Микробиологические свойства потенциальных патогенов человека рода Leptotrichia

21

Размещено на http://www.allbest.ru/

21

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Микробиологические свойства потенциальных патогенов человека рода Leptotrichia

03.02.03 - микробиология

Стрельникова Наталья Викторовна

Владивосток - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО «ДВГМУ Росздрава»)

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Кольцов Игорь Петрович Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Антонова Александра Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Тимченко Нелли Фёдоровна руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН кандидат медицинских наук, доцент

Диго Раиса Наумовна доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава», главный бактериолог Приморского края, г. Владивосток

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Микрофлора полости рта является высокочувствительной индикаторной системой и нарушение биологического равновесия между макроорганизмом и микроорганизмами нормальной микрофлоры может приводить к развитию патологических процессов. (Царёв В. Н., 2009; Ушаков Р. В., Царев В. Н., 2002; Кондрашова З. Н., 1996; Борисов Л. Б., Фрейдлин И. С., 1987). Одной из актуальных проблем современной стоматологии продолжают оставаться воспалительные заболевания слизистых оболочек полости рта (Боровский Е. В., 2001; Engelkirk P. G. et al 1992). Этиологическими агентами этих процессов являются условно-патогенные микроорганизмы, большинство которых - представители нормальной микрофлоры организма человека (Воробьев А. А., 1994; Кочемасова З. Н. и соавт. 1988 г.; Колесов А. П. и соавт., 1989). Микроорганизмы полости рта становятся источником потенциально патогенных возбудителей кариеса, гингивита, стоматита, острых воспалительных заболеваний слизистых полости рта (Царёв В. Н., 2007; Борисов Л. Б., Фрейдлин И. С., 1987). Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы могут способствовать изменению защитных сил организма и приводить к возникновению воспалительных заболеваний полости рта (Бухарин О.В. 2006; Кулагина Г. М. 2004; Бухарин О. В., 2002; Мороз А. Ф. 2001).

Актуальность настоящей работы определяется распространием в регионе Хабаровского края РФ воспалительных заболеваний слизистых оболочек полости рта /СОПР/, вызванных Leptotrichia buccalis и недостаточной изученностью этих микроорганизмов. Рост числа больных, длительность заболевания, устойчивость к терапии, требуют детального изучения биологических особенностей бактерий рода Leptotrichia, подтверждения их этиологической значимости в развитии лептотрихиозов как локальной Leptotrichia-инфекции. Анализ литературы показал, что отсутствуют данные о частоте выделения возбудителя лептотрихиоза, нет четкого критерия, указывающего на диагноз лептотрихиоз слизистых оболочек полости рта. В практических лабораториях края не ведутся бактериологические исследования лептотрихиозов в связи с отсутствием алгоритма диагностики заболевания. Биологические особенности рода Leptotrichia в регионе изучены мало, данных о колонизации полости рта, факторах патогенности микроорганизмов, изучение чувствительности к антибиотикам и антисептикам не обнаружено.

Данные об иммунобиологических изменениях при лептотрихиозе слизистых оболочек полости рта /ЛСОПР/ противоречивы.

Из вышесказанного следует, что исследование проблемы лептотрихиоза в нашем регионе, состояния иммунного статуса больных ЛСОПР, и, прежде всего, биологических характеристик Leptotrichia buccalis, является высоко значимым и актуальным. Поэтому мы сочли целесообразным исследовать штаммы Leptotrichia buccalis, циркулирующие в регионе Хабаровского края.

Цель исследования состояла в углублённом изучении биологических особенностей потенциальных патогенов рода Leptotrichia, выявлении их этиологической значимости в патологии полости рта.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи.

Задачи исследования:

1. Выявить роль представителей рода Leptotrichia в патологии полости рта с учётом их естественного ресурса и таксономии. Исследовать частоту встречаемости лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта, выяснить взаимосвязь Leptotrichia buccalis со степенью активности кариеса зубов у детей и патологией желудочно-кишечного такта.

2. Изучить этапы колонизации анаэробами слизистых оболочек полости рта у детей, распространённость Leptotrichia buccalis среди населения региона, разработать способ культивирования Leptotrichia.

3. Исследовать роль иммунной системы в реализации механизмов колонизации и распространённости Leptotrichia в биотопе полости рта.

4. Определить фенотипический профиль Leptotrichia buccalis, факторы патогенности, персистентности, чувствительность к антимикробным химиопрепаратам.

Научная новизна работы

1. Впервые формально обосновано употребление термина «лептотрихиоз» слизистых оболочек полости рта для определения локальных Leptotrichia-инфекций.

2. Исследованы этапы заселения Leptotrichia и другими анаэробами полости рта новорожденных и детей в регионе, впервые изучена и доказана всеобщая распространённость Leptotrichia buccalis среди населения Хабаровского края.

3. Разработан новый способ культивирования Leptotrichia buccalis на искусственной питательной среде «Уриселект».

4. Выделены региональные штаммы Leptotrichia buccalis, изучены их факторы персистенции, адгезивный потенциал, исследована продукция ими в-лактамаз. Определена региональная антибиотикограмма лептотрихий. Показано, что высокая биологическая пластичность микроорганизмов, колонизирующих слизистые оболочки, и высокая чувствительность слизистых к воздействию микроорганизмов позволяют использовать изменения в их состоянии как критерий оценки риска заболевания лептотрихиозом.

5. Выявлена взаимосвязь Leptotrichia buccalis с риском развития суб/декомпенсированной степеней активности кариеса зубов у детей и повышением риска развития патологии желудочно-кишечного тракта: гастродуоденита, язвенной болезни желудка и 12-ти перстной кишки.

