Механизмы формирования пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Механизмы формирования пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе (экспериментальное исследование)

14.00.15 - патологическая анатомия

Ахмад Итмезех

Волгоград - 2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Новочадов Валерий Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Богомолова Нина Викторовна

доктор медицинских наук, профессор Славинский Александр Александрович

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Развитие многих хронических заболеваний, таких как атеросклероз, болезни печени и желчевыводящих путей, почек, эндокринопатий и др., сопровождаются повышенным образованием эндогенных токсических соединений (ЭТС) и/или недостаточным удалением их из организма. Когда эти соединения распространяются по жидким средам (крови, лимфе, тканевой жидкости) и вызывают повреждение клеток внутренних органов, следует говорить о развитии эндотоксикоза (ЭТ) [Яковлев М.Ю., 1998, 2000, 2005; Мишнев О.Д., с соавт., 2001, 2003; Щеголев А.А., с соавт., 2002; Богомолова Н.В., 2005; Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005; Feldman A.M., McTiernan C., 2004; Jortani S.A., et al., 2004].

В отличие от острого процесса, хронический ЭТ выделен как самостоятельный общепатологический синдром сравнительно недавно, а его органопатология находится на настоящий момент в стадии изучения. Сущность хронического ЭТ состоит в необратимой тканевой перестройке внутренних органов с ограничением их функции под постоянным действием сравнительно умеренных концентраций эндогенных токсических соединений. В работах, выполненных на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета в последние годы, указывается на обязательное вовлечение печени, легких и почек в сложный пато- и морфогенез хронического ЭТ [Новочадов В.В., 1998-2005; Фролов В.И., 2002, 2004].

Легкие выступают в качестве одного из наиболее уязвимых для ЭТС органов, как в силу высокого транзита через них крови, так и в связи с присутствием большого количества клеток-мишеней с ярко выраженными межклеточными взаимодействиями [Ерохин В.В., Романова Л.К., 2000; Харланова Н.Г., 2001; Хусинов А.А., 2004; Cole A.M., Waring A.J., 2001; Herskovic J.J., 2002; Huang H., et al., 2005]. Тем не менее, универсальным исходом хронического ЭТ для легких становится формирование пневмосклероза. Альвеолярные эпителиоциты двух типов, макрофаги, эндотелий, фибробласты и транзиторные лейкоцитов, эпителиальные и гладкомышечные клетки бронхов, а также нейроэндокринные клетки имеют различный рецепторный аппарат и локализацию [Коган Е.А., с соавт., 2003, 2006; Тарасова Т.В., с соавт., 2003; Черняев А.Л., Самсонова М.В., 2004, 2006; Втюрин Б.В., с соавт., 2006; Toward T., Broadley K., 2002; Abraham E., 2003; Crapo J.D., 2003; Werlich T., et al., 2004; Hetland R.B. et al., 2005], что предполагает их неоднозначную роль в формировании пневмосклероза.

Имеющиеся в настоящее время работы, посвященные механизмам образования соединительной ткани в легких как результат хронического ЭТ, немногочисленны [Doucet C., et al., 2002; Gozal E., et al., 2002; Bodo M., et al., 2003; Shimabukuro D.W., et al., 2003; Beck-Schimmer B., et al., 2006], они не выделяют эндогенные токсические соединения в качестве самостоятельного фактора морфогенеза.

С этих позиций актуальным представляется экспериментальное исследование морфофункциональных изменений в легких при хроническом ЭТ в аспекте изучения его тканевой перестройки и формирования пневмосклероза.

Цель работы - получить в эксперименте новые данные о динамике и механизмах формирования пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе для улучшения диагностики хронических заболеваний легких в патолого-анатомической практике.

Задачи исследования.

1. Изучить в динамике хронического экспериментального эндотоксикоза у крыс характер тканевой перестройки в легких и гистотопографию развития пневмосклероза.

2. Показать изменения тканевого распределения макрофагов и миофибробластов легких, и их участие в новообразовании соединительной ткани в легких.

3. Выявить изменения иммуногистохимических маркеров тканевой перестройки, сопутствующих формированию пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе.

4. Выявить наиболее информативные количественные критерии развития пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе.

Научная новизна.

С помощью гистологических и количественных методов исследования показано, что формирование пневмосклероза при хроническом ЭТ не идет диффузно, а начинается с увеличения объемной доли соединительной ткани в области корня легкого и в каудальном направлении. В дальнейшем прирост соединительной ткани происходит преимущественно в периферических сегментах легких, а вблизи корня легкого - замедляется.

С помощью гистологических и иммуногистохимических методов показано, что количество и структурные признаки реакции макрофагов и миофибробластов легких территориально соответствуют зонам формирования пневмосклероза только на относительно ранних сроках его развития. Показано, что структурная перестройка сосудов в легких по своей выраженности и срокам развития следует за динамикой развития пневмосклероза.

Выявлены количественные морфологические признаки, основанные на раздельной морфометрии отдельных сегментов легких, позволяющие с высокой точностью оценивать динамику и характер формирования пневмосклероза по текущей гистотопографии соединительной ткани.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные расширяют современные представления о характере и динамике формирования пневмосклероза при хронической патологии, сопровождающейся эндотоксикозом.

Предложенные автором количественные критерии для оценки пневмосклероза имеют значение для повышения качества диагностики легочной патологии, выделяя компонент, связанный с развитием хронического ЭТ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Формирование пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе имеет морфологические особенности, позволяющие выделить изменения, опосредованные действием эндогенных токсических соединений.

2. Двухфазная динамика новообразования соединительной ткани в легких отражает особенности тканевого распределения ключевых клеток, принимающих участие в формировании пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе.

