Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени

03.02.03 - микробиология

14.01.10 - кожные и венерические болезни

Мустафина Гульгена

Уфа - 2010

Работа выполнена на кафедре лабораторной диагностики Института последипломного образования и кафедре дерматовенерологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович

доктор медицинских наук, профессор Хисматуллина Зарема Римовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ворошилова Наталья Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Чеботарев Вячеслав Владимирович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Урогенитальный трихомониаз широко распространен в мире и повсеместно занимает одно из первых мест в структуре инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) [Дмитриев Г.А., 2005, Теличко И.Н., 2007, Schwebkehttp://jcm.asm.org/cgi/content/full/40/10/3681 - COR1 J.R. et al., 2006, Shafir S.C. et al., 2009]. В последние годы отмечаются определенные позитивные тенденции в динамике заболеваемости манифестными формами трихомониаза. Указанное, однако, сопровождается увеличением количества своевременно не выявленных субманифестных и, в особенности, бессимптомных вариантов этой патологии. По некоторым данным их удельный вес достигает 40-50% от общего числа больных трихомониазом [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. В этой связи, очевидно, что истинная ситуация, учитывающая все формы урогенитального трихомониаза, может характеризоваться и негативной направленностью.

Социальным последствием указанного является существенное ухудшение репродуктивного здоровья населения, что в последние годы рассматривается в качестве угрозы национальной безопасности России и послужило в соответствии с Постановлением Правительства РФ №715 от 01.12.2004г. основанием для отнесения трихомониаза к разряду социально значимых заболеваний. Всемирная организация здравоохранения 18 мая 2006г. на 59-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в отношении ИППП утвердила глобальную стратегию на 2005-2015гг. «Предотвращение и контроль инфекций, передаваемых половым путем», в связи с чем совершенствование диагностики урогенитального трихомониаза было обозначено в качестве одной из первостепенных задач дерматовенерологии. Вместе с тем клиническая дифференцировка указанного заболевания достаточно проблематична, поскольку симптоматика лишена специфики и может иметь место и при других инфекций передаваемых половым путем [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи распространенностью атипичных вариантов Trichomonas vaginalis [Дмитриев Г.А., 2003, Schwebkehttp://jcm.asm.org/cgi/content/full/40/10/3681 - COR1 J.R. et al., 2006], наиболее часто выявляемых у мужчин [Иванов АМ., 2005 и др.], учет которых в соответствии с приказом МЗ СССР №1570 от 04.12.1986г. не осуществляется должным образом.

Все вышеперечисленное в значительной степени снижает информативность, особенно у мужчин, традиционно применяемых методов микроскопии и культурального исследования [Марданлы С.Г. и др., 2007] и предполагает разработку новых, более совершенных методов лабораторной диагностики трихомониаза. Среди последних в качестве наиболее перспективных, как было показано на модели других инфекций урогенитального тракта, рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Caliendo A.M. et al., 2005]. Однако имеющиеся литературные данные относительно диагностики урогенитального трихомониаза этим методом крайне противоречивы [Дмитриев Г.А., 2003, Теличко И.Н. и др., 2006, Марданлы С.Г. и др., 2007, Caliendo A.M. et al., 2005, Mckechnie M.L. et al., 2009]. Указанное предопределило необходимость систематизации имеющихся данных и разработку четких клинико-лабораторных критериев для применения ПЦР в диагностике трихомониаза с учетом специфики преаналитического, аналитического и, безусловно, постаналитического этапов.

Цель исследования

Провести сравнительную оценку эффективности методов лабораторной диагностики трихомониаза у мужчин, установить информативность современных молекулярно-генетических диагностических технологий и обосновать показания к их практическому применению.

Задачи исследования

1 На основе клинико-эпидемиологических и социально-гигиенических признаков обосновать выделение группы обследуемых пациентов с урогенитальным трихомониазом, адекватной для оценки эффективности диагностических лабораторных тестов.

2 Провести сравнительный анализ информативности используемых в настоящее время методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.

3 Оптимизировать культуральный метод для сокращения сроков идентификации Trichomonas vaginalis.

4 На основе анализа банка генов подобрать и апробировать праймеры для детекции Trichomonas vaginalis методом классической полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.

5 Обосновать применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при диагностике урогенитального трихомониаза.

