Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран

10

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов, изолированных из операционных ран

03.02.03- микробиология

Лайман Елена Федоровна

Владивосток 2013

Диссертация выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Шаркова Валентина Александровна

Официальные оппоненты:

Тимченко Нелли Фёдоровна - доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Кольцов Игорь Петрович - кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Хабаровск

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Санкт-Петербург

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Практически любая рана, даже нанесенная в условиях операционной, содержит определенное количество микробов, в том числе способных вызвать послеоперационную инфекцию, определяемую как клинически распознаваемое инфекционное осложнение (Абаев Ю. К., 2007). Многолетняя динамика инфекций в области хирургического вмешательства (ИОХВ) в России не изучена в связи с отсутствием объективных данных об их частоте, поэтому изучение микробного состава операционной раны, является одним из этапов решения указанной проблемы (Зуева Л. П., Яфаев Р. Х., 2006; Миронов А. Ю. с соав., 2010).

Оценке микробного фактора в развитии раневой инфекции всегда уделялось большое внимание. Несомненно, вид и количество микроорганизмов и их патогенные свойства играют существенную роль в возникновении и развитии гнойно-воспалительных осложнений и во многом определяют характер их течения (Булынин В. И., 1998; Глагоев В. М., 2008).

В настоящее время доказано, что инфекционный процесс в ране может быть вызван микрофлорой различной степени патогенности. Массивная антибиотикотерапия, проводимая без учета характера возбудителя, подавляет нормальную микрофлору, облегчая условия жизнедеятельности антибиотикоустойчивых микробов (Сидоренко С. В., Яковлев С. В., 2000; DCosta V. M. et al, 2006). Наряду с этим, у микробов-возбудителей патологического процесса происходит ускорение модификации в сторону появления и усиления патогенных свойств (Петровская В. Г., 1967; Бухарин О. В., 1999; Гинцбург А. Л. с соав., 2003).

Поскольку, видовое разнообразие микроорганизмов увеличивается, а их патогенные свойства и устойчивость к антимикробным препаратам усиливаются, вопросы изучения микробного аспекта и его влияния на патогенез, клинику и лечение ИОХВ, усовершенствование диагностики, поиск новых эффективных противомикробных лекарственных препаратов являются актуальными, что и определило выбор цели и основных задач настоящего исследования.

Цель исследования: Определение микробного состава операционной раны, молекулярно-генетической характеристики основных штаммов-контаминантов, антибиотикорезистентности микрофлоры, обоснование рациональной антибактериальной терапии инфекций в области хирургического вмешательства.

Задачи исследования:

1. Определить микробиоценоз операционной раны в динамике шести лет с учетом класса ран (операций) с выявлением основной этиологической группы и состава микробных ассоциантов, дать экологическую характеристику.

2. Оценить глубокую аутомикрофлору кожи хирургических больных, микрофлору слизистых верхних дыхательных путей (ВДП) медицинского персонала и микрофлору внешней среды отделений хирургического профиля.

3. Дать молекулярно-генетическую характеристику патогенных свойств различных видов микробов, изолированных из основных биотопов, оценить ее значимость при ИОХВ в динамике исследования.

4. Оценить устойчивость к антибиотикам микрофлоры операционных ран.

5. Разработать рекомендации по микробиологической диагностике и оптимизации терапии ИОХВ.

Научная новизна. Впервые проведен микробиологический мониторинг штаммов, изолированных из после- и операционных ран в условиях многопрофильного хирургического стационара. Выявлена доминирующая микрофлора E. coli и S. epidermidis и варианты их доминирования в микробных ассоциациях. Указанные микроорганизмы отнесены к эпизодически встречающимся по показателю постоянства, имеют наибольший показатель значимости и наибольшую плотность распределения, которая увеличивается с ростом класса ран (операций).

Показано, что клинические штаммы E. coli, S. aureus, S. epidermidis несут фрагменты ДНК «островов» патогенности, гомологичные известным генам кластеров патогенности, позволяющие обсуждать наличие потенциальной опасности данных микроорганизмов и участие их в развитии раневой инфекции. У 58,7% штаммов E. coli обнаружено присутствие генов, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfa G), цитотоксический некротизирующий фактор (cnf 1), гемолизины (hly A и hly B) с преобладанием высокого уровня в-гемолитических кишечных палочек, в особенности в ранах III-IV класса с тенденцией к нарастанию патогенности в динамике исследования.

Выявлены различия выраженности маркеров факторов патогенности fnbр А, fnbр В, luc PVS с преобладанием генов адгезии (до 85%) у штаммов S. aureus и S. epidermidis, изолированных из различных источников.

Выявлено появление комбинаций генов патогенности: штаммов E. coli - с 2009г., S. aureus и S. epidermidis - с 2010г., повышающие патогенные свойства изолятов (hly B, cnf 1и fnbр А, fnbр В, luc PVS, соответственно).

Проведено мониторирование антибиотикорезистентности основных штаммов-контаминантов, изолированных из операционных ран. В группе штаммов Staphylococcus spp. определены генетические особенности формирования антибиотикорезистентности. Предложена возможная коррекция терапии инфекций в области хирургического вмешательства.