6. Проведено сравнительное изучение факторов патогенности (адгезивной, антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой активности) у штаммов Leptotrichia buccalis, выделенных в виде монокультур и ассоциаций, при исследовании микробиоценоза полости рта у больных ЛСОПР.

7. Выявленные изменения иммунного статуса у больных лептотрихиозами позволяют оценить реализацию механизмов колонизации и распространённости лептотрихий в биотопе полости рта, обосновать критерии развития лептотрихиоза, прогнозирования рецидивирующих форм заболевания.

Практическая значимость:

Результаты исследований позволили обосновать необходимость микробиологического исследования микрофлоры полости рта для выявления ранних нарушений микробиоценоза организма в условиях развития лептотрихиоза. В ходе проведенных исследований от больных лептотрихиозами слизистых оболочек полости рта выделены региональные изоляты бактерий Leptotrichia buccalis, изучены их морфологические, культуральные, колонизационные свойства, дана оценка чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам.

- Доказана этиологическая роль бактерий Leptotrichia buccalis как возбудителей локальных Leptotrichia-инфекций - лептотрихиозов СОПР.

- Обосновано использование и внедрены в работу учреждений Министерства здравоохранения края термин Leptotrichia buccalis v.s. Leptothrix buccalis и термин «лептотрихиоз» v.s. «лептотрихоз».

- Изучение биологических свойств Leptotrichia buccalis можно использовать для обнаружения ранних признаков изменения защитных сил организма, оценки степени тяжести поражения слизистых при лептотрихиозах, риска перехода ЛСОПР в хроническую форму и коррекции выявленных нарушений у больных.

- Дана комплексная оценка изменения показателей иммунного статуса при острых и хронических формах лептотрихиозов СОПР. Полученные результаты являются основанием для включения иммунобиологических критериев в прогнозирование хронизации инфекционного процесса и/или развития лептотрихиозов у иммунокомпрометированных лиц.

- Разработаны методические рекомендации по оценке адгезивной активности лептотрихий, которые внедрены в работу ГУЗ Хабаровского края и помогают в диагностике лептотрихиозов СОПР.

- Зарегистрированы 2 заявки на изобретение в ФИПС: «Способ лечения хронических рецидивирующих воспалительных заболеваний, вызванных лептотрихиями», № 200913268/14 (045691) от 21.08.2009 г. и ««Способ культивирования Leptotrichia на искусственной питательной среде «Уриселект», № 2010110394 (014610) от 18.03.2010 года, 7 рационализаторских предложений.

- Результаты научно-исследовательской работы внедрены в работу 8 государственных учреждений Министерства здравоохранения Хабаровского края, Военного госпиталя МВД РФ г. Хабаровска, ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН НИИ Охраны материнства и детства.

- Результаты исследовательской работы внедрены в учебный процесс кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, стоматологии детского возраста, инфекционных болезней и эпидемиологии ДВГМУ, включены в программу усовершенствования врачей-бактериологов ФПК и ППС ДВГМУ, ГУЗ Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения Хабаровского края в качестве лекционного и дополнительного учебно-методического материала.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены на различных научных форумах международного, всероссийского, межрегионального уровня: 11-ом Международном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии-России и стран Северо-восточной Азии (Ниигата, Япония, 2004), 12-ом Международном симпозиуме фонда медицинского обмена Японии-России (Красноярск, 2005), научно-практической конференции с международным участием, посвященной 70-летию НГМА «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2005), межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию стоматологической службы республики Саха (Якутия) «Актуальные проблемы и перспективы развития стоматологической службы» (Якутск, 2005), областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской стоматологии в Амурской области» (Благовещенск, 2006), всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», посвящённой 55-летию Читинской гос. медицинской академии (Чита, 2008), межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвящённой 50-летию стоматологического факультета Кемеровской государственной медицинской академии, (Кемерово, 2009), научно-практической конференции «Актуальные проблемы стоматологии», посвящённой 30-летию стоматологического факультета Дальневосточного государственного медицинского университета (Хабаровск, 2009), XI международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2009).

Результаты диссертационного исследования обсуждены на заседаниях общества бактериологов Хабаровского края 2005-2009 г.г., на расширенном межкафедральном заседании кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, инфекционных болезней и эпидемиологии, детских инфекционных болезней, стоматологии детского возраста, нормальной физиологии, гистологии, патологической физиологии, ДВГМУ, ЦНИЛ ДВГМУ, ФГУН «Хабаровский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора», ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН НИИ Охраны материнства и детства, 12 мая 2010 года, протокол № 5.

Личный вклад автора. Автором осуществлена систематизация и анализ материалов по частоте выявляемости и структуре лептотрихиозов. Лично автором проведено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам штаммов лептотрихий. При непосредственном участии автора подготовлены и проведены иммунологические исследования, все методы статистической обработки выполнены автором лично. Подготовлены публикации, рационализаторские предложения и заявки на изобретения. Доля участия в накоплении материала составляет 85%, в обобщении материала - до 100%.

Протокол научно-плановой комиссии № 8 от 18 мая 2004 года.

Номер государственной регистрации темы: 01.2.007 00903.

Публикации:

По теме настоящей диссертации опубликовано 16 научных статей, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 2 методических пособия.

Объём и структура диссертации:

Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 23 таблицами и 18 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций для внедрения результатов работы в медицинскую науку и практику здравоохранения, учебный процесс и приложений. Список литературы содержит 263 источника, из которых 90 отечественных и 173 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Leptotrichia buccalis являются потенциальными патогенами человека, вызывающими лептотрихиозы слизистых оболочек полости рта. Заселение представителями рода Leptotrichia полости рта у детей в основном происходит в период после прорезывания зубов. Leptotrichia можно отнести к маркерным микроорганизмам для выявления риска развития суб/декомпенсированных форм кариеса зубов у детей и развития гастродуоденита и язвенной болезни желудка и 12-ти перстной кишки.