3. Иммуногистохимическое выявление и морфологический анализ тканевого распределения макрофагов, миофибробластов, а также экспрессии альфа-1-антитрипсина в легких позволяет уточнить характер и динамику прироста соединительной ткани в органе.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на 61-й итоговой конференции НОМУС Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2003), II Общероссийской конференции с международным участием «Проблемы морфологии» (Сочи, 2003), итоговой научной сессии Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2004), IV Научно-практической конференции молодых ученых мед. факультетов и университетов России (Тула, 2004), 10-й конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2005), научно-практической конференции «Совершенствование и развитие профилактического направления деятельности учреждений здравоохранения Волгоградской области» (Волгоград, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции» (Волгоград, 2005); 2-й Всероссийской заочной электронной конференции «Проблемы регенерации» (Курск, 2006); II съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006).

Апробация работы осуществлена на расширенном заседании сотрудников кафедры патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета 20 мая 2006 года.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 - в центральной печати.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Работа была выполнена на кафедре патологической анатомии (зав. кафедрой - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Б. Писарев) ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (ректор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.И. Петров).

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр патологической анатомии и судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета. Практические рекомендации используются в работе Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области, областного бюро судебно-медицинской экспертизы и областного патолого-анатомического бюро.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, иллюстрирована 40 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Список использованной литературы содержит 258 источников (95 на русском и 163 на иностранных языках).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием 57 белых крыс.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлено в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP), соответствует этическим нормам, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985) и в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики», Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. Программа экспериментов была согласована с Локальным независимым этическим комитетом по экспертизе диссертационных исследований (протокол № 11-2004 от 14 апреля 2004 года).

Патоморфологические изменения в легких были изучены в двух моделях хронического ЭТ в трех временных интервалах (табл. 1).

Таблица 1

Общая характеристика материала исследования по сериям

Группа	Характеристика серии	Кол-во животных
Контроль	контроль	9
Хроническое введение ТХМ + ЛПС	30 суток	9
	60 суток	9
	90 суток	9
Хроническое введение гентамицина + ЛПС	30 суток	9
	60 суток	6
	90 суток	6
Всего	57

Первой моделью хронического ЭТ стало многократное введение умеренных доз тетрахлорметана (ТХМ) и бактериального липополисахарида (ЛПС). Эта модель разработана проф. В.В.Новочадовым (2000) и с успехом используется на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета в течение 6 лет. Нами также использована у крыс следующая оригинальная модель хронического ЭТ: сочетанное введение гентамицина в дозировке 20 мг/кг ежедневно внутрибрюшинно и внутрибрюшинное введение ЛПС в дозе 0,2 мг/кг массы тела 1 раз в неделю. Сроки вывода животных из эксперимента составили 30, 60 и 90 суток с момента его начала.

В качестве интегральных лабораторно-биохимических показателей развития ЭТ было использовано определение веществ средней молекулярной массы (ВСММ), а также их олигопептидной фракции. Исследование проводили на двухлучевом спектрофотометре «Shimadzu» в диапазоне длин волн 210-320 нм, при постановке реакции на пептиды - при длине волны 584 нм [Малахова М.Я., 1995].

В модели с комплексным хроническим введением микробного ЛПС и ТХМ к 30 суткам концентрации ВСММ и их олигопептидной фракции регистрировались на уровне, превышающем аналогичные показатели в контрольной группе в 1,73 раза (P<0,05) и 3,05 раза (P<0,01), соответственно. Концентрации липидов ВСММ возрастали в 1,76 раза. В последующем содержание биохимических субстратов эндогенной интоксикации возрастало еще более и достигало к 90 суткам эксперимента 247% и 399% от соответствующих величин в контрольной группе (P<0,01).

Содержание ВСММ, их олигопептидной и липидной фракции в плазме крови животных в модели с сочетанным введением гентамицина и бактериального ЛПС было увеличено у всех животных, начиная с 30 суток эксперимента. Величины различных компонентов ВСММ превышали аналогичные значения у животных контрольной группы в 1,95-2,24 раза, что наглядно подтверждало развитие у них хронического ЭТ. Существенной динамики в отношении этих показателей на сроках эксперимента от 30 до 90 суток не прослеживалось.

Таким образом, в рассматриваемых экспериментальных группах наблюдались изменения содержания в плазме крови ВСММ, их олигопептидной и липидной фракций, сходные по направленности и выраженности. Это позволяет отнести их к вариантам хронического ЭТ с преимущественным повреждением печеночной или почечной паренхимы.

Морфологическому исследованию во всех сериях экспериментов были подвергнуты ткани легких. Изготавливали с четырех блоков каждого легкого гистологические препараты, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, суданом III, по ван Гизон, по Массону.

Для выявления пролиферативной активности в ткани легких использовали моноклональные антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA), десмину (D33), виментину, альфа-1-антитрипсину, макрофагальному антигену (НАМ56). Все наборы - фирмы DakoCytomation, Дания.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002]. Для этого использовали автоматическую систему обработки изображений «Видеотест-Морфо 3.0» (Россия). Она включала в себя исследовательский микроскоп Micros (Германия) с фотокамерой Pixera (Япония), компьютер с высокоразрешающим цветным принтером и программное обеспечение. Дифференцированному исследованию были подвергнуты участки вблизи корня, а также сегменты, расположенные в каудальном, краниальном и латеральном направлении от него. Рассчитывали объемные доли (мкм³/мкм³) воздуха альвеол, альвеолярного экссудата, соединительной ткани. При цитоморфометрии рассчитывали средние объемы (мкм³) эпителиоцитов и альвеолярных макрофагов, их ядер.

Математическую обработку данных проводили непосредственно из общей матрицы данных EXEL 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ STATGRAPH 5.1 (Microsoft, USA). Она включала определение показателей средней, среднеквадратичного отклонения и ошибки репрезентативности. Для наглядности в необходимых случаях рассчитывали показатели интенсивности роста и прироста на каждом сроке эксперимента [Зайцев В.М., с соавт., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика роста соединительной ткани.