Практическая значимость исследований.

Разработаны схемы отбора проб клинического материала, критерии мониторинга антибиотикорезистентности, с целью идентификации клинически значимых микроорганизмов, контамирующих операционные раны. Определена схема эффективного применения молекулярно-генетических методов с целью микробиологического мониторинга патогенности и метициллинрезистентности значимых штаммов микроорганизмов, выделенных из различных биотопов хирургического стационара.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов E.coli и Sthaphylocoсcus spp. предлагает и обосновывает эффективную этиотропную химиотерапию, в том числе, для последних, с определением гена mec A при множественной антибиотикорезистентности и гетерорезистентности.

Подготовлены и внедрены в практическое здравоохранение методические разработки «Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования», «Определение генетических маркеров факторов патогенности E. сoli методом ПЦР-РВ»; информационное письмо

«Мониторинг антибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран»; рационализаторское предложение «Метод бакпечаток для культурального исследования глубокой аутомикрофлоры у хирургических больных» (№ 2787 от 22 июня 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микробиоценоз операционных ран характеризуется богатством видов. Группу основной микрофлоры составляют E. coli и S. еpidermidis. Рост контаминации операционных ран происходит от первого класса к четвертому за счет нарастания удельного веса E. coli и снижения штаммов S. epidermidis.

2. Штаммы E. сoli, изолированные из операционных ран, характеризуются высоким уровнем колонизации в-гемолитическими вариантами, преобладанием комбинаций генетических детерминант патогенности hly B, cnf 1. S. еpidermidis, изолированный из послеоперационных ран, характеризуются наличием генетических маркеров fnbр А, fnbр В, что определяет его как потенциальный патоген.

3. Чувствительность микрофлоры к антибиотикам мало зависит от биотопа. Антибиотикорезистентность основных штаммов - контаминантов операционной раны характеризуется ростом удельного веса штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, появлением гена mec A у изолятов S. еpidermidis, S. aureus.

Апробация научных материалов диссертации прошла на разных уровнях: Европейском съезде инфекционистов (г. Витебск, 2007 г.), IX и XI Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, (г. Владивоcток, 2008 г., 2010 г.), Научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста. Антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (г. Харьков, 2008 г.), VII, VIII Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Владивосток, 2010 г., 2011 г.), ХVI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Франция, г. Париж, 2011 г.), научной конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Турция, г. Анталия, 2011 г.), 2-й Международной научно-практической конференции "Европейская наука и технологии" (Германия, г. Вестбаден, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Италия, 2012 г.), Международной научно-практической конференции «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (Италия, 2012 г.), XIV, XV Международных конгрессах МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (г. Москва, 2012 г., 2013 г.). Результаты диссертационного исследования обсуждены на заседании кафедры микробиологии и вирусологии (протокол № 6 от 15.02.2013 г.) и проблемной комиссии «Инфекционные болезни, гигиена, эпидемиология, микробиология, иммунология» (протокол № 10 от 02.07.2013г.) ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России.

Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано 19 научных публикаций, в том числе 3 статьи в печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ, одна - в международной печати, 2 методические разработки, 1 информационное письмо. Имеется рационализаторское предложение.

Личный вклад автора. Автором осуществлена систематизация и анализ полученного материала. Лично автором проведены забор проб и посев биоматериала от хирургических больных, материала госпитальной среды и верхних дыхательных путей медицинского персонала; осуществлено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам; молекулярно-генетические исследования основных штаммов бактерий. Все методы статистической обработки выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации традиционная. Ее текст изложен на 207 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 54 таблицами, 10 рисунками, 1 схемой. Она включает: введение;главу «Контингент, материалы, направления и методы исследования», собственные исследования (4 главы), заключение, общие выводы, рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку, практику, учебный процесс. Использовано 293 литературных источника, в том числе 184 отечественных и 109 иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Контингент, материалы и методы исследования. Микробный состав операционных ран был изучен в группах хирургических больных, которым проведены операции в период времени с 2005 г. по 2010 г. c положительными высевами из операционных ран. Сформировано 4 группы (248 человек), различаемые по классу хирургических ран (операций) согласно классификации Classen C. D. (1992): I класс - «чистые» - 15 человек, II класс - «условно-чистые» - 101 человек, III класс - «загрязненные» - 70 человек, IV класс - «грязные» - 62 человека. Больные перенёсшие операции I, III и IV класса - пациенты хирургического отделения, перенёсшие операции II класса - акушерского и гинекологического отделений.