Научная новизна исследования

В результате проведенных исследований создана модификация питательной среды, позволяющая сократить сроки детекции Trichomonas vaginalis культуральным методом до 2 суток. Впервые в отечественных тест-системах подобраны и апробированы праймеры к гену 18S рРНК T.vaginalis. Данные праймеры могут быть использованы как для ПЦР в классическом варианте, так и ПЦР в реальном времени. Праймеры к гену 18S рРНК позволили повысить вероятность обнаружения Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции. Показаны преимущества применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики урогенитального трихомониаза, обусловленные высокой чувствительностью, возможностью количественного определения специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в исследуемом материале.

Научно-практическая значимость работы

Разработан алгоритм лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза, включающий полимеразную цепную реакцию у мужчин. Предложена модификация состава питательной среды для культурального исследования клинического материала и сконструированы праймеры для полимеразной цепной реакции, что позволило повысить эффективность лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям адекватной является группа больных с урогенитальным трихомониазом являются мужского пола в возрасте 20-29 лет, имеющих высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющих алкоголем (82,7%), часто пользующихся практикой незащищенного секса (55,5%).

2 Включение комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в состав питательной среды для культивирования Trichomonas vaginalis позволяет сократить сроки диагностики урогенитального трихомониаза культуральным методом.

3 Преимуществом классической полимеразной цепной реакции в сравнении с микроскопическим и культуальным методами диагностики урогенитального трихомониаза является выявление различных форм заболевания вне зависимости от выраженности у обследуемых пациентов воспалительного процесса, характера течения и длительности заболевания.

4 Использование полимеразной цепной реакции по конечной точке с праймерами TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis является высокоспецифичным тестом в диагностике урогенитального трихомониаза. Применение количественного варианта ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале.

Апробация

Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем» (Ишим, 2009); IV международном конгрессе, посвященном современным аспектам вспомогательных репродуктивных технологий «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)» (Москва, 2007); I региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX всероссийской конференции дерматовенерологов (Екатеринбург, 2006).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-микробиологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные в настоящем исследовании результаты внедрены и используются в научно-педагогической и лечебно-диагностической работе кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО и лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», ГУЗ «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 25 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 177 источников (64 отечественных и 113 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Динамика заболеваемости урогенитальным трихомониазом за 1991-2008 гг. оценивалась нами по данным Государственного учреждения здравоохранения «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.

Социально-гигиеническая характеристика 466 больных урогенитальным трихомониазом (225 женщин и 241 мужчина) осуществлялась через анонимное анкетирование с использованием разработанной нами анкетой.

Объектом исследования явился 361 пациент, из которых 253 больных урогенитальным трихомониазом составили основную группу, а 108 мужчин - группу контроля. Набор больных в группы сравнения проводился в соответствии с целью исследования. Включение в группы наблюдения обеспечивалось информированным согласием больных на проведение лечебно-диагностических процедур, выполнением пациентами указаний врача относительно назначенного обследования и терапии, а также воздержанием от незащищенных половых контактов на время исследования. Обязательными условиями исключения из групп наблюдения были тяжелые сопутствующие заболевания (онкологические болезни, системные заболевания), сифилис. Обнаружение N.gonorrhoeae, C.trachomatis, M.hominis, U.urealyticum, Candida не являлось основанием для исключения из групп наблюдения. Регистрировали общие сведения о больных, жалобы на момент поступления, данные урологического анамнеза, объективного осмотра, результаты клинико-лабораторных исследований. Все исследования проводили в соответствии с действующей нормативной документацией: приказами Минздрава России № 1570 от 04.12.1986 г., № 286 от 07.12.1993 г., № 64 от 21.02.2000 г., № 173 от 28.02.2005 г., протоколом ведения больных «Урогенитальный трихомониаз» (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005).

Материал для микроскопического, культурального, молекулярно-генетического исследования получали из уретры мужчин с урогенитальным трихомониазом. Перед забором биологического материала пациент воздерживался от мочеиспускания в течение 4-6 часов. У мужчин непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры обрабатывали марлевым тампоном. При отсутствии выделений проводили массаж уретры с помощью зонда для взятия материала. Затем универсальный зонд вводили в уретру на 3-4см и делали соскоб. Для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) отделяемое из мочеиспускательного канала переносили в пробирку («ЕРРЕNДОRF», Германия) c транспортной средой, содержащей фосфатный буфер, для микроскопии - на предметные стекла и культурального исследования - в пробирки с питательной средой (приказ Минздрава СССР № 936 от 12.07.85 г).