При моделировании хронического ЭТ введением ТХМ и ЛПС на 30-е сутки эксперимента легкие были представлены чередующимися полями эмфиземы, дистелектаза и очагов формирующегося пневмосклероза. Межальвеолярные перегородки были значительно и неравномерно утолщены, что происходило как за счет лимфогистиоцитарной инфильтрации ткани, так и за счет увеличения количества соединительнотканных элементов. Просвет альвеол был свободным, единичные клетки и скопления слизи локализовались преимущественно пристеночно.

Стенка бронхов содержала все слои, но мышечные волокна были атрофированы, окраска их была бледной. Между миоцитами нередко обнаруживались скопления лимфоцитов. В просвете бронхов выявлялись скопления слизи, местами - густо инфильтрированные лимфоцитами и напоминающие по внешнему виду гнойные массы. Такие скопления частично закупоривали просвет отдельных бронхов.

При окраске суданом III липиды выявлялись исключительно в цитоплазме макрофагов в виде многочисленных мелких и более крупных капель, при слиянии принимающих форму полумесяца. Липид-содержащая выстилка альвеол была резко деформирована, содержала складчатости, в отдельных местах липидные массы концентрировались в просвете альвеол.

Новообразование соединительной ткани выявлялось при окраске по ван Гизон, при которой элементы фибротизации отчетливо имели перибронхиальное распространение. В связи с относительно большей плотностью бронхиального дерева вблизи корня легких и в каудальном направлении интенсивность пневмосклероза заметно возрастала в последовательности краниальные области < латеральные < каудальные < область корня легкого. Билатеральной диссиметрии в интенсивности пневмофиброза не выявлялось.

При хроническом ЭТ, вызванном введением гентамицина и бактериального ЛПС картина была в принципе сходной, что отражало общность их пато- и морфогенеза. Легкие имели также неравномерную воздушность: часть альвеол была эмфизематозно расширена до разрывов со слиянием соседних альвеол, часть - с уменьшенным просветом за счет увеличения объема межальвеолярных перегородок.

При окраске по ван Гизон подтверждалось диффузное формирование соединительной ткани, которая, как и в предыдущей серии опытов, присутствовала на срезах не вполне равномерно. Наиболее интенсивно рост соединительной ткани отмечался в прикорневых областях и в каудальном направлении. При окраске по Массону выявлялось, что очаги соединительной ткани в этих местах была представлена рыхлой коллаген-содержащей стромой с небольшим количеством неплотно расположенных фибробластов и не меньшим числом макрофагов.

Таким образом, на 30-е сутки процесса наиболее яркими изменениями в легких являлись утолщения межальвеолярных перегородок. Этот феномен, наш взгляд, имел комплексное происхождение и объяснялся сочетанием следующих процессов: сосудистыми нарушениями, макрофагальной реакцией, пролиферацией фибробластов и накоплением коллагеновых волокон.

В крупных фокусах ателектаза все эти процессы имели максимальную выраженность. В то же время отмечалась регенерация поврежденного ранее альвеолярного эпителия. В альвеолярных макрофагах и фибробластах липиды обнаруживались в виде мелкокапельных включений, количество которых было тем больше, чем ближе клетка располагалась к капилляру. Отмечалось явные различия в интенсивность формирования пневмофиброза, причем наиболее выражено эти процессы протекали в областях легких, прилегающих к корню. В группе с введением ТХМ и ЛПС вышеописанные процессы были выражены в несколько большей степени, по сравнению с аналогичными в группе с введением гентамицина и ЛПС.

На 60-е сутки картина хронического легочного повреждения нарастала. Эмфизематозные и ателектатические участки чередовались по всем областям органа, в зонах ателектаза в большом количестве присутствовала соединительная ткань. Диаметр просвета многих альвеол становился сопоставимым с размерами межальвеолярной перегородки.

При окраске суданом III выявлялись многочисленные включения липидов в цитоплазме альвеолярных макрофагов, в межклеточном пространстве появлялись лишь отдельные внеклеточные скопления липидов. Липидная выстилка альвеол была видимой и прокрашивалась неравномерно.

В легких появлялись участки массивного склероза, через которые проходили деформированные бронхи. Смешанный экссудат и скопления слущенного эпителия в просвете бронхов частично организовывались, значительно сужая и даже обтурируя просвет бронха. Различия в интенсивности новообразования соединительной ткани по различным областям легких несколько сглаживались.

Следовательно, к 60-м суткам в легких продолжалось формирование соединительной ткани. В этот период несколько ослаблялось перибронхиальное и периваскулярное формирование пневмофиброза, но отчетливо выявлялся прирост истинной соединительной ткани в межальвеолярных перегородках. По уровню индукции фиброгенеза в тканях легких экспериментальные группы практически не различались между собой.

К 90-м суткам эксперимента в легких крыс с хроническим ЭТ, вызванным ТХМ и ЛПС явления пневмофиброза были выражены в значительно большей степени. Единичные альвеолы на срезах были отделены тканью, превышавшей их просвет в 1,5-2,0 раза. Ткань межальвеолярных перегородок выглядела неоднородной и представляла собой чередующиеся между собой участки рыхлой соединительной ткани с умеренно полнокровными сосудами и лимфогистиоцитарными инфильтратами.

При окраске суданом III в макрофагах обнаруживалось большое количество липидных капель, между клетками выявлялись крупнокапельные скопления липидов. Липид-содержащая выстилка альвеол была утолщена, а в части альвеол - отслоена и деформирована. Липиды обнаруживались в слизи, окружающей скопления клеток в просвете бронхов и альвеол, вокруг мелких сосудов легочного интерстиция.