Материалом для микробиологического анализа явились 1596 биологических проб отделяемого операционных ран от 861 пациентов, 67 проб отделяемого послеоперационных ран, 152 пробы глубокой аутомикрофлоры кожи (АМФК) и 1663 мазка-отпечатка раневой поверхности хирургических больных. Отобрано для исследований 118 пробы воздуха, 783 смыва с поверхностей. Сравнительные биологические свойства и ассоциированные формы изучены у 372 штаммов микроорганизмов, выделенных от хирургических больных во время операции. 46 штаммов, выделенных из послеоперационных ран, 164 штаммов глубокой АМФК, 66 штаммов из внешней среды и 44 штамма со слизистых верхних дыхательных путей медицинского персонала. Проведено 626 молекулярно-генетических исследования методом ПЦР-РВ с детекцией восьми маркеров факторов патогенности и одного метициллинрезистентности. Статистический анализ исследований проведен с использованием метода одномерной описательной статистики с использоваением программы «Statistica 6,0» (среднеарифметическая М, ее ошибка m, критерий Стьюдента - t, уровень значимости - р), корреляционного анализа с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена - r, оценкой достоверности коэффициента корреляции. Проведено определение показателя постоянства (С), видового разнообразия (d) по Р. Уиттекеру (1980), индекса значимости микрофлоры (V) по М. П. Наткевичайте-Иванаускене, индекса MAR (Krumperman Р. Н., 1983).

Результаты исследования и их обсуждение. При бактериологическом исследовании отделяемого операционных ран изолировано и идентифицировано 372 штамма, среди которых преобладали аэробные микроорганизмы (98,4±0,6%) - 366 шт. На долю анаэробной флоры пришлось 6 штаммов (1,6±0,6%). Спектр аэробной микрофлоры был сформирован 53 видами и 18 родами, в число анаэробов вошло 5 видов бактерий, отнесенных к 3 родам.

Наиболее частыми представителями микрофлоры операционных ран явились грамположительные кокковые формы, удельный вес которых составил 56,5±2,6% (210 штаммов) и грамотрицательные палочки - 39,2±2,5% (146 штаммов). Прочие микроорганизмы: грамотрицательные кокки, грамположительные палочки, дрожжеподобные грибы выделены с удельным весом 0,3±0,3%, 1,9±0,7%, 0,5±0,4%, соответственно. Видовой состав отдельных групп микроорганизмов операционных ран был нами изучен в динамике. В общем спектре микроорганизмов все годы лидирующее место занимали грамположительные кокки (таблица 1) в пределах 48,6±8,4% - 64,3±7,4%. Удельный вес грамотрицательных палочек был несколько ниже и составлял от 30,9±7,1% до 48,6±8,4%. В 2006 г. участие грамположительных кокков и грамотрицательных палочек было однозначным (по 48,6±8,4%). Все прочие микроорганизмы выделялись в единичных случаях. Грамположительная кокковая флора была представлена двумя семействами микрококков (55,1±2,6%) и стрептококков (1,4±0,6%). Отличительным свойством первого являлось разнообразие видов, многочисленность штаммов и большое число выделенных культур. В число представителей рода Staphylococcus вошли 14 видов, из них12 видов были отнесены к коагулазоотрицательным (КОС), 2 вида, - к коагулазоположительным стафилококкам. При этом те и другие в суммарном соотношении составили - 87,3±2,8% (124 штамма) и 12,7 ±2,8% (18 штаммов), соответственно. Удельный вес микрококков среди всех выделенных микроорганизмов составлял от 4,8±2,1% до 29,1 ± 6,6% с лидирующим положением в 2007 г. Удельный вес высева микрококков повышался с 2005 г. по 2007 г. от 23,8±6,6%, до 29,1±6,6% соответственно, в 2008 г. снизился до 15,6±4,5%, в 2010 г. -до 5,9±2,9%. Таким образом, произошло статистически достоверное снижение удельного веса микрококков в общем спектре микроорганизмов операционной раны в изучаемый период в 4,7 раза (р<0,001). Семейство Streptococcaceae было представлено двумя родами (Streptococcus, Enterococcus) и тремя видами (S. milleri, E. faecium, E. faecalis), изолированных в единичных случаях, что составило от 1,6±1,6% до 5,7±3,9%. В группе грамотрицательных палочек выделены энтеробактерии с удельным весом от 20,8±5,9% до 48,6±8,4% и неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ) (от 10,4±4,4% до 4,8±2,1). Среди энтеробактерий наиболее часто встречаема E. coli - 64,5±4,3% (78 штаммов суммарно по годам). Удельный вес E. coli в разные годы был от 37,5±10,1% до 100±0,0% с некоторой тенденцией к снижению с 2005 г. по 2010 г. Удельный вес НГОБ в общей структуре микроорганизмов оставался с течением времени практически неизменным и включал A. lwoffii 48±10,2% (12 штаммов), P. aeruginosa - 20,8±8,2% (5 штаммов). A. junii и A. piechaudii по 12±6,6% (3 штамма). A. faecalis и P. putida по 4,0±4,0%.