2. Leptotrichia buccalis из числа региональных изолятов обладают выраженным патогенным потенциалом: ведущими факторами персистенции, адгезивной и коадгезивной активностью. Leptotrichia чувствительны к в-лактамным антибиотикам, цефалоспоринам, метронидазолу, проявляют устойчивость к аминогликозидам, фторхинолонам, макролидам, продуцируют бета-лактамазы.

3. Частота встречаемости лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта за многолетний период увеличилась, возрастает число микст-инфекций и хронических форм. Возрастное распределение - лептотрихиозы СОПР характерны для лиц старше 46 лет и детей 1-3 лет, сезонность весенне-летняя.

4. Иммунобиологические изменения показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета могут стать достоверными критериями прогноза развития лептотрихиоза и/или перехода заболевания в хроническую форму.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, объём и методы исследования. Исследования выполнены в 2003-2009 г.г. на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава (при консультативной помощи руководителя клинико-диагностической лаборатории Хабаровского филиала ДНЦ ФПД Сибирского отделения РАМН НИИ Охраны материнства и детства, ведущего научного сотрудника, к.м.н, Г. Н. Холодок). Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения комиссии по биомедицинской этике ГОУ ВПО «ДВГМУ Росздрава» (протокол № 16 от 25.05.2004 г.)

Контингент обследованных был разделен на 4 группы по характеру выполняемой работы. В первую группу вошли 680 взрослых и 420 детей населения г. Хабаровска и Хабаровского края (жители города и села, русские и представители этнического населения - нанайцы) для исследования распространённости лептотрихий среди населения Хабаровского края. Вторую группу составили 99 детей от 14 дней до 3 лет (изучение этапов колонизации полости рта анаэробами), в третью группу вошли 96 детей 3, 6 и 12 лет по рекомендации ВОЗ для исследования кариеса зубов. Четвёртую группу составили пациенты острыми и хроническими формами лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта, 116 человек. Среди осмотренных лиц преобладали женщины в возрасте от 46 до 69 лет - 67,5%. Подбор групп по возрасту, национальности осуществлен с учетом репрезентативности выборки. Углубленное стоматологическое обследование с использованием инструментальных, лабораторных методов исследований проведены совместно с профессором кафедры стоматологии детского возраста, д.м.н. Антоновой А.А.

Материалом для микробиологических исследований были соскобы с корня языка, содержимое десневого желобка, мазки со слизистой полости рта, слюна, ротовая жидкость. Изучение микрофлоры полости рта (в 1-й группе - 1080, 2-й группе - 99, в3-ей группе - 96 человек, в 4-й группе - 116 человек) проводилось качественными и количественными методами с использованием среды Уриселект, кровяного агара, желточно-солевого агара, среды Эндо, энтеро-бактагар (Лабинская А. С., 2004). Исследование микрофлоры полости рта проводилось в соответствии с приказом МЗ СССР №535 от 22.04.85г. «Об унификации микробиологических методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях». Состояние микрофлоры полости рта оценивали качественными и количественными методами (Р.В. Эпштейн-Литвак, 1997).

Количество микроорганизмов определяли в 1 г исследуемого материала, выражали в десятичных логарифмах (lg КОЕ/г). Идентификацию микроорганизмов проводили по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам с применением тест-систем (Lachema, Чехия и ПБДЭ, ПБДС, Н. Новгород; Candi Select, Уриселект - фирмы «Biorad»). Для изучения факторов патогенности использованы по 28 штаммов бактерий Leptotrichia spp., Streptococcus spp., Staphylococcus aureus и дрожжеподобных грибов рода Candida spp., выделенных в виде монокультур и в ассоциации друг с другом.

Для выявления адгезивной способности штаммов лептотрихий, была изучена их гистадгезивная активность. Количественную оценку гистадгезивной активности и коадгезивной активности в естественных условиях проводили в соответствии с методами, разработанными авторским коллективом кафедры (Н.В. Стрельникова с соавт., 2009-10 г.г.) Для определения факторов, способствующих сохранению жизнеспособности лептотрихий, стафилококков, стрептококков и дрожжеподобных грибов рода Candida в полости рта, проводили изучение свойств персистенции: антилизоцимную (АЛА) и антикомплементарную активность (АКА), антиинтерфероновую (АИА) по методу «отсроченного антагонизма» (Бухарин О. В. и соавт., 1986 г., 1992 г., 1996 г.)

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ EXCELL в операционной системе Windows 2003. Использовались методы параметрической статистики (средняя арифметическая и её стандартная ошибка). Достоверность различий между сравниваемыми средними значениями в основной и контрольной группах устанавливали критерием Стьюдента (Медик В.А. с соавт., 2001). Основные направления, методы и объём исследования изложены в таблице 1.