При окраске по ван Гизон было хорошо заметным дальнейшее нарастание фиброгенеза в ткани легкого. В противовес ранним срокам опыта, более массивные и плотные участки соединительной ткани обнаруживались в областях легких, расположенных в латеральном и каудальном направлении от корня легкого.

На 90-е сутки ЭТ, вызванного введением гентамицина и ЛПС, изменения в легких носили еще более выраженный характер. Явления пневмосклероза нарастали, так что эмфизематозность альвеол частично уменьшалась, а многие из них были полностью спавшимися. Изменялся клеточный состав экссудата межальвеолярных перегородок. Помимо поврежденных и частично атрофированных эпителиоцитов, гипертрофированных макрофагов, в межальвеолярной перегородке присутствовали также лимфоциты и немногочисленные клетки гранулоцитарного ряда, преимущественно нейтрофилы. Характер распределения соединительной ткани в различных областях легких не отличался от такового в серии с введением ТХМ и ЛПС.

Таким образом, в поздние сроки опыта лидирующим процессом в ткани легких являлся диффузный интерстициальный фиброз. Происхождение последнего было связано как с нарастанием количества фибробластов и компонентов соединительнотканной стромы, так и с активным спадением просвета альвеол. Вследствие обструктивных процессов часто обнаруживались кистозные полости по типу "сотового легкого". В склерозированой ткани и даже в просвете спавшихся альвеол обнаруживались макрофаги, лимфоциты, плазматические и тучные клетки. Особого внимания заслуживала перестройка сосудистой сети, характерная для этого периода времени. Капилляры межальвеолярных перегородок по большей части запустевали, но в очагах соединительной ткани формировалось богатое микроциркулярное русло, не имеющее отношения к аэрогематическому барьеру.

Сравнение двух моделей ЭТ свидетельствовало о том, что на этих сроках более развернутые процессы тканевой перестройки ткани легких происходят при сочетанном введении бактериального ЛПС и гентамицина.

Морфометрические данные дополнили и подтвердили результаты гистологического исследования (табл. 2).

В группе с хроническим ЭТ, вызванном введением ТХМ и ЛПС, при проведении морфометрии выявлено выраженное снижение воздушности альвеолярной ткани: с 60% у животных группы сравнения до 38% - у крыс с хроническим ЭТ. Значительно возрастала объемная доля соединительной ткани. Так, у интактных крыс объем соединительной ткани составлял лишь 0,8±0,2 мкм³/мкм³, у животных опытной группы на 30-е сут. - 12,1±1,0 мкм³/мкм³, а на 90-е сутки данный показатель составил 23,6±0,3 мкм³/мкм³.

Таблица 2

Показатели морфометрии легких при хроническом ЭТ у крыс (M±m)

Показатели	Контрольная группа	Хронический эндотоксикоз
		30 сут	60 сут	90 сут
Объемные доли, мкм3/мкм3: - воздуха альвеол - экссудата - соед. ткани Средние объемы ядер альвеолоцитов, мкм3	60,1±1,6 1,6±0,5 0,8±0,2 86,0±6,1	48,2±1,9* 2,6±0,8 12,1±1,0* 90,5±6,5	41,9±2,6* 2,0±0,9 20,1±0,3* 84,8±5,0	38,5±2,2* 2,3±0,6 23,6±0,3* 83,5±4,3

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе

Поскольку качественный анализ выявил различия в темпах и характере прироста соединительной ткани по нескольким условным областям легких, отличающихся близостью к крупным сосудам, бронхам, внутрилегочным лимфатическим фолликулам и т.п., для таких областей показатель ОД соединительной ткани, был повторно рассчитан с использованием окраски по ван Гизон (табл. 3).

Как следует из приведенных данных, если на начальных сроках опыта ОД соединительной ткани была наибольшей в прикорневых и каудальных областях легких, то в последующем по данному показателю достоверных различий уже не наблюдалось. В краниальных и латеральных областях легких между 30 и 90 сутками эксперимента наблюдалось более выраженное приращение ОД соединительной ткани, в то время как в областях, где она формировалась ранее прирост несколько замедлялся, а в области корня легкого между 60-ю и 90-ми сутками - практически отсутствовал.

Сопоставление относительных объемов (рис. 1) соединительной ткани в легких по срокам эксперимента и отделам органа выявил ряд интересных моментов.

Таблица 3

Объемная доля соединительной ткани (мкм³/мкм³) в различных областях легких при хроническом ЭТ у крыс (M±m)

Отделы легких	Контрольная группа	Хронический эндотоксикоз
		30 сут	60 сут	90 сут
Краниальные Латеральные Каудальные Прикорневые	0,6±0,1 0,7±0,1 0,8±0,2 3,1±0,4	5,1±0,2* 6,1±0,4* 12,1±0,6* 16,2±0,8*	7,8±0,4*# 12,5±0,7*# 20,1±0,3*# 22,4±1,0*#	19,0±1,2*# 22,5±1,1*# 23,6±0,3*# 25,0±0,8*

* - достоверные различия с показателями в контрольной группе,

# - с показателями на предыдущем сроке эксперимента

Рис. 1. Показатели интенсивности роста соединительной ткани в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята объемная доля соединительной ткани в данном отделе легких у крыс контрольной группы.

пневмосклероз хронический эндотоксикоз

Из графика видно, что интенсивность роста соединительной ткани была практически равномерной и высокой в каудальных отделах легких, нарастание интенсивности было характерно для краниальных и латеральных областей легких, а низкая и не возрастающая во времени интенсивность - для областей возле корня легких.