штамм операционная рана инфекция

Анализ суммарной частоты встречаемости отдельных микробных видов в изучаемый период показал, что ведущее место среди них заняли 2 представителя: E. coli (21,0±3,1%) и S. epidermidis (15,3±2,7%) (таблица 2). Они в совокупности составили 36,3±3,6% и включены нами в основную группу бактерий. Прочие, редко встречаемые виды, в совокупности составили 47,6±3,8%, удельный вес каждого из них составил от 1,1±0,8% до 6,7±1,9%. Редкими находками были: прочие представители стафилококков 22,8±3,1, энтеробактерий - 8,3±2,1%, НГОБ 4,6 ±1,6%. Остальная микрофлора (60 видов) была выделена в виде единичных культур, совокупность которых составила - 16,1±1,9% и отнесена нами к группе эпизодически встречаемых микроорганизмов.

Таблица 2

Суммарная доля основных и редких микроорганизмов операционной раны

При изучении микробиоценоза операционных ран в группах больных, которым проведены операции по профилю хирургического, гинекологического и акушерского отделений, установлено, что удельный вес представителей основной микрофлоры по мере усиления загрязнения ран от первого класса к четвертому повышался от 30,4±9,8% (при операциях I класса) до 25,6±3,6% (при операциях II класса), 47,3±5,1% - III класса и 42,1±4,7% - IV класса. Причем, удельный вес S. epidermidis снижался с увеличением класса с 30,4±9,8% в I до 22,8±3,5% во II, 7,3±2,7% и 9,1±2,8% III и IV, соответственно (рисунок 1). E. coli в I классе не определялись, во II классе составили 2,8±1,4%, в III и IV классах обнаруживались с удельным весом до 40,0±5,03% и 33,0±4,5% соответственно.

В целом, по сумме выделенных микроорганизмов, микрофлора ХО характеризуется преобладанием E. coli 32,6±3,1%, микрофлора ГО и АО - S. epidermidis - (28,6±8,7% и 21,4±3,8%,соответственно).

Из 61 микроорганизмов, обнаруженных в составе ассоциаций в изучаемый период, в 11 случаях (18,0%) обязательным микроорганизмом был S. epidermidis и в 8 - E. coli (13,1%). В целом стафилококки составили 40,9%, а энтеробактерии - 26,2%. Микрококки и НГОБ составили по 13,1%, коринебактерии и дрожжеподобные грибы, встречавшиеся в единичных случаях, - 4,9% и 1,6%, соответственно.

Рисунок 1. Удельный вес основных микроорганизмов, выделенных интраоперационно (%).

Проведенный нами микробиоценотический анализ микропейзажа операционной раны с использованием показателей: индекса встречаемости, индекса значимости (Наткевичайте-Иванаускене М. П., 1985), показателя видового разнообразия показал, что, несмотря на нарастание богатства видов в динамике, все выделенные микроорганизмы отнесены к группе эпизодически встречающихся или случайных, (индекс постоянства - С<25%), так как операционная рана по своей сути не является биотопом человеческого организма с наличием постоянных обитателей. Наибольшим индекс постоянства был в группе грамположительных кокков (13%), средикоторых; у рода Staphylococcus 9,5%, грамотрицательных палочек 9%, семейство Enterobacteriaceae в том числе 7,6% (таблица 3). Прочие группы и рода встречались с еще меньшей частотой.

Таблица 3.

Индекс постоянства, микроорганизмов, выделенных из операционных ран в период с 2005 по 2010 годы.

*- общее количество исследованных проб - 1596

Индекс постоянства всех выделенных микроорганизмов суммарно составил 23,3%. Значимость микроорганизмов оценивали с учетом класса ран в основных группах (II, III, IV). Наиболее значимыми во II классе ран (операций) были бактерии Staphylococus spp., показатель их значимости составил 24,5%. Бактерии E. coli оказались наиболее значимы в III классе с индексом 23,5%, стафилококки и прочие энтеробактерии - в IV классе ран (операций) (16,2% и 18%, соответственно). Микроорганизмы Micrococcus spp., Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., В. mesentericus имели низкие индексы значимости.

В динамике происходило нарастание качественного показателя богатства видов до 0,0026% (2009 г.), служившее компенсаторным механизмом низкого показателя их постоянства, а далее наметилось снижение видового разнообразия, как меры компенсации роста патогенных свойств оставшихся видов (рисунок 2).

Рисунок 2. Видовое разнообразие микроорганизмов (d,%), выделенных в динамике.

При бактериологическом исследовании отделяемого 67 послеоперационных ран пациентов хирургического отделения обнаружено 46 микроорганизмов в 57% проб. Микрофлора послеоперационной раны была представлена 18 видами и 9 родами против 40 видов из 20 родов операционной раны.

Анализ суммарной этиологической значимости отдельных микробных видов в послеоперационной ране показал, что основное значение имели представители кокковой микрофлоры, а именно стафилококки, в совокупности составив 67,4±6,9% (рисунок 3).

Рисунок 3. Удельный вес обнаружения различных видов бактерий в послеоперационной ране (%).

Между группами стафилококков, выделенных из операционных и послеоперационных ран, зафиксированы статистически достоверные различия (р<0,05). Среди стафилококков лидирующее место занимал S. epidermidis 26,1±6,5 против 10,5±2,0% в операционных ранах (р<0,05). Второе место после стафилококков в этиологии послеоперационной раны занимали энтеробактерии - 17,4±5,6%, что в 2,7 раза меньше, чем доля их участия в этиологии операционной раны (р<0,05). Среди энтеробактерий также преобладали E.coli (8,7±4,1%) против 32,6±3,1% в операционных ранах (р<0,05).