leptotrichia патоген кариес

Таблица 1

Направления, методы и объём исследования

№ п/п	Направления исследований	Методы исследований	Объём исследован-ного материала
1	2	3	4
1.	Анализ научных литературных источников	Контент-анализ, сравнительный анализ	263 литературных источника: 90 отечественных 173 иностранных
2.	Эпидемиологич. статистика	Ретроспективный и оперативный эпидемиологический стат. анализ	Все данные
3.	Клинико-анамнестический анализ	1.Анализ данных ККВД г. Хабаровска по заболеваемости лептотрихиозом. 2. Изучение амбулаторных карт пациентов ККВД, поликлиники ДВГМУ «Унистом», МУЗ Детской поликлиники № 17 3. Опрос и обследование больных ЛСОПР 4. Опрос и обследование детей на носительство Leptotrichia. 5. Опрос и обследование взрослых на носительство Leptotrichia	Журналы лабораторного исследования 1999-2008 г.г. 224 карты 118 карт 243 карты 116 человек 420 детей 680 человек
4.	Микробиологические исследования	1. Взятие клинического материала (соскоб с корня языка) у всех обследуемых групп. 2.Микроскопия мазка с окраской м. Грама 3.Получение чистой культуры Leptotrichia 4.Метод идентификации анаэробов микротест-системами ANAEROtest 23 и в автоматическом режиме на баканализаторе АТВ с использованием тест-систем API 20А (производства компании «Био-Мерье», Франция) 4.Получение чистых культур Staphylococcus, Streptococcus, Candida, et.сtr. из микробных ассоциаций c Leptotrichia 5.Исследование микробного пейзажа корня языка, десневого желобка, слюны бактериологическим методом на стандартных средах 6. Экспресс-определение в-лактамазы (пенициллиназы) йодометрическим методом у штаммов Leptotrichia	1080 проб 1080 проб 334 пробы, 28 чистых культур 28 проб 28 проб 334 пробы, 108 чистых культур из ассоциаций 334 пробы 28 проб Leptotrichia + 102 пробы ассоциант.
5.	Оценка иммунобиологического статуса	1. Определение уровня клеточного иммунитета - содержание лейкоцитов, лимфоцитов и их субпопуляций: CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, методом лазерной проточной цитометрии; оценка ИРИ, ЦИК 2. Количественное определение IgA, IgM, IgG сыворотки крови м. радиальной иммунодиффузии в агаровом геле по G. Manchini et al. 1963, с исп. наборов моноспецифических антисывороток к Ig 3. Определение уровня иммуноглобулинов IgA, sIgA, IgM, IgG в слюне методом ИФА (микропланшетный фотометр Multiskan пр-ва Thermo Scientific) 4. Определение фагоцитарной активности (ФАН) с инертными частицами латекса размером 1,1м (С.Г.Потапова и соавт. 1977), спонтанный/индуциров. зимозаном тест 5. Определения уровня лизоцима слюны нефелометрическим методом по Дорофейчук 1968 в модификации П.Г. Сторожук с соавт., 1980	78 человек / опыт 67 человек /контроль 99 проб 99 проб 99 проб 78 человек / опыт 67 человек /контроль
8.	Исследование чувствительности к антибиотикам	Диско - диффузионный метод, метод серийных разведений (определение МПК) по МУК 4.2.1890-04 Минздрава России, 2004 г. Автоматическое определение - тест-системы ANA32 на АТВ	28 проб
9.	Определение резистентности Leptotrichia к антисептическим растворам	Определение бактерицидной активности антисептических растворов: 1. Хлоргесксидина биглюконата 0,05 % 2. Мирамистина 0,01 % 3. Коллоидного раствора серебра «Сильверия» 0,05 г/л 4. Стоматофит /Польша/, in vitro и in vivo по методике НИИЭМ им. Пастера, 2007	28 проб/ 90 пациентов
10.	Статистическая обработка полученных данных	Методы описательной и параметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы Statistica 6.0 (средняя арифметическая М, ошибка m, доверительный коэффициент t, коэффициент Пирсона r, критерий ч2).	Все данные

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Колонизация полости рта анаэробами у детей начинается в раннем возрасте и в основном происходит после прорезывания резцов и моляров, окончательно формируя биотоп к 2,5 годам. Тесная корреляционная связь (r=0,9) обнаружена между заболеваниями ЖКТ у ближайших родственников, грудным вскармливанием (r=0,8) и ранней колонизацией лептотрихиями биотопа ротовой полости ребёнка. Распространённость лептотрихий среди населения региона всеобщая и составляет в среднем 95%. Бактериальная плотность заселения лептотрихиями минимальная в возрасте 2-6 лет и увеличивается к 25 годам, достигая максимума в 46 лет - 0,105±0,111 lg КОЕ/ед. суб. и 3,833±0,042 lg КОЕ/ед. суб., соответственно (p<0,01).

Рис. 1. Количество Leptotrichia на поверхности корня языка в различных социально-демографических группах населения Хабаровского края (lg КОЕ/ед.суб.).

Изучен фенотипический профиль лептотрихий. Выявлено 5 основных морфологических вариантов бактерий и их встречаемость у больных острым и хроническим лептотрихиозом, суб/декомпенсированными формами кариеса зубов, у больных гастродуоденитом и язвенной болезнью с высокой степенью корреляционной связи для различных патологических состояний. В одном биотопе одновременно, как правило, содержатся от 2 до 4 морфологических вариантов Leptotrichia, таких образцов 85%. Содержание различных морфоваров в чистой культуре ограничено одним или двумя типами. Морфовары представлены в таблице 2.

Таблица 2

Морфологические варианты Leptotrichia

Характеристика морфоваров Leptotrichia	Длина микробной клетки, мкм
1. одиночные палочки	до 8-10
2. классическая пара палочек	10-15
3. удлинённые палочки	20-25
4. филаментоидные палочки	30-50
5. нити/филаменты	50-100 и более

Изменение морфологии Leptotrichia в зависимости от патологических проявлений отражено в таблице 3.