Анализ показателей прироста соединительной ткани свидетельствует о том, что максимальная инициализация фиброгенеза имеется на 30-е сутки эксперимента, в то время как в дальнейшем показатели прироста становятся малыми, а для каудальных и прикорневых отделов легких к 90-м суткам - практически отсутствуют.

Иммуногистохимическое исследование.

На 30-е сутки хронического ЭТ, вызванного введением ТХМ и ЛПС, в легких выявлялась гиперэкспрессия макрофагальных антигенов. Макрофаги располагались периваскулярно, а также в толще межальвеолярных перегородок, образуя группы по две-три клетки. При сравнении плотности распределения макрофагов по отдельным областям легких обращало на себя внимание преобладание их в периферических отделах, тогда как вблизи корня легкого в толще соединительной ткани выявлялись лишь единичные клетки. При хроническом ЭТ, вызванном введением гентамицина и ЛПС, существенных отличий в характере тканевого распределения, численной плотности по отделам легких, по сравнению с вышеописанной серией опытов не было выявлено.

К 60-м суткам ЭТ количество макрофагов в легких несколько увеличивалось, в сравнении с предыдущими сроками эксперимента. НАМ-56-позитивные клетки обнаруживались в виде больших периваскулярных скоплений, а также в толще новообразованной соединительной ткани. Макрофаги были крупными, с большим количеством иммунопозитивного материла в цитоплазме клеток.

На поздних сроках опыта (90 суток) существенных отличий в распределении и характере расположения альвеолярных макрофагов не наблюдалось. В стенках бронхов и вокруг крупных сосудов, в сравнении с предыдущим сроком опыта, количетсво макрофагов даже несколько уменьшалось, хотя это были, по-прежнему, крупные клетки, расположенные группами по 5-6 и более.

Еще одной особенностью экспрессии макрофагального антигена в легких на поздних сроках ЭТ являлось отсутствие центро - плеврального градиента распределения макрофагов. степени нивелировались.

Достоверное увеличение размеров ядер макрофагов (до 903,6±46,1 мкм³) по сравнению с ядрами макрофагов интактных животных (666,9±37,8 мкм³, р<0,001), свидетельствовало о возрастании их функциональной активности на высоте эндогенной интоксикации. Для доказательства гистотопографических различий в динамике макрофагальных реакций была применена раздельная морфометрия макрофагов в четырех ранее описанных отделах легких. Наибольшая экспрессия иммунопозитивного материала выявлялась в областях легких, расположенных в латеральном и каудальном направлении от корня органа. При этом максимальный прирост экспрессии был характерен для периода от 30 до 60 суток эксперимента. К 90-м суткам существенной динамики не отмечалось, а в отношении корня легкого показана некоторая тенденция к уменьшению экспрессии НАМ-56. Более показательными эти изменения выглядели при использовании показателей интенсивности роста экспрессии НАМ-56 (рис. 2).

Рис. 2. Показатели интенсивности роста экспрессии НАМ-56 в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята интенсивность свечения по шкале RGB

Из графика интенсивности роста видно, что альвеолярная реакция при хроническом ЭТ была более выражена в латеральных и каудальных отделах легких, в то время как в краниальных отделах - была выражена весьма умеренно. Анализ показателей прироста экспрессии НАМ-56 свидетельствует о том, что максимальная наиболее выраженное увеличение макрофагальной реакции наблюдалось в первые 30 суток эксперимента, а между 60-ю и 90-ми сутками показатель прироста повсеместно менял свой знак на противоположный. Это свидетельствует о постепенном снижении роли макрофагальных реакций по мере увеличения сроков хронической эндогенной интоксикации.

Десмин-позитивные клетки выявлялись в норме в мышечных слоях бронхов, терминальных бронхиол, артерий и артериол, а также в виде единичных миофибробластов в интерстиции и межальвеолярных перегородках.

На 30-е сутки хронического ЭТ, в утолщенных межальвеолярных перегородках такие клетки образовывали группы по 5-6, окруженные макрофагами. Именно такие клетки были рассмотрены как центры формирования заместительного пневмофиброза. В последующем при хроническом ЭТ, вызванном введением ТХМ и ЛПС (в меньшей степени - при процессе, вызванном введением гентамицина и ЛПС) мы наблюдали расширение тяжей, содержащих миофибробласты, которые располагались вне зон прохождения крупных сосудов и, следовательно, являлись результатом пролиферации миофибробластов в местах формирующегося пневмосклероза.

На 90-е сутки хронического ЭТ экспрессия десмина выявлялась практически только в миоцитах стенок артерий и бронхов, отражая их патологические изменения под действием нарастающего пневмофиброза. С этой точки зрения, изменения мышечного слоя сосудов можно было признать более выраженными при введении ТХМ и ЛПС, в сравнении с моделью введения гентамицина и ЛПС.

Виментин был использован в работе как маркер истинных соединительнотканных клеток -фиброцитов и фибробластов. На ранних сроках ЭТ, вызванного введением ТХМ и ЛПС (30-е сутки), виментин экспрессировался в единичных клетках в составе утолщенных межальвеолярных перегородки, а также в фибробластах соединительнотканных перегородок и каркаса ложа крупных сосудов и бронхов. Интерес представляли клетки новообразованной соединительной ткани. которые образовывали короткие тяжи по 4-5 клеток или полукольца, охватывающие артериолы или терминальные бронхиолы. При хроническом ЭТ, вызванном введением гентамицина и ЛПС, к 30-м суткам новообразование соединительной ткани шло аналогичными темпами и по характеру было явно диффузным, так что имелась развитая трехмерно организованная соединительная ткань в составе утолщенных межальвеолярных перегородок. Ход фибробластов в составе естественных соединительнотканных тяжей по ходу бронхов и сосудов легкого, напротив, нарушался, здесь присутствовали элементы разволокнения и частичной деградации ткани.

