных опухолей.

Рисунок 9. Корреляция частоты метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B с прогрессией рака молочной железы (РМЖ), почечноклеточного рака (ПКР) и рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

Для гена SEMA3B показано частое снижение уровня мРНК в опухолях за счет эпигенетического метилирования проксимального интронного CpG-островка гена (Angeloni et al., 2007; Hesson et al., 2007). Нами были исследованы корреляции частоты метилирования интронного и промоторного CpG-островков с прогрессией РМЖ, ПКР и НМКРЛ (рис.9). Установлено, что метилирование промоторного CpG-островка связано с развитием всех 3-х эпителиальных опухолей. С другой стороны, выявлены статистически достоверные корреляции частоты метилирования интронного CpG-островка с размером опухоли при раке молочной железы и прогрессией рака легкого (рис.9). Таким образом, метилирование дистального CpG-островка промоторной области гена SEMA3B может служить онкомаркером как для ранней диагностики опухолей, так и для прогноза и мониторинга течения ПКР, РМЖ и НМКРЛ, в то время как метилирование проксимального CpG-островка может являться маркером неблагоприятного прогноза только для НМКРЛ.

3.3. Связь метилирования CpG-островков генов RHOA, USP4 и GPX1 с прогрессией эпителиальных опухолей.

При анализе профиля метилирования генов RHOA и USP4 было выявлено деметилирование их промоторных районов при НМКРЛ, что указывает на онкогенный потенциал данных генов при этом виде рака. Выявленные корреляции уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с клинической стадией и степенью анаплазии немелкоклеточного рака легкого подтвердили онкогенный потенциал данных генов при НМКРЛ (рис. 10).

Рисунок 10. Корреляция уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с прогрессией рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

В одной из работ показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях МКРЛ и аденокарциномах легкого, а также онкогенная трансфор-мация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et al., 1995). Полученные нами данные по связи изменения метилирова-ния генов USP4 и RHOA согласуются с данными литературы об онкогенных функциях этих генов в опухолевой клетке, а связь изменения метилирования промоторных районов данных генов с прогрессией НМКРЛ, позволяют включить их в панель эпигенетических онкомаркеров для прогноза течения заболевания НМКРЛ. В случае гена GPX1 связи изменения метилирования с прогрессией опухолей, обнаружено не было.

3.4. Связь метилирования 3-х фрагментов CpG-островка гена NKIRAS1 с прогрессией эпителиальных опухолей.

Исходя из наших данных все три фрагмента CpG-островка гена NKIRAS1 деметилируются в опухолях молочной железы и немелкоклеточного рака легкого. Однако в случае РМЖ статистически достоверных корреляций частоты метилирования фрагментов CpG-островка с прогрессией данного вида опухоли не было обнаружено ни для одного из фрагментов.

В то время как для НМКРЛ такие корреляции были выявлены для первого и второго фрагментов (рис. 11). Для первого фрагмента установлена статистически маргинально-значимая корреляция уменьшения уровня метилирования с увеличением степени анаплазии. Для третьего фрагмента выявлена корреляция уменьшения уровня метилирования с клинической стадией, степенью анаплазии и размером опухоли, а также выявлено достоверное уменьшение метилирования третьего фрагмента с увеличением метастазирования в регионарные лимфатические узлы (рис.11), что позволяет использовать данный тест для диагностики и прогноза этого социально-опасного вида рака. Данные литературы по метилированию промоторной области данного гена отсутствуют.

Рисунок 11. Корреляция уровня метилирования 2-х фрагментов CpG-островка гена NKIRAS1 с прогрессией рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

4. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.

Одной из важных задач молекулярной медицины и практической онкологии является подбор системы из нескольких маркеров, оптимальных для диагностики и прогнозирования социально-опасных форм рака. К таким заболеваниям относятся рак легкого, который отличает высокая частота смертности, широко-распространенный рак молочной железы и почечно-клеточный рак, который часто не подлежит операбельному вмешательству. На основании полученных данных были выбраны гены наиболее полезные для диагностики, а именно, изменяющие статус метилирования при данном виде рака преимущественно в одну сторону, например, появление гиперметилирования, что характерно для генов-супрессоров, или наоборот, снятие метилирования (деметилирование), что характерно для онкогенов.

При ПКР применение 4-х генов-маркеров GPX1, RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 позволяет выявить метилирование хотя бы одного из этих маркеров в 13 из 19 случаев (рис. 12). Таким образом, можно говорить, что панель этих маркеров позволяет выявить опухоль в 68% случаев ПКР.

Рисунок 12. Схематическое изображение метилирования 4-х маркеров в 19 образцах ПКР. Черный кружок - CpG-динуклеотиды промоторной области гена метилированы в образце опухоли и не метилированны в соответствующей гистологически-нормальной ткани. Во всех остальных случаях не выявлено изменения статуса метилирования. Сверху показаны номера образцов, исследованных на изменение метилирования промоторных районов всех представленных слева генов. Для гена SEMA3B приведены данные для 2-х CpG-островков. Снизу показаны основные клинико-гистологические характеристики: стадия и степень анаплазии опухоли.

При РМЖ для 4-х генов получены репрезентативные данные для общей выборки из 45 образцов. Метилирование хотя бы в одном из этих 4-х маркеров (RASSF1А, SEMA3B, RAR-beta2 и USP4) выявлено в 36 из 45 случаев (рис.13), то есть этот набор маркеров позволяет выявить опухоль молочной железы в 80% случаев.

Рисунок 13. Схематическое изображение метилирования 4-х маркеров в 45 образцах РМЖ. Основные обозначения как на рисунке 12.

Анализ 5-ти генов при НМКРЛ: выявление гиперметилирования генов-супрессоров RASSF1A, SEMA3B и деметилирование предполагаемых потенциальных онкогенов RHOA, USP4 и NKIRAS1 в общей выборке образцов показал, что аномальное метилирование хотя бы одного из этих 5-ти маркеров выявляется в 25 из 29 случаев (рис. 14) т.е. в 89% случаев НМКРЛ. Таким образом, выбрана система маркеров (рис. 14) для диагностики НМКРЛ с частотой выявления 89%.

Рисунок 14. Схематическое изображение метилирования 5-ти маркеров в 28 образцах НМКРЛ. Белый кружок - CpG-динуклеотиды промоторной области гена метилированы в образце гистологически-нормальной ткани и не метилированны в образце опухоли. Основные обозначения как на рисунке 12.