Таблица 3

Морфология Leptotrichia и некоторые патологические состояния

Патологические состояния	Морфологические варианты Leptotrichia
	1	2	3	4	5
Лептотрихиоз СОПР, острое течение	13%	32%	46%	7%	3%
Лептотрихиоз СОПР, хроническое течение	42%	1%	41%	15%	2%
Патология желудочно- кишечного тракта	8%	13%	26%	43%	10%
Субкомпенсированная степень кариеса зубов	19%	16%	41%	14%	10%
Декомпенсированная степень кариеса зубов	12%	19%	47%	13%	9%

Таким образом, имеется зависимость между морфологией микроорганизмов и некоторыми заболеваниями человека, вероятно, обусловленная изменением биологических свойств Leptotrichia в процессе роста. При остром лептотрихиозе СОПР в 46% встречаются удлинённые палочки, при хроническом процессе преобладают одиночные палочки, до 42%, вероятно, по причине активного процесса размножения микроорганизмов в условиях снижения иммунной резистентности макроорганизма. Наряду с этим, количество удлинённых форм палочек не менее значительно и составляет 41%. Доля филаментов Leptotrichia пятого морфовара при патологии ЖКТ и суб/декомпенсированной формах кариеса зубов составила 10%, 10% и 9% соответственно, что может доказывать взаимообусловленность патогенеза этих состояний и приобретение нитевидными формами Leptotrichia свойств, которые способствуют развитию и усугублению процесса.

Изоляты от больных лептотрихиозом СОПР обладают выраженным персистентным потенциалом в сравнении с группами здоровых.

Таблица 4

Антилизоцимная активность (АЛА) микроорганизмов полости рта у здоровых и больных лептотрихиозом СОПР

Микроорганизмы	АЛА, мкг/мл
	Корень языка	Слюна**
	здоровые	больные	здоровые	больные
Лептотрихии	1,83±0,21	3,3±0,6*	1,0± 0,26	2,4± 0,22*
Стафилококки	0,93±0,73	3,98± 0,68*	1,8± 0,21	3,2± 0,28*
Стрептококки	2,14±0,22	3,05± 0,89	1,1±0,06	2,94±0,74*
Кандиды	1,03± 0,51	2,83± 0,46*	-	-

Примечания: * разность показателей достоверна (по сравнению с уровнем в группе здоровых), p<0,01; **данные АЛА симбионтов двух биотопов достоверно не отличались между собой.

Полученные данные свидетельствуют, что в группе больных лептотрихиозом СОПР преобладают микроорганизмы-симбионты с АЛА, выраженной примерно в одинаковой степени, от 2,83 до 3,98 мкг/мл, следовательно, происходит селективный отбор штаммов, обладающих антилизоцимной активностью, необходимой для длительного переживания в изучаемой экологической нише. Обращает внимание, что в опытной группе в среднем 99,7% исследованных симбионтов обладают АЛА, что может свидетельствовать о возможном обмене генетической информацией между микроорганизмами и постоянном поддержании АЛА на высоком уровне в оромикробиоценозе.

При уровне АЛА у Leptotrichia 3,5 и более мкг/мл отмечается высокая корреляционная связь (r=0,83) с рецидивным процессом хронических форм лептотрихиоза СОПР. Следовательно, обострения ЛСОПР можно прогнозировать при антилизоцимной активности Leptotrichia выше, чем 3,5 мкг/мл. Таким образом, установленная высокая АЛА у микроорганизмов, выделенных с корня языка, свидетельствует о необходимости данного свойства для обеспечения персистенции в биотопе.

Наряду с активностью Leptotrichia в процессе коадгезии с комменсалами орального биоценоза, оценивали индекс интенсивности коадгезии /ИИК по количеству прикрепившихся к поверхности палочек Leptotrichia кокков и более мелких палочек. Как демонстрируют данные таблицы 5, ИИК приобретает важное прогностическое значение для всех обследованных нами категорий.

Таблица 5

Естественная коадгезивная активность Leptotrichia-ИИК у здоровых и больных при различных патологических состояниях (M±m)

Категории	ИИК (ед.)
	опыт	сравнение	контроль	р /группы опыт-контроль/
Лептотрихиозы СОПР	20±0,6	13,9±2,4**	3,1±0,1	<0,001
Кариес твёрдых тканей зубов	39±3,4	28,4±2,4**	12,2±2,1	<0,01
Язвенная болезнь желудка	18,9±1,1	17,6±1,7**	4,01±0,2	<0,001
Гастродуодениты/гастриты	21,4±1.6	22,8±1,2**	3,9±0,5	<0,001

Примечания: * разность показателей достоверна (по сравнению с уровнем в группе «сравнение»), p<0,01; **разность показателей достоверна в группах «сравнение» (по сравнению с уровнем в группе «контроль»), p<0,01.

Наибольшее количество коадгезированных симбионтов полости рта зарегистрировано при декомпенсированной и субкомпенсированной форме кариеса зубов у детей, 39±3,4 и 28,4±2,4 соответственно, что соответствует очень высокому уровню интенсивности коадгезии.

Как видно из представленных результатов, для лептотрихиозов СОПР характерны средний и высокий ИИК: 13,9±2,4 ед. для острых форм инфекции и 20±0,6 ед. для рецидивирующих форм ЛСОПР. В сравнении с группой здоровых, при лептотрихиозном поражении СОПР наблюдается увеличение ИИК в 6 раз (<0,001). Высокий уровень ИИК Leptotrichia в полости рта зарегистрирован при язвенной болезни желудка, 18,9±1,1 ед. и 17,6±1,7 ед. соответственно. Для гастродуоденитов также характерен очень высокий уровень ИИК в группах с гастродуоденитом и гастритом - 21,4±1.6 ед. и 22,8±1,2 ед. соответственно. Рост интенсивности отмечен более чем в 5 раз (<0,001) в сравнении с группой контроля.