В более поздние сроки ЭТ виментин-позитивные клетки образовывали обширные группы, их форма все чаще соответствовала зрелым коллаген-продуцирующим фибробластам, между клетками имелись тяжи коллагена. Характер экспрессии виментина по отделам легких в качественном отношении в зависимости от модели ЭТ существенно к 90-м суткам эксперимента не различался.

При исследовании тканевого распределения виментина по показателям интегральной яркости в селектированной фазе было выявлены гистотопографические различия по отделам легких. Как видно из представленных данных, наибольшая экспрессия виментина выявлялась к 30-м суткам в каудальных и прикорневых областях легких. Между 30-ми и 60-ми сутками эксперимента наблюдалось выраженное увеличение экспрессии виментина также в латеральных областях, а между 60-ми и 90-ми сутками эксперимента существенной динамики во всех исследуемых областях не отмечалось.

Для оценки выраженности и направленности процесса формирования фибробластов в легких были рассчитаны показатели интенсивности роста и темпов прироста экспрессии виментина (рис. 3).

Устойчивый рост интенсивности экспрессии наблюдался в латеральных отделах легких, был постоянно высоким - в каудальных отделах, в то время как в области корня легкого рост экспрессии виментина отмечался только на ранних сроках хронического ЭТ. При анализе показателей прироста было отмечено, что максимальная динамика была характерны для экспрессии виментина в каудальных и прикорневых отделах легких в первые 30 суток процесса, в то время как для латеральных отделов легких был характерен умеренный, но постоянный прирост в течение 60-ти суток эксперимента, а для краниальных отделов - умеренные и убывающие во времени темпы прироста экспрессии виментина.

Рис. 3. Показатели интенсивности роста экспрессии виментина в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята интенсивность свечения по шкале RGB в данном отделе легких у крыс контрольной группы.

Способность различных клеток легочной паренхимы к регенерации и, в определенной степени, скорость пролиферации новообразованной содеинительной ткани изучали путем анализа тканевой экспрессии PCNA.

Анализ клеток, иммунопозитивных к PCNA, показал, что на ранних сроках хронического ЭТ (30 суток) преимущественно пролиферируют и/или подвергаются репарации альвеолярные макрофаги (что подтверждено при использовании моноклональных антител к НАМ-56), высоким пролиферативным потенциалом обладают клетки в составе инфильтрата перегородки. Существенной экспрессии PCNA в эпителиоцитах межальвеолярной перегородки не выявлялось, за исключением единичных клеток, что соответствовало естественному (физиологическому) уровню тканевой регенерации. В сравнительном плане между сериями (ТХМ + ЛПС и гентамицин + ЛПС) каких-либо различий не выявлено.

В более поздние сроки опыта экспрессия PCNA в макрофагах была не столь заметной, а в эпителиоцитах - практически не определялась. Иммунопозитивными оказывались группы фибробластов в новообразованной соединительной ткани, а также миофибробласты, что было подтверждено при сопоставлении параллельных серийных срезов с использованием окрасок на виментин и десмин. При этом эспрессия PCNA выявлялась более чем у половины указанных клеток.

Сравнительное иммуногистохимическое исследование различных отделов легких показало, что наиболее выраженная экспрессия PCNA наблюдается вблизи корня легкого, в то время как субплевральные участки практически не реагируют этими компенсаторными изменениями на хроническую эндогенную интоксикацию.

Этот момент был отнесен нами к негативным последствиям интоксикации и рассмотрен в качестве одного из признаков, свидетельствующих о необратимости процесса повреждения ткани легких.

Раздельный подсчет процента иммунопозитивных к PCNA клеток выявил ряд особенностей. Показатели представлены в табл. 4.

Таблица 4

Процент иммунопозитивных к PCNA клеток в легких при хроническом эндотоксикозе (M±m)

Клетки	Контрольная группа	Хронический ЭТ
		30 суток	60 суток	90 суток
Эпителиоциты Макрофаги Фибробласты Миофибробласты	3,1±0,4 11,5±0,9 4,0±0,3 7,5±0,8	5,5±0,8 24,3±1,9* 17,9±1,4* 19,5±2,0*	7,2±0,9* 58,9±4,3* 33,8±2,0* 14,2±0,9*	1,8±0,3* 21,2±1,7* 38,4±4,0* 4,2±0,5*

*- достоверность по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе при Р<0,05

Как видно из представленных данных, экспрессия PCNA в количественном отношении была умеренно повышена только на 30-60-х сутках эксперимента, но и в это время антиген присутствовал только не более чем в 7,2% клеток. Процент иммунопозитивных макрофагов также варьировал по срокам, превышая при этом показатель контрольных крыс в 2-4 раза: его максимум приходился на 60-е сутки хронического ЭТ, а в последующем фиксировалось достоверное уменьшение. Миофибробласты и фибробласты имели принципиально различную динамику экспрессии PCNA: процент иммунопозитивных фибробластов непрерывно возрастал по срокам эксперимента, в то время как процент иммунопозитивных миофибробластов увеличивался только на 30-е сутки, а в последующем прогрессивно снижался, составляя к 90-м суткам процесс только 45% от такового показателя в легких крыс контрольной группы.

При исследовании экспрессии альфа-1-антитрипсина (ААТ) у животных контрольной группы в легких белок хорошо выявлялся по поверхности бронхиальной выстилки и в бронхоальвеолярной жидкости, а также БАЖ, в тонком слое альвеолярной выстилки и альвеолярных макрофагах. Вокруг некоторых макрофагов наблюдалось диффузное прокрашивание интерстиция, свидетельствующее о высокой антитриптической активности.

В ранние сроки эксперимента количество ААТ в легких было заметно больше, по сравнению с таковым в интактным органом, в просвете альвеол и вокруг гипертрофированных макрофагов обильно выявлялся иммунопозитивный материал.