Спектр выделенных у сотрудников стационаров хирургического профиля микроорганизмов включал 44 штамма, отнесенные к 4 родам и 11 видам. Бактерии рода Staphylococcus выделены в 90,9±4,3 % случаях, рода Micrococcus - 4,5±3,1%, кандиды (C. albicans) и нейссерии (N. mucosa) - по 4,5±2,3%.

В микрофлоре госпитальной среды стафилококки составили 57,6% как в воздухе, так и в смывах с поверхностей. Энтеробактерии обнаружены лишь в смывах с поверхностей, составив 12,1% в общем спектре микроорганизмов. Среди стафилококков выделены S. epidermidis и S.aureus по 10,6±3,8% с интенсивностью роста 10¹ - 10², прочие встречались реже.

Так как факторы патогенности генетически детерминированы, определение генетических детерминант, гомологичных известным генам патогенности «классических» патогенов E. coli (hly A, hly B, sfa G, cnf 1, est B), было использовано нами для тестирования 46 клинических штаммов E. сoli и штаммов из внешней среды, из которых 58,7% оказались патогенными. При этом в операционной ране обнаружено 45,7% штаммов E. сoli с факторами патогенности, в послеоперационной ране и во внешней среде - по 6,5%. В общем пуле исследованных штаммов E. сoli, изолированных из операционных ран в 2007 - 2010 гг., образование искомых ампликонов имело место в 52,5% случаях.

Отмечено статистически достоверное количественное нарастание факторов патогенности микроба с 33,3% до 100% (р<0,001) 2007 - 2009 гг., 66,7% (р<0,002) в 2010 г. Ассоциативность генов патогенности статистически достоверно возрастала,превысив число штаммов с одиночными генами (75% против 25%, р<0,01). При этом отмечалось по два сочетания геновариантов - 58,3%, по три - 16,7%. Чаще встречались сочетания hly B, cnf 1 (33,3%). В общем разнообразии генов патогенности преобладали hly B - 52,5%, cnf 1 - 36,4%, sfa G - 24,2%, hly A - 12,1%. Энтеротоксин (est B) не был обнаружен ни в одном штамме. Разнообразие генов патогенности в штаммах E. сoli несколько отличалось по классам ран. В III классе ран преобладали sfa G (38,9%) и hly B (33,3%); сnf 1 составил 22,2%, hly A - 5,6%. В IV классе преобладали hly B и cnf 1 (40% и 33,3%, соответственно), sfa G - 6,7%, hly A - 20%. В ранах обоих классов преобладали в-гемолитические и некротизирующие E. coli.

На присутствие генетических детерминант (фибронектинсвязывающие протеины А и В, лейкоцидин) исследовано 48 штаммов S. aureus и 51 штамм S. epidermidis, изолированных из операционных и послеоперационных ран, зева и носа медицинского персонала, госпитальной среды. Гены патогенности обнаружены в 56,3% штаммах S. aureus и 15,7% штаммах S. epidermidis изолированных из различных источников (рисунок 4). Гены патогенности штаммов Staphylococcus spp. выявлялись с 2010 г., преимущественно детерминированы от медицинского персонала - 66,7%, из после- и операционных ран (50% и 27,7%). При этом гены патогенности штаммов S. aureus выделены преимущественно из операционных ран (81,8%) и от медицинского персонала (85%), с меньшей частотой из послеоперационных ран (50%) и представлены в основном фибронектинсвязывающими протеинами А и В (fnb р А, fnbр В). В штаммах, изолированных из операционных ран fnbр А, fnbр В составили 94,7%, лейкоцидин (luc PVS)-5,3 %; от медицинского персонала-100% fnbр А, fnbр B. В штаммах S. epidermidis, изолированных из послеоперационных ран генетические де терминанты, обнаруженные с частотой 50%, были представлены в 90,9% fnbрА, fnbр В и в 9,1% лейкоцидином. Маркер лейкоцидина обнаруживался у обоих видов (S. aureus и S. epidermidis) с практически с одинаковой частотой 4,2% и 3,9%, соответственно.

Рисунок 4. Выявление генов патогенности у штаммов Staphylococcus spp (S. aureus, S. epdermidis), %.

Устойчивость к антимикробным препаратам определяли у штаммов наиболее часто встретившихся в операционных ранах: S. epidermidis, S. аureus, E. сoli. Выраженность устойчивости к антибактериальным препаратам определялась свойствами штаммов, выделявшихся от пациентов хирургического стационара в разные периоды исследования (c 2008 г. по 2010 г. для S. epidermidis), но в целом чувствительность стафилококков к таким препаратам как цефтриаксон, офлоксацин, меропенем оставалась стабильно высокой (100%).