Исследовалась заболеваемость лептотрихиозами, выявлена весенне-летняя сезонность, возрастное распределение среди лиц старше 46 лет, и детей в возрасте от 1 до 3 лет. Сравнительная характеристика возрастных групп больных ЛСОПР представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Возрастное распределение показателя встречаемости лептотрихиозов СОПР среди населения г. Хабаровска, 1999-2008 г.г. (на 100 000 населения)

Исследуя основные закономерности развития лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта, мы определили максимальный показатель выявляемости 61,35 на 100 тыс. населения, который зафиксирован методом активной регистрации в 2005 году. Минимальный показатель встречаемости зафиксирован в 1999 году на уровне 26,51 на 100 тыс. населения. В целом тенденцию можно охарактеризовать как повышение со среднегодовым темпом 2,55%. Динамика выявляемости имеет волнообразный характер, периоды с 1999 по 2003 г.г., 2004-2005 г.г. и с 2007 года по настоящее время можно описать как многолетние подъёмы заболеваемости, а 2003-2004 г.г. и 2005-2007 г.г. как периоды спада. Несмотря на временные понижения уровня показателей встречаемости, наблюдалась общая тенденция к росту показателей лептотрихиозов СОПР, увеличению числа хронических форм и микст-инфекций (лептотрихии+кандиды) за многолетний период.

Проведено комплексное исследование иммунного статуса больных лептотрихиозами, показателей общего и местного иммунитета, активности фагоцитоза и лизоцима слюны, количества ЦИК, оценка резерва фагоцитоза. Выявлены иммунобиологические изменения у больных хроническими и острыми формами ЛСОПР: снижение уровня субпопуляций лимфоцитов CD3⁺, СD4⁺, СD19⁺, и повышение уровня СD8⁺, CD16⁺, что отражено в рисунке 3.

Рис. 3. Динамика показателей основных субпопуляций лимфоцитов крови у больных острыми и хроническими лептотрихиозами слизистых оболочек полости рта

Достоверно снижаются показатели уровня IgA сыворотки и SIgA в ротовой жидкости, активность лизоцима слюны и увеличиваются показатели ЦИК, что может служить критериями прогноза и риска развития ХЛСОПР.

ВЫВОДЫ

Представители рода Leptotrichia являются потенциальными патогенами человека, этиологическим фактором лептотрихиозов слизистых оболочек полости рта. Выявлена очень тесная взаимосвязь между обсеменённостью биотопа полости рта Leptotrichia buccalis, а также высокой интенсивностью коадгезии, с развитием суб/декомпенсированных форм кариеса и патологии ЖКТ. Заселение полости рта Leptotrichia у детей начинается в период новорожденности, наиболее активная колонизация зарегистрирована после прорезывания первых зубов, к 2,5 годам биотоп полости рта колонизирован Leptotrichia.

Для региона характерно всеобщее - 95% распространение Leptotrichia среди взрослого и детского населения, в городских и сельских условиях проживания, как у лиц русской национальности, так и среди этнического населения. Лептотрихиозы СОПР характеризуются постепенным увеличением частоты встречаемости, ростом микст-инфекций и хронических форм лептотрихиозов. Преимущественно болеют взрослые старше 46 лет и дети 1-3 лет. Характерна весенне-летняя сезонность с пиком в мае-июле. У больных лептотрихиозом СОПР зарегистрирован комплекс иммунобиологических изменений: снижение уровня лимфоцитов периферической крови CD3⁺, СD4⁺, СD19⁺, повышение уровня СD8⁺, CD16⁺ лимфоцитов, снижение содержание IgA сыворотки и SIgA в ротовой жидкости, снижение уровня активности лизоцима слюны, увеличение показателя ЦИК, снижение кислородного резерва нейтрофилов в сравнении с группой здоровых.

Leptotrichia buccalis имеют оригинальный морфологический профиль, который изменяется в зависимости от условий существования и культивирования. Выделено 5 морфологических вариантов Leptotrichia. Персистентный потенциал Leptotrichia определяется АЛА, АИА, АКА, активностью адгезии к тканям и в микробных ассоциациях. Leptotrichia имеют выраженную активность и интенсивность коадгезии. Предложен новый метод культивирования Leptotrichia buccalis на питательной среде «Уриселект».

Leptotrichia buccalis - прихотливые бактерии, в первой изоляции анаэробы или микроаэрофилы, при пересевах 85% изолятов Leptotrichia аэротолерантны, 15% сохраняют анаэробность. Лептотрихии проявляют чувствительность к большинству антимикробиотиков, действующих на клеточную стенку бактерий, резистентны к аминогликозидам, фторхинолонам, макролидам. Высокочувствительны к действию антисептических препаратов в эксперименте in vitro. In vivo эффективен коллоидный раствор серебра и «Стоматофит».

Практические рекомендации:

1. В связи с уточнением таксономического положения Leptotrichia предлагается ввести в медицинскую терминологию корректные термины Leptotrichia buccalis как этиологический фактор воспалительных процессов полости рта, вызванный лептотрихиями и «лептотрихиоз», отражающий наименование заболевания. Не использовать устаревшие термины Leptothrix buccalis и «лептотрихоз» как утратившие значение и в связи с отсутствием связи между патологией человека и свободноживущими видами лептотриксов.

2. Выявленные особенности возрастной колонизации, распространённости лептотрихиозов, особенности иммунного статуса, взаимосвязи с уровнем гигиены и степенью активности кариеса и заболеваний желудочно-кишечного тракта предлагаются использовать в муниципальных учреждениях здравоохранения ДВ региона для планирования коррекции оказания медицинской помощи.

3. Рекомендовать для широкого применения с целью микробиологической диагностики заболевания применение коммерческой среды «Уриселект», что способствует стандартизации условий культивирования в практических бактериологических лабораториях.