На 60-е сутки эксперимента экспрессия ААТ в легких оказывалась значительно сниженной, лишь небольшие количества ААТ выявлялись на поверхности альвеолярного эпителия. Участки легкого вблизи артерий слабо окрашивались на ААТ. К 90-м суткам хронического ЭТ материал, иммунопозитивный на ААТ а легких практически не обнаруживался.

Для сопоставления с другими факторами, участвующими в формировании соединительной ткани, было проведено раздельное вычисление интегральной яркости выделенной фазы ААТ по отделам органа. Максимальная экспрессия наблюдалась в каудальных отделах легких на 30-е сутки эксперимента, в других отделах увеличение на этих сроках ЭТ было менее выражено. Начиная с 60-х суток опыта, экспрессия ААТ прогрессивно уменьшалась повсеместно, составляя к 90-м суткам хронического ЭТ менее половины от аналогичного показателя у животных контрольной группы.

Для оценки выраженности и динамики антитриптической активности в легких были рассчитаны показатели интенсивности роста и темпов прироста экспрессии ААТ.

Как видно из рис. 4, выраженный рост интенсивности экспрессии ААТ наблюдался во всех отделах легких, за исключением прикорневых, только на 30-е сутки хронического ЭТ.



Рис. 4. Показатели интенсивности роста экспрессии виментина в различных отделах легких при хроническом эндотоксикозе. За единицу по оси ординат принята интенсивность свечения по шкале RGB в данном отделе легких у крыс контрольной группы.

В последующим в этих отделах и вблизи корня показатели интенсивности были менее единицы, что свидетельствовало о снижении экспрессии ААТ в динамике хронического ЭТ.

При анализе показателей прироста было отмечено, что положительная динамика экспрессии ААТ была характерна прежде всего для каудальных отделов легких в первые 30 суток процесса. В последующем было характерно прогрессивное уменьшение (отрицательные показатели прироста), причем снижение активности ААТ происходило повсеместно, но более - там, где предшествующий подъем был максимальным (каудальные отделы), и меньше - где прирост был незначительным (вблизи корня).

Таким образом, иммуногистохимическое исследование выявило ряд особенностей тканевого распределения макрофагов, фибробластов, антитриптической активности, а также экспрессии PCNA, которые могут после соответствующего анализа быть представлены в обосновании механизмов формирования пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе.

Суммируя, укажем наиболее интересные моменты собственных результатов.

Во-первых, формирование соединительной ткани в легких при хроническом эндотоксикозе, вызванном ТХМ и ЛПС (ведущий механизм - хроническая печеночная недостаточность и недостаточное обезвреживание эндогенных токсических соединений) и процессе, вызванном гентамицином и ЛПС (ведущий механизм - хроническая почечная недостаточность и недостаточная элиминация эндогенных токсических соединений), имеет сходную динамику и выраженность. В первые 30 суток процесс идет преимущественно периваскулярно и перибронхиально, в поздние сроки хронического ЭТ доминирует периферический рост соединительной ткани.

Далее, имеются существенные различия в выраженности и динамике роста соединительной ткани в краниальных, латеральных, каудальных и прикорневых отделах легких, что не в полной мере объяснимо различиями васкуляризации и строения бронхиального дерева.

Наконец, при иммуногистохимическом исследовании также выявляются гистотопографические различия в выраженности и динамике экспрессии антигенов, маркирующих клетки-участники формирования пневмофиброза.

Резюмируя представленные данные и обсуждение, мы можем вилеть в легких два основных механизма формирования соединительной ткани при хроническом ЭТ.

Первый механизм, характерный для относительно ранних сроков процесса (в наших опытах - до 30 суток) инициализируется за счет подост-рого сосудистого повреждения с последующим прямой и эндотелий-опосредованной активации альвеолярных, перибронхиальных и интерсти-циальных макрофагов. Особенности сосудистой и макрофагальной гистото-пографии в легких обеспечивают в этот период максимально выраженный прирост соединительной ткани в сегментах легких, расположенных в латеральном и каудальном направлении от корня легкого. Сам характер пнев-москлероза в этот момент в основном - мелкоочаговый с выраженным пе-рибронхиальным и периваскулярным приростом соединительной ткани. Макрофаги, фибробласти и миофибробласты легких в этот период обладают сравнительно высоким регенераторным потенциалом, экспрессия ингибитора протеолиза альфа-1-антитрипсина - увеличена в областях максимального прироста соединительной ткани.

Второй механизм фиброгенеза характерен для более поздних сроков хронического ЭТ (в наших опытах - 60-90 суток), постепенно дополняет, а затем вытесняет первый. В его основе лежит постоянная и диффузная стимуляция фиброгенеза альвеолярными макрофагами и клетками лимфо-макрофагальных инфильтратов. Эти процессы выражены диффузно и примерно в равной степени во всех периферических сегментах легких. По своему характеру такая соединительная ткань менее стабильна, пролиферативный потенциал фибробластов и макрофагов в ней значительно меньше, а низкая экспрессия альфа-1-антитрипсина указывает на высокую активность процессов биодеградации матрикса соединительной ткани.

В прикорневых отделах легких процесс формирования соединительной ткани, несмотря на ее исходно большее представительство, не идет столь интенсивно на протяжении всех сроков эксперимента, что явно указывает на роль подвижности легких в поддержании микротравматизма альвеол и стимуляции новообразования соединительной ткани при хроническом ЭТ.

Важным моментом исследования стало то, что выявленные при хроническом ЭТ изменения имеют однотипный характер для двух моделей. Из это следует, что как в условиях ограничения обезвреживания эндогенных токсических соединений (модель ТХМ + ЛПС), так и при уменьшенном их удалении из организма (модель гентамицин + ЛПС) гематогенное проникновение в легкие токсинов обеспечивает сходное по выраженности и динамике повреждение, завершающееся тканевой перестройкой, формированием соединительной ткани и развитием пневмосклероза.