Чувствительность эпидермальных стафилококков к таким препаратам как фурагин, фурадонин, гентамицин, тобрамицин, цефуроксим, цефотаксим, рифампицин, ванкомицин составила более 80%, в том числе оставалась стабильно высокой (от 83,3±9,0% до 100%) весь изучаемый период к фурагину, гентамицину, тобрамицину, ванкомицину. Напротив, устойчивость была достаточно высокой и продолжала нарастать к следующим антибиотикам: бензилпенициллину (от 76,4±10,6% до 83,3±11,2%), цефтазидиму, налидиксовой кислоте, тетрациклинам, линкомицину, рифампицину и макролидам, за исключением эритромицина, и составила максимально в 2010 г. от 33,3±14,2 % до 58,3±14,9% резистентных штаммов.

Весь изучаемый период встречались штаммы S. epidermidis с множественной лекарственной устойчивостью. Для ее оценки нами был использован индекс множественной антибиотикорезистентности - MAR (Krumperman Р. Н., 1983). В результате анализа установлено, что множественной антибиотикорезистентностью в 2008г. обладали 11,8% штаммов, 2009 г. и 2010 г. по 16,7%. Причем в 2010 г. зафиксирован штамм устойчивый к ванкомицину.

Анализ антибиотикочувствительности штаммов S. aureus, S. epidermidis, выделенных из различных биотопов показал, что резистентность к большему числу антибактериальных препаратов, мало зависит от биотопа, что подчеркивает циркуляцию единых микроорганизмов в хирургическом стационаре. Резистентность штаммов S. aureus, изолированных из разных источников, была ниже по всем группам антибактериальных препаратов, чем у штаммов S. epidermidis. Удельный вес штаммов с MAR ? 0,2 был равен 15,7% и 17,6% у S. aureus и S. epidermidis, соответственно.

При молекулярно-генетическом определении антибиотикочувствительности 51 штамма S. epidermidis и 48 штаммов S. aureus, выделенных из после - и операционных ран, госпитальной среды, от медицинского персонала обнаружено наличие гена метициллинрезистентости (mec А) в 25,5% и 20,8%, соответственно.

Ген метициллинрезистентности обнаружен у 18,2% штаммов S. aureus, 24% штаммов S. epidermidis, изолированных из операционных ран.

В послеоперационных ранах генетические детерминанты антибиотикорезистенности обнаружены в 10% штаммов только S. epidermidis. Штаммы S. aureus, выделенные из микрофлоры медицинского персонала, содержали mec А в 10% случаев, S. epidermidis в 4 раза чаще (42,9%). Обнаружение данного гена в микрофлоре госпитальной среды составило 33,3% у штаммов S. epidermidis и 40% S. aureus.

Устойчивость 78 штаммов E. сoli, выделенных из операционных ран проанализирована по 8 группам антибактериальных препаратов, включая препараты первого и дополнительного ряда, согласно МУК 4.2. 1890-04, в том числе с использованием метода серийных разведений.

Среднюю суммарную резистентность штаммы E. сoli проявляли к полусинтетическим пенициллинам (с 42,3±5,6% до 50±5,7%), фуразолидону - до 30,8±5,2%), канамицину - до 65,4±5,4%, пефлоксацину - до 34,6±5,4%, тетрациклину - до 64,1±5,4%. Высокую чувствительность сохраняли к карбопенемам и цефалоспоринам II поколения (цефуроксим) до 100%; к цефалоспоринам III поколения (цефтазидиму) до 80,7±4,5%, фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин, офлоксацин по 82,1±4,3%, 94,9±2,5%, соответственно), амикацину - до 96,1±2,2%, но с формированием устойчивости, выразившееся в появлении умеренно устойчивых штаммов к цефазолину 11,5±3,6%, цефтазидиму - 12,9±3,8%, ципрофлоксацину - 10,3±3,4%, амикацину - 2,6±1,8%. Удельный вес штаммов E. сoli с МAR, начиная с 2005 г. нарастает до 22,2%, удерживая данный уровень в 2009 г., и несколько снижаясь в 2010 г. (17,6%).

ВЫВОДЫ

1. Микроорганизмы, изолированные из операционных ран, относятся к группе эпизодически встречающихся или случайных. Группу основной микрофлоры составляют S. epidermidis, E. coli с преимуществом выделения S. еpidermidis в акушерском и гинекологическом отделении, E. coli, - в хирургическом. Для микробиоценоза операционной раны характерно нарастание богатства видов, что служит компенсаторным механизмом низкого показателя их постоянства. Данные микроорганизмы имеют наибольший показатель значимости, зависящий от класса ран (II класс - Staphylococcus spp, III класс - Е. coli), нарастание в динамике удельного веса в моноформах и в ассоциациях.

2. Микробиоценоз глубокой АМФК хирургических больных преимущественно представлен: Staphylococcus spp (S. epidermidis - 37,8%, S. saprophyticus - 29,3%), составив в моноформах - 78,9%, в ассоциациях - 14,5%. Преобладание стафилококков, отмеченное как в микрофлоре операционных и послеоперационных ран, так и в мико-флоре внешней среды и медицинского персонала, свидетельствует о формировании единого микробиоценоза между различными биотопами.