4. Информационное письмо и методические рекомендации по объёму, стандартам диагностики возбудителя будут способствовать повышению эффективности специализированной медицинской помощи населению Хабаровского края.

В практику здравоохранения:

Рекомендовать при подозрении на лептотрихиоз СОПР для бактериологического исследования биотопов полости рта использовать исследование соскобов с корня языка и/или отделяемого слизистых с посевом на пластинчатую среду «Уриселект» и созданием как анаэробных, так и микроаэрофильных условий культивирования для первичного посева, аэробных условий для пересевов.

Cпособ подтверждения диагноза острый лептотрихиоз СОПР с использованием микробиологических критериев: микроскопия мазка - не менее 15-20 филаментоидных форм Leptotrichia во всех полях зрения, наличие большого количества слущенного эпителия, гистадгезивная активность (ИГА=3 и более ед.), коадгезивная активность (ИАК=40% и более, ИИК=7 и более ед.), выделение чистой культуры Leptotrichia на искусственной питательной среде с идентификацией и определением чувствительности к антибиотикам; лабораторный критерий - лейкоцитоз и лимфоцитоз в периферической крови.

Рекомендовать способ подтверждения диагноза хронический лептотрихиоз СОПР с использованием микробиологических критериев: микроскопия мазка - не менее 15-20 одиночных палочек и филаментоидных форм Leptotrichia во всех полях зрения, наличие слущенного эпителия, гистадгезивная активность (ИГА=6 и более ед.), коадгезивная активность (ИАК=80% и более, ИИК=15 и более ед.), выделение чистой культуры Leptotrichia на искусственной питательной среде с идентификацией и определением чувствительности к антибиотикам; лабораторный критерий - лейкопения и лимфоцитоз в периферической крови.

В качестве этиотропной терапии как препарат выбора рекомендовать цефалоспорины III поколения. Использование ампициллина, метронидазола и препаратов этих групп следует подтверждать антибиотикограммой для исключения неэффективности терапии устойчивых штаммов.

Методические рекомендации: 1) методические рекомендации для специалистов здравоохранения «Оценка адгезивной и коадгезивной активности Leptotrichia» 2) информационное письмо для врачей, студентов, аспирантов «Leptotrichia & Leptothrix».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Стрельникова, Н. В. Таксономическое положение Leptotrichia и Leptothrix / Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, Л. Я. Нестеренко // Дальневосточный мед. журнал. - (Хабаровск). - 2003. - № 2. - С. 56 - 58.

2. Стрельникова, Н. В. О Leptotrichia buccalis - комменсалах полости рта / Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, А. А. Антонова // Дальневосточный мед. журнал. - (Хабаровск). - 2004. - № 4. - С. 99 - 101.

3. Антонова, А. А. Иммунологические показатели полости рта у детей различных национальностей / А. А. Антонова, Н. В. Стрельникова // Дальневосточный мед. журнал. - (Хабаровск). - 2006. - № 3. - С. 104 - 106.

4. Strelnikova, N. V. To the problem of Leptotrichiosis of oral mucous membrane / N. V. Strelnikova, I. P. Koltsov, A. A. Antonova // 2004 JRME NIIGATA'04 The 11^th International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange 2004: PROGRAM -Abstract (II) Suppl. - Niigata (Japan), 2004. - P. 76.

5. Strelnikova, N. V. Inflammatory process of pharynx and tonsils in children of 2-8 years old induced by Leptotrichia buccalis in association with other microorganisms / N. V. Strelnikova, S. S. Nosov, I. P. Koltsov // 2005 JRME KRASNOYARSK'05 The 12^th International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange 2005: PROGRAM & Abstract. - Krasnoyarsk (Russia), 2005. - P. 325-326.

6. Стрельникова, Н. В. Активность лизоцима слюны и его взаимосвязь с интенсивностью кариеса и гигиеническим состоянием полости рта у детей / Е. В. Боровских, Н. В. Стрельникова, К. И. Елистратов, Н. С. Шпак // Актуальные проблемы и перспективы развития стоматологической службы: сборник науч. статей межрегион. науч.-практич. конф., посв. 85-лет. стоматол. службы республики Саха (Якутия).-Якутск, 2005.- С.280-283.

7. Стрельникова, Н. В. К вопросу об эпидемиологической распространенности лептотрихий среди населения г. Хабаровска и Хабаровского района /Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, А. А. Антонова, Л. Я. Нестеренко // Медицина и образование в XXI веке: тезисы докл. ежегодной науч.-практич. конф. с междунар. участием, посвящ. 70-летию НГМА. - Новосибирск, 2005. - С.359-362.

8. Стрельникова, Н. В. Активность лизоцима слюны у детей, его корреляция с активностью степени кариесопораженности и сравнительная характеристика методов исследования / Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, С. П. Шпак // Современные стоматологические технологии: материалы 7-й науч.-практ. конф. - Барнаул, 2005. - С. 276-278.

9. Сувырина, М. Б. Воспалительные заболевания пародонта и Leptotrichia buccalis / М. Б. Сувырина, Н. В. Стрельникова, М. А. Уманская и др. // Актуальные вопросы детской стоматологии в Амурской области: материалы областной науч.-практич. конф.- Благовещенск, 2006. - С. 103.

10. Аршинский, М. И. Эпидемиологические особенности лептотрихиозных поражений слизистых оболочек полости рта и кожи в Хабаровском крае / М. И. Аршинский, Н. В. Стрельникова, Н. В. Милая // Актуальные вопросы дерматологии и венерологии: науч.-практич. конф. - Владивосток, 2006. - С. 46-47.