Визуально T.vaginalis обнаруживали бактериоскопическим методом при исследовании окрашенных по Граму микропрепаратов отделяемого из уретры.

Ультраструктурные особенности T.vaginalis исследовали с использованием электронной микроскопии (на базе ЦНИКВИ, г.Москва). Для этого готовили фиксированные в 4% растворе глютаральдегида на 0,1 М кокадилатном буфере (рН 7,2 - 7,4) препараты T.vaginalis [Абдумаликов Р.А., 1985], выделенных от больных с хронической формой заболевания. Накопление культур осуществляли инкубированием полученных клеток простейших в течение 3-х суток. Исследование ультраструктуры T.vaginalis проводили методом ультратонких срезов с последующим изучением на электронном микроскопе (JEM100S, Япония).

Для культурального исследования T.vaginalis применяли жидкую питательную среду (ООО НПФ «Диагност-мед», г.Омск). Инкубацию посевов проводили при температуре 37^oC в течение 3-6 дней. Подсчет клеток T.vaginalis проводили с использованием камеры Горяева. ПЦР использовали для верификации результатов микроскопии и культурального исследования при выявлении T.vaginalis с применением сертифицированного комплекта реагентов для ПЦР с детекцией методом электрофореза («ДНК-Технология», Россия). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR Inc., США), Oligo 4.1 (National Biosciences Inc., США).

Для детекции грибов Candida в отделяемом из уретры использовали микроскопию (окраска по Граму), культуральный метод (среда Сабуро). Для лабораторной детекции Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum использовали ПЦР («ДНК-Технология», Россия), иммуноферментный метод (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), Neisseria gonorrhoeae - бактериоскопический, культуральный метод, ПЦР («ДНК-Технология», Россия). Иммуноферментные исследования проводились для оценки этиологической значимости M.hominis, U.urealyticum с помощью тест-системы (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ, а также формул А.Е. Платонова (2000), О.Ю. Ребровой (2003). Статистические гипотезы считались подтвержденными при уровне значимости р<0,05. В случае нормального распределения данных вычисляли среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение (у, Sd). Для сравнения долевых показателей (%) использовали критерий - угловое преобразование Фишера (tц). При малочисленности групп и неясности закона распределения величин вычисляли медиану (Ме) и интерквартильный размах (а₁-а₃), для сравнения двух независимых групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U). Использовался также метод двухфакторного дисперсионного анализа. Для сравнения качественных признаков (n>20) применяли метод Х². Для проверки гипотез использовали показатели, выдаваемые расчетными модулями программы. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность, прогностическая ценность отрицательного и положительного результатов, разность рисков, коэффициент асимметрии результатов используемых лабораторных методов диагностики урогенитального трихомониаза рассчитывали с помощью четырехпольной таблицы Фишера [Платонов А.Е., 2000].

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Динамика заболеваемости урогенитальным трихомониазом среди мужского населения г.Уфы за наблюдаемые годы (1991-2008) характеризовалась различной направленностью линии тренда. С 1991 по 1999гг она имела выраженную неблагоприятную тенденцию. Указанное, очевидно, во многом было связано с началом существенных преобразований в обществе, значимой составляющей которых являлись поведенческие реакции среди сексуально-активной части населения. С 1999 года в динамике заболеваемости урогенитальным трихомониазом наметилась тенденция к снижению, что, по-видимому, было связано с обращением части больных в частнопрактикующие учреждения, самолечением в связи с широкой доступностью лекарственных средств и с одновременным увеличением частоты атипичных трудно - диагностируемых форм T.vaginalis. За наблюдаемые годы наиболее высокие уровни урогенитального трихомониаза отмечались у молодых мужчин 20-29 лет (рис.1). Уровень заболеваемости среди них статистически значимо превосходил значения в возрастных группах 18-19 и 30-39 лет. В период максимальной заболеваемости в 1999-2000гг (2425,2 ±36,5‰оо) ее интенсивность в этой группе более, чем в 3 раза, превосходила показатели 1991-1992 и 2005-2008 (728,7±21,7) и (670,1±13,7)‰оо, соответственно. В структуре заболевших на данную возрастную группу во все годы наблюдения приходилось около 60% от общего числа случаев заболевания урогенитальным трихомониазом.