3. Мониторинг микробиоценоза операционной раны выявил увеличение удельного веса штаммов E. сoli с детерминированием генов патогенности с высоким уровнем колонизации в - гемолитическими вариантами (52,5%). Комбинации генов отмечены с 2009 г., резко нарастая в динамике: преимущественно hly B, cnf 1 (33,3%), hly B, sfa G (22,2%), hly B, cnf 1, sfa G (22,2%), что подчеркивает потенциальную патогенность данных этнеробактерий, участие их в развитии раневой инфекции и в усугублении патогенетических процессов.

4. Гены патогенности штаммов Staphylococcus spp. выявляются с 2010 г., преимущественно детерминированы из после- и операционных ран (50% и 27,7%), от медицинского персонала - 66,7%. При этом гены патогенности штаммов S. epidermidis выделены преимущественно из послеоперационных ран в ХО (62,5%), S. aureus - из операционных ран (33,3%) и от медицинского персонала (63,8%), причем чаще fnbр А, fnbр В. Изоляты Staphylococcus spp из биоматериала обнаруживают генетические детерминанты лейкоцидина, являющиеся маркерами тяжелых инфекционных процессов, в равном количестве, что позволяет судить о горизонтальном переносе luc PVS. Амплификация fnbр А, fnbр В, luc PVS может использоваться для подтверждения патогенности клинических изолятов Staphylococcus spp, и служить объективным критерием при оценке их эпидемического значения.

5. Чувствительность микрофлоры к АБП зависела от вида микроорганизма, препарата, мало зависела от биотопа. Имели наибольшую чувствительность штаммы S. aureus к гентамицину, ванкомицину, ципрофлоксацину, рифампицину; штаммы S. epidermidis - к цефуроксиму, ванкомицину, меропенему, офлоксацину; штаммы E. сoli к цефаклору, цефуроксиму, цефтазидиму, амикацину, меропенему, ципрофлоксацину, офлоксацину. Отмечено нарастание в динамике удельного веса штаммов S. epidermidis, E. сoli с множественной антиботикорезистентностью.

6. Гены устойчивости к метициллину у штаммов S. epidermidis обнаруживались чаще, особенно у изолированных из биопроб, что может свидетельствовать о ведущей роли эпидермального стафилококка в передаче подвижного генетического элемента mec А золотистому стафилококку.

Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику

1. Учитывая факт обнаружения в операционной ране микроорганизмов вне зависимости от чистоты операции, рекомендовать проводить микробиологические исследования отделяемого операционной раны, подкожно-жировой клетчатки интраоперационно и на пятый день после операции с использованием расширенного набора дифференциально-диагностических и селективных питательных сред и культивированием их в аэробных и анаэробных условиях, с количественным определением выделенной микрофлоры, профиля антибиотикочувствительности как к препаратам выбора, так и к препаратам других классов и групп. В характеристике выделенной микрофлоры необходимо учитывать весь спектр микроорганизмов и их антибиотикочувствительность.

2. Рекомендовать определение факторов патогенности молекулярно-генетическим методом для ускорения идентификации патогенных свойств микроорганизмов, оценки степени их патогенности:

-Клинических штаммов E. сoli - hly A, hly B, sfa G, cnf 1;

-Клинических штаммов S. aureus и S. epidermidis - fnbр А, fnbр В, luc PVS.

3. В случае выделения из операционных ран штаммов S. aureus, S. epidermidis, обладающих множественной антибиотикорезистентностью и гетерорезистентностью к оксациллину, использовать определение гена метициллинзистентности mec A для подтверждения MRSA и MRSE.

4. Проводить в лечебных учреждениях постоянный мониторинг патогенности и антибиотикорезистентиности, в том числе метициллинрезистентности, циркулирующих штаммов для обоснования риска развития ИОХВ и назначения эффективной этиотропной химиотерапии.

5. Для эмпирической терапии ИОХВ рекомендовать использование следующих антибактериальных препаратов: При обнаружении в ране стафилококков (S. аureus, S. epidermidis): цефуроксим, ванкомицин, меропенем, офлоксацин; кишечной палочки: цефаклор, меропенем. Возможно использование с индивидуальным подходом нитрофуранов и гентамицина при выделении из ран кишечной палочки, эпидермального стафилококка.

6. Подготовлены и внедрены в практическое здравоохранение методические разработки «Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования», «Определение генетических маркеров факторов патогенности E. сoli методом ПЦР-РВ»; рационализаторское предложение «Метод бакпечаток для культурального исследования глубокой аутомикрофлоры у хирургических больных» № 2787 от 22 июня 2011г.; информационное письмо «Мониторинг антибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шаркова, В. А. Микробиоценоз операционной раны и его зависимость от класса / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 5 (2). - С. 379-383.

2. Шаркова, В. А. Генетически обусловленная патогенность и антибиотикорезистентность штаммов Staphylococcus spp. / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман // Дальневосточный мед. журн. - 2013. - № 3. - С. 28-31.