11. Стрельникова, Н. В. Leptotrichia buccalis как фактор риска развития воспалительных процессов в полости рта у детей / Н. В. Стрельникова, А. А. Антонова, Н. В. Милая// Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: материалы Всерос. науч.-практич. конф., посвящ. 55-летию Читинской гос. мед. академии. - Чита, 2008. - С.100-101.

12. Антонова, А. А. Состояние полости рта и местный иммунитет у детей различных национальностей Хабаровского края / А. А. Антонова, Н. В. Стрельникова // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: материалы Всерос. науч.-практич. конф., посвящ. 55-летию ЧГМА. - Чита, 2008. - С.101-102.

13. Стрельникова, Н. В. К вопросу о таксономическом положении лептотрихий - возбудителей воспалительных процессов полости рта у детей / Н. В. Стрельникова // Актуальные проблемы стоматологической науки и практики: мат. межрегион. науч.-практич. конф. с междунар. участием.- Кемерово.: Медицина и Просвещение, 2009. - Медицина в Кузбассе. - Спец выпуск № 2. - С. 173-174.

14. Стрельникова, Н. В. Характеристика эпидемического процесса при лептотрихиозном поражении слизистых оболочек полости рта: тезисы XI междунар. конгресса МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии / Н. В. Стрельникова, М. И. Аршинский, И. П. Кольцов // Клиническая микробиология и антимикроб. химиотерапия. - 2009. - Том 11, - № 2.- Прил. № 1. - С. 34-35.

15. Стрельникова, Н. В. О роли условно-патогенной оральной аутофлоры в развитии воспалительных процессов полости рта у детей / Н. В. Стрельникова, А. А. Антонова, И. П. Кольцов [и др.] // Актуальные проблемы стоматологии: сб. трудов науч.-практич. конф. / под ред. А.А. Антоновой.- Хабаровск: Антар, 2009. - С. 253-255.

16. Чувствительность возбудителей лептотрихиозных и кандидозных стоматитов у детей к ионам серебра (Ag+) / Н. В. Стрельникова, А. А. Антонова, И. П. Кольцов, А. В. Чабан // Актуальные проблемы стоматологической науки и практики: материалы межрегион. науч.-практич. конф. с междунар. участием.- Кемерово: Медицина и Просвещение, 2009. - Медицина в Кузбассе. - Спец выпуск № 2. - С. 174-175.

17. Стрельникова, Н. В. Leptotrichia и Leptothrix: информационное письмо / Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, Л. Я. Нестеренко. - Хабаровск.: Изд-во ДВГМУ, 2010. - 23 с.

18. Стрельникова, Н. В. Оценка адгезивных и гистадгезивных свойств Leptotrichia: методические рекомендации для специалистов здравоохранения / Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, А. А. Антонова. - Хабаровск.: Изд-во ГОУ ВПО ДВГМУ, 2010. - 16 с.

СПИСОК РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИХ ПРЕДЛОЖЕНИЙ

1. Техника забора материала с поверхности языка стерильной фильтр-полоской площадью 1 см² для выявления лептотрихий / Н.В. Стрельникова, Г.Н. Холодок, И.П. Кольцов, Л.Я. Нестеренко: Рационализаторское предложение (удостоверение №2639 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 13.10.09).

2. Оптимальный вариант транспортной среды для обеспечения сохранности анаэробных микроорганизмов лептотрихий / Н. В. Стрельникова, И. П. Кольцов, А. А. Антонова, С. С. Рокуш: Рационализаторское предложение (удостоверение №2640 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 13.10.09).

3. Усовершенствование способа определения АЛА у микроорганизмов с низкой /минимальной степенью активности / Н. В. Стрельникова, Г. Н. Холодок, И. П. Кольцов, А. А. Антонова, Е. П. Когут: Рационализаторское предложение (удостоверение №2641 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 15.10.09).

4. Усовершенствование способа разведения лизоцима в методе определения АЛА у микроорганизмов / Н. В. Стрельникова, Г. Н. Холодок, И. П. Кольцов, А. А. Антонова // Рационализаторское предложение (удостоверение №2642 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 15.10.09).

5. Способ выявления бактерицидной активности лептотрихий и др. в отношении тест-штамма микрококка при определении АЛА у микроорганизмов / Н. В. Стрельникова, Г. Н. Холодок, И. П. Кольцов, А. А. Антонова, С. С. Рокуш, И. Н. Алексеева: Рационализаторское предложение (удостоверение №2643 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 15.10.09).

6. Способ определения коадгезивной активности Leptotrichia in vivo /Н. В. Стрельникова, И.П. Кольцов, Г.Н. Холодок, А.А. Антонова, И.Н. Алексеева, Е.Б. Половова: Рационализаторское предложение (удостоверение №2661 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 02.03.10).

7. Определение естественной гистадгезии Leptotrichia в оромикробиоценозе / Н. В. Стрельникова, И.П. Кольцов, А.А. Антонова, Е.Б. Половова, Г.Н. Холодок, В.Ю. Хиврич, Е.В. Тукмаева: Рационализаторское предложение (удостоверение №2670 ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава, г. Хабаровск от 20.04.10).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АИА - антиинтерфероновая активность

АКА - антикомплементарная активность

АЛА - антилизоцимная активность

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИАК - индекс активности коадгезии

ИИК - индекс интенсивности коадгезии

ИРИ - иммунорегуляторный индекс (CD⁺4 /СD8⁺)

ЛСОПР - лептотрихиоз/ы слизистых оболочек полости рта

СОПР - слизистые оболочки полости рта

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

CD - рецепторы кластер дифференцировки лимфоцитов

Ig- иммуноглобулины

Размещено на Allbest.ru