По результатам проведенных нами социально-гигиенических исследований, среди опрашиваемых мужчин с урогенитальным трихомониазом доля молодых в возрасте 20-29 лет составила 45,6 процентов.

Рис. 1. Возрастная структура заболевших урогенитальным трихомониазом среди мужского населения г.Уфы по различным периодам наблюдений

При такой распространенности заболевания, согласно эпидемиологическим данным, диагностический тест с чувствительностью и специфичностью, равной 95% будет выявлять большинство инфицированных лиц [Флетчер Р., 1998]. Исследования данных анкетирования показали, что мужчин в возрасте 20-29 лет, больные урогенитальным трихомониазом в большинстве случаев имели высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляли алкоголем (82,7%), часто пользовались практикой незащищенного секса (55,5%).

На эффективность диагностических тестов в существенной мере влияет стадия и степень тяжести процесса. Исследования особенностей клинических проявлений урогенитального трихомониаза у мужчин выявило, что воспалительный процесс и тяжесть течения заболевания были выражены у больных 20-29 лет как при свежей, так и при хронической форме. При свежей трихомонадой инфекции в этой группе больных чаще были выражены такие клинические проявления, как выделения из половых путей (98,1%) и дискомфорт в уретре (66,1%). При хронической инфекции кроме вышеперечисленных признаков также часто отмечались дизурические расстройства (76,2%), ощущение жжения, зуда в области гениталий (23,8%), боли характерные для простатита (57,1%). Эти результаты позволили обосновать выделение в соответствии с принципами доказательной медицины группу пациентов с урогенитальным трихомониазом в возрасте 20-29 лет как адекватную для оценки эффективности диагностических тестов по чувствительности, специфичности и их прогностической ценности.

Следовательно, группа мужчин, больных урогенитальным трихомониазом в возрасте 20-29 лет является наиболее адекватной с эпидемиологической точки зрения моделью для оценки эффективности диагностических тестов по показателям чувствительности, специфичности и их прогностической ценности.

Далее нами проводилось сравнение информативности используемых в практической медицине прямых методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у мужчин - световой микроскопии, культурального метода и полимеразной цепной реакции. При этом учитывались топика (уретрит и/или уретропростатит), длительность заболевания (до 2 месяцев - свежая форма, более 2 месяцев - хроническая), степень воспалительного процесса (количество лейкоцитов в отделяемом) мочеполовых органов. При оценке степени выраженности воспалительного процесса в мочеполовых органах все обследуемые мужчины в зависимости от количества лейкоцитов в отделяемом из уретры были распределены на три группы. В первой группе (45 мужчин) - с содержанием лейкоцитов в отделяемом из уретры до 20 единиц в поле зрения включительно, во второй (43 мужчин) - от 21 до 50 единиц в поле зрения включительно, в третьей (19 мужчин) - более 50 единиц в поле зрения. В случае обнаружения атипичных форм трихомониаза проводили повторные исследования с использованием культурального метода. Отсутствие типичных форм трихомонад в цитологических препаратах и в культуральных исследованиях являлось основанием для исключения диагноза урогенитальный трихомониаз [Иванов А.М., 2004]. trichomonas vaginali урогенитальный трихомониаз

По полученным данным, при различной локализации процесса, форме, выраженности воспалительного процесса наибольшей диагностической эффективностью в отношении T.vaginalis у мужчин обладала полимеразная цепная реакция, характеризующаяся достаточно высокой чувствительностью (81,9%) и специфичностью (88,6%), прогностической ценностью положительного (93,6%) и отрицательного результатов (70,5%) по сравнению с микроскопическим и культуральным методами (табл.1).

Однако статистически достоверными отличия полимеразной цепной реакции по чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов при урогенитальном трихомониазе были только относительно микроскопии (p<0,01). Высокий показатель «разности риска» (64,1%) полимеразной цепной реакции свидетельствовал о высокой прогностической значимости результата данного метода, а высокий коэффициент асимметрии (35) - о значительной связи между прогнозом и исходом (наличием T.vaginalis у больного) исследования больного с урогенитальным трихомониазом.

Таблица 1 - Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза

Примечание:

^¦ Различие с данными микроскопического метода статистически значимо (p<0,01).

^¦¦ Различие с данными микроскопического метода статистически значимо (p<0,001).

ДЭ - диагностическая эффективность, ПЦ "-" - прогностическая ценность отрицательного результата, ПЦ"+" - прогностическая ценность положительного результата, РР - разность рисков, КА - коэффициент асимметрии.