ВЫВОДЫ

1. При хроническом эндотоксикозе, вызванном тетрахлорметаном и бактериальным липополисахаридом (1) и гентамицином и бактериальным липополисахаридом (2), у крыс наблюдается однотипная тканевая перестройка легких с развитием диффузного и мелкоочагового пневмосклероза, что указывает на единую природу этого процесса. Его особенностями является более раннее (30-е суток эксперимента) новообразование соединительной ткани вблизи корня легкого и в сегментах, расположенных в каудальном направлении от него, а также более позднее и выраженное (60-90 суток) - во всех периферических сегментах легкого.

2. Формирование пневмосклероза в первые 30 суток хронического эндотоксикоза идет преимущественно за счет увеличения объема перибронхиальной и периваскулярной соединительной ткани, в котором принимают активное участие макрофаги бронхов и интерстиция, а также миофибробласты с высоким процентом среди них PCNA-позитивных клеток. В поздние сроки хронического эндотоксикоза прогрессирование пневмосклероза идет преимущественно за счет новообразования соединительной ткани в межальвеолярных перегородках при участии лимфомакрофагальных инфильтратов, а также альвеолярных макрофагов. Принципиальным моментом является образование к 90-м суткам эксперимента собственной сосудистой сети очагов пневмосклероза.

3. Начиная с 30-х суток хронического эндотоксикоза в межальвеолярных перегородках выявляется необратимое уменьшение количества эпителиоцитов с низким процентом PCNA-позитивных клеток, что указывает на частично заместительный характер формирующегося пневмосклероза на всех сроках хронического эндотоксикоза.

4. Активность альфа-1-антитрипсина в легких при хроническом эндотоксикозе имеет двухфазную динамику: двукратное увеличение экспрессии преимущественно в периферических сегментах легких в ранние сроки процесса и повсеместное прогрессирующее снижение - на сроках 60-90 суток. Низкая экспрессия альфа-1-антитрипсина является фактором нестабильности новообразованной соединительной ткани в легких и поддерживает необратимое формирование пневмосклероза.

5. Для оценки развития пневмосклероза при хроническом эндотоксикозе наиболее информативным является раздельный подсчет и сравнение объемной доли соединительной ткани и экспрессии виментина в сегментах легких, расположенных в различных направлениях от корня легкого и вблизи негоодсчет объемной доли соединительной ткани. Наличие собственных сосудов в соединительной ткани и низкая экспрессия альфа-1-антитрипсина являются признаками сформированного пневмосклероза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфометрия сердца и легких при ингаляции микробного липополисахарида // Материалы 61-й итоговой конференции НОМУС ВолГМУ. - Волгоград, 2003. - С. 150-151. (соавт. Д.Е. Марков).

2. Взаимосвязь нарушений обмена липидов и вторичного повреждения легких при хроническом экспериментальном эндотоксикозе // Успехи современного естествознания - 2003. - N5. - С. 81-82. (соавт. В.Б.Писарев, В.В.Новочадов).

3. Аккумуляция липидов в альвеолярных макрофагах в морфогенезе хронического эндотоксикоза // Успехи современного естествознания - 2003. - N8 - С. 113. (соавт. В.Б.Писарев, В.В.Новочадов).

4. Морфология легких при хроническом эндотоксикозе у кошек // Матер IV н.-пр. конференции мол. ученых мед. факультетов России. - Тула, 2004. - С. 29-30.

5. Темпы формирования пневмосклероза при различных моделях хронического эндотоксикоза // Морфология процессов индивидуального развития, адаптации и компенсации: Труды ВолГМУ. - Т. 62, вып.1. - Волгоград, 2005. - С. 52-55.

6. Механизмы развития пневмопатии при различных путях проникновения эндотоксинов в легочную ткань // Материалы Всероссийского симпозиума «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции»: Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. - 2005. - №1. - С. 34-35. (соавт. Ю.В. Дегтярь).

7. Морфометрия висцеральных ганглиев сердца и легких в условиях вегетативной дизрегуляции при хронической интоксикации. // Совр. наукоемкие технологии. - 2005. - №2. - С. 34. (соавт. Д.Ю. Гуров, А.Н.Горячев, Ю.В.Ярошенко).

8. Иммуногистохимическая характеристика межальвеолярной перегородки легких при хроническом ингаляционном отравлении // Материалы 10-й конференции молодых исследователей Волгоградской области. Напр. 16-17. - Волгоград, 2005. - С. 12-13.

9. Основные морфометрические критерии ингаляционных и неингаляционных повреждений легких // Матер. н.-пр. конф. «Совершенствование и развитие … здравоохранения Волгоградской области». - Волгоград, 2005. - С. 30-33. (соавт. С.И.Зайченко, В.В.Новочадов, Ю.В.Дегтярь).

10. Характеристика сосудистого компонента в токсическом повреждении легочной ткани // Успехи современного естествознания. - 2006. - N2. - С. 51. (соавт. Ю.В.Дегтярь, В.В.Новочадов).

11. Органопатология ингаляционных поражений бактериальными полисахаридами // Материалы II съезда Российского общества патологоанатомов. - М., 2006. - Т. 1. - С. 302-304. (В.В.Новочадов, А.Н.Горячев, И.В.Зарипова).

12. Механизмы формирования пневмосклероза при хроническом экспериментальном эндотоксикозе // «Морфогенез и регенерация: Материалы 2-й Всероссийской заочной электронной конференции. - Курск: КГМУ, 2006. - С. 8-10. (соавт. В.В.Новочадов).

Размещено на Allbest.ru