3. Случай обнаружения S. enteritidis в послеоперационной ране / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, Н. А. Баранова, И. Д. Шарафулисламова, А. Т. Федоренко, В. А. Гуркалюк, И. Ю. Карташов // Дальневосточный мед. журн. - 2011. - № 4. - С. 104-109.

4. Characteristic of patogenicity of strains E. сoli, isolated from incisional wounds / E. F. Laiman, V. A. Sharkova, M. E. Mazur, M. N. Prosiannikova // European Science and Technology: mat. II International Research Practice Conf., Wiesbaden (Germany), 9-10 мая 2012 г. - Wiesbaden, Germany. 2012. - Vol. II. - Р. 463-468.

5. Шаркова, В. А. Чувствительность к антибиотикам микрофлоры операционных ран / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Материалы научно-практической конференции с международным участием. «Инфекции в практике клинициста. Антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах», Харьков, 27-28 марта 2008 г. / ред. В.П. Малой, И.С. Кратенко - Харьков, 2008. - С. 372-373.

6. Лайман, Е. Ф. Микробный пейзаж операционных ран / Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тез. докл. IX Тихоокеанской науч.-практич. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Владивосток, 20 сентября 2008 г. ВГМУ / ред. В. А. Невзорова, О. В. Семешина, Т. А. Бродская. - Владивосток: Медицина ДВ, 2008. - С. 60-61.

7. Лайман, Е. Ф. Мониторинг внешней среды хирургического стационара / Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Медицинские науки. - 2008. - № 6. - С. 7. - Приложение к журн. «Современные проблемы науки и образования».

8. Лайман, Е. Ф. Устойчивость коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных интраоперационно к антибактериальным препаратам / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, Н. А. Баранова // Человек и лекарство: тез. докл. VII Дальневосточного регионального конгресса, Владивосток, 30 сентября-1 октября 2010 г. ВГМУ / ред. В.Б. Шуманов. - Приложение к журн. «Тихоокеанский мед. журн.». - 2010. - № 3. - С. 28.

9. Структура таксономических групп микрофлоры ран при различных типах хирургического вмешательства / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова [и др.] // Тез. XVI междунар. конгр. по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Москва, 15-19 сентября 2011 г. / ред. Р.И. Сепиашвили - Аллергология и иммунология. - 2011. - Т. 12. № 1. - С. 95-96.

10. Лайман, Е. Ф. Динамика антибиотикорезистентности штаммов E. coli, выделенных интраоперационно / Е. Ф. Лайман, Н. А. Баранова // Человек и лекарство: тез. докл. VIII Дальневосточного регионального конгр., Владивосток, 15-16 сентября 20011 г. - Приложение к журн. «Тихоокеанский мед. журн. - 2011. - № 3. - С. 55-56.

11. Характеристика видового состава и устойчивости к антимикробным препаратам микробиоценоза верхних дыхательных путей медицинского персонала / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, Н. А Баранова [и др.] // Междунар. журн. прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - № 10. - С. 66.

12. Молекулярно-генетическая характеристика патогенности штаммов Staphylococcus spp., изолированных из операционных ран / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, М. Е. Мазур, М. Н. Просянникова // Междунар. журн. экспериментального образования. - 2012. - № 7. - С. 69.

13. Шаркова, В. А. Молекулярно-генетический мониторинг метициллинустойчивых штаммов Staphylococcus spp / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман, М. Е. Мазур // Мат. XIV Междунар. конгр. МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии // КМАХ. - 2012. - Т. 14, № 2. - С. 57. - Приложение 1

14. Молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности штаммов E. сoli, выделенных из операционных ран различных классов / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, М. Е. Мазур, М. Н. Просянникова // Междунар. журн. экспериментального образования. - 2012. - № 5. - С. 84-85.

15. Лайман, Е. Ф. Характеристка микрофлоры послеоперационных ран / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова // Мат. Второго Евро-Азиатского конгр. Общества по инфекционным болезням, Астана (Казахстан), 12-14 сентября 2012 г. / под ред. В. И. Покровского, Ю. В. Лобзина. - Астана (Казахстан), 2012. - С.48.

16. Шаркова, В. А. Динамика патогенности и антибиотикорезистентности штаммов E. сoli, выделенных из операционных ран // В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман // Мат. XV Междунар. конгр. МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии. // КМАХ. - 2013. - Т. 15, № 2. - С. 48. - Приложение 1.

17. Лайман, Е. Ф. Отбор проб клинического материала из операционной раны для микробиологического исследования: методическая разработка / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова. - Владивосток, 2012. - 14 с.

18. Лайман, Е. Ф. Определение генетических маркеров факторов патогенности E. сoli методом ПЦР: методическая разработка / Е. Ф. Лайман, В. А. Шаркова, М. Е. Мазур. - Владивосток, 2012. - 17 с.

19. Шаркова, В. А. Мониторинг антибиотикорезистентности микрофлоры операционных ран: информационное письмо / В. А. Шаркова, Е. Ф. Лайман. - Владивосток, 2013. - 27 с.

Размещено на Allbest.ru