Наличие ложноотрицательных (18,1%) результатов при проведении полимеразной цепной реакции, возможно, было связано с недостаточным количеством T.vaginalis в биоматериале, а ложноположительных (11,4%) - контаминацией отрицательных образцов при проведении исследования.

Чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата у культурального и микроскопического методов увеличивались с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры, а специфичность и прогностическая ценность положительного результата - уменьшалась (p>0,05).

Следовательно, с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из

уретры у мужчин больных урогенитальным трихомониазом вероятность получения ложноположительных результатов культуральным и микроскопическим методами увеличивается. Комбинированное использование культурального и микроскопического методов диагностики также не исключает возможности завышения и занижения частоты выявляемости T.vaginalis за счет методических особенностей данных лабораторных исследований.

Комплексное применение прямых лабораторных методов обнаружения T.vaginalis позволило существенно увеличить вероятность обоснованности заключений о наличии или отсутствии возбудителя в организме.

Высокая диагностическая эффективность, специфичность, чувствительность, прогностическая ценность отрицательного и положительного результатов позволяют рекомендовать использование ПЦР для лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у мужчин. На основании этих результатов нами были разработаны алгоритмы диагностики урогенитального трихомониаза, включающие молекулярно-генетические методы (ПЦР).

На следующем этапе нами были проведены электронно-микроскопические исследования клинических штаммов T.vaginalis от больных с хроническим трихомониазом, позволившие оценить степень полиморфности возбудителя. По нашим данным, клинические штаммы T.vaginalis при хроническом трихомониазе электронно-микроскопически характеризовались выраженной вакуолизацией, преобладанием электронно-прозрачных, лишенных содержимого везикул неправильной формы. Гидрогеносомы T.vaginalis значительно варьировали по размерам, форме и плотности содержимого, располагались хаотично по всему объему клетки. Эти данные указывают на формирование выраженных морфо-функциональных изменений у T.vaginalis при хронизации процесса, что осложняет традиционную лабораторную диагностику заболевания. В связи с этим представилось необходимым усовершенствование референтного метода диагностики урогенитального трихомониаза, которым является культуральный.

Культуральная диагностика урогенитального трихомониаза с использованием стандартных питательных сред отличается необходимостью продолжительной инкубации T.vaginalis (в среднем до 3-4 суток), существенно зависящей от величины посевной дозы. В связи с этим для сокращения сроков идентификации T.vaginalis культуральным методом нами была разработана собственная модификация состава питательной среды для кутивирования возбудителя. С этой целью в 5 мл жидкой питательной среды для выделения T.vaginalis (ООО НПФ «Диагност-мед», Россия) нами был добавлен комплекс железа [III] гидроксида полиизомальтозата (0,03 г) в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения). Применение данного состава питательной среды приводило на вторые сутки культивирования при температуре 37^oС к накоплению клеток в культуре до (6,5±2,1)х10³кл/мл, тогда как на контрольной среде в этот срок содержание T.vaginalis составило только (4,3±1,2)х10³кл/мл (p<0,01, рис.2).

Рис. 2. Сравнительная характеристика накопления T.vaginalis при их культивировании на модифицированной и контрольной среде. Ось ординат - количество клеток T.vaginalis (х10³ кл/мл), ось абсцисс - сроки инкубации (сутки).

На контрольной среде (ООО НПФ «Диагност-мед», Россия) максимальное накопление культуры T.vaginalis отмечалось на 3-и сутки в среднем до (5,3±1,4)х10³ кл/мл. При этом на 4-е сутки культивирования отмечалось снижение количества клеток до (5,0±1,2)х10³ кл/мл.

Применение модифицированной среды для культивирования T.vaginalis способствовало максимальному накоплению клеток на 4-е сутки в среднем до (9,0±2,7)х10³кл/мл, а снижение их количества отмечалось - на 5-е сутки культивирования в среднем до (8,0±2,6)х10³кл/мл.

Таким образом, культивирование клеток на модифицированной среде позволило идентифицировать T.vaginalis уже на 2-е сутки наблюдения (p>0,01), что приводило к сокращению сроков диагностики урогенитального трихомониаза.

Чувствительность и специфичность другого прямого метода идентификации T.vaginalis - ПЦР - во многом обусловлена правильным выбором мишеней для амплификации [Ryu J.S., 1999]. Известно, что наиболее исследованным локусами в геномах простейших являются гены рибосомальных РНК, отличающихся мультикопийностью (254 копий 18S рРНК/на клетку T.vaginalis) [Carlton J.M., 2007]. Учитывая наличие данного локуса в геноме T.vaginalis, представился целесообразным подбор для «классической» ПЦР и ПЦР «в реальном времени» высокочувствительных праймеров, не обладающих перекрестным реагированием с человеческой ДНК.

С использованием данных банка-генов нами были сопоставлены последовательности генов 18SрРНК Dientamoeba fragilis, Pentatrichomonas hominis (abdominalis), T.tenax (elongata), T.vaginalis для конструирования специфичных праймеров, применимых при детекции T.vaginalis методом ПЦР в мазках и другом клиническом материале. В результате проведенных исследований и серий испытаний была определена соответствующая пара праймеров, специфичных к гену 18S pРНК T.vaginalis: TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?).

Наряду с геном 18S pРНК, наиболее исследованным, по данным литературы, является ген бета-тубулина T.vaginalis [Hardick J. et al, 2003]. Согласно данным литературы, ПЦР с праймерами BTUB9 и BTUB2 обеспечивает чувствительность равную 98%, в сравнении с культуральным методом системы InPouch, имеющую чувствительность равную 70% [Hardick J. et al, 2003]. В этой связи для оценки информативности нашей разработки нами наряду с праймерами к гену 18S pРНК были синтезированы и использованы праймеры к гену бета-тубулина T.vaginalis - BTUB9 (5'CA TTG ATA ACG AAG CTC TTT ACG AT3') и BTUB2 (5'GC ATG TTG TGC CGG ACA TAA CCAT3') (фирма SYNTOL, г. Москва).

Сравнительное исследование диагностических возможностей ПЦР по выявлению T.vaginalis показало, что чувствительность «классической» ПЦР была выше для праймеров TrVa11 и TrVa22 (к гену 18S рРНК T.vaginalis) (100%), чем для BTUB9 и BTUB2 (к гену бета-тубулина T.vaginalis) (83,9%) (p=0,023).

Параллельно с ПЦР, основанной на электрофоретической детекции, нами была осуществлена адаптация ПЦР для варианта “real-time” с праймерами BTUB9 x BTUB2 и TrVa11 x TrVa22 и применением интеркалирующего агента SYBR Green I.

При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9xBTUB2 кривые плавления ампликонов характеризовались наличием двух пиков (рис.3). Принадлежность каждого из пиков к определенной группе (T.vaginalis и неспецифическим продуктам) была установлена путем сравнения пиков плавления, при этом основной продукт амплификации плавился при температуре 85°C, а неспецифический продукт (димеры) - 78,5°C. Постамплификационный анализ кривых плавления ПЦР - фрагментов позволил провести дифференциацию полученных ампликонов за счет различий в температурах плавления.

При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa11 и TrVa22 кривые плавления ампликонов характеризовались наличием одного пика, что свидетельствовало о высокой степени их гомологии, при этом в контроле и в образце с человеческой ДНК соответствующие пики не наблюдались, что доказывает высокую специфичность праймеров.

Рис. 3. Кривые плавления ампликонов после проведения ПЦР с праймерами BTUB9 x BTUB2. Ось ординат - флюоресценция (нм), ось абсцисс - температура плавления (°С).

Количественный анализ содержания T.vaginalis в образце был проведен нами посредством метода ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa11 и TrVa22. Полученные данные позволили получить более достоверную информацию об исходной концентрации клеток T.vaginalis в образцах, полученных от больных. После 45 циклов ПЦР по конечной точке с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa 11 и TrVa22 при анализе результатов электрофоретического фракционирования по выраженности свечения обеспечивались лишь полуколичественные данные. ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa11 и TrVa22 позволила определить более четкие количественные различия в концентрации исходной матрицы в образцах. По индивидуальным для каждого образца графикам амплификации мы определяли количественные различия по содержанию исходной матрицы (генов 18S рРНК и бета-тубулина). Концентрации матрицы гена 18S рРНК в образцах отличались почти на один - три порядка (каждые 3.3 цикла различия в выходе кривой на логарифмическую стадию характеризовались 10 - кратной разницей концентрации матриц), а для некоторых образцов вход в логарифмическую фазу происходил на 19 и 32 циклах соответственно, при этом разница в 13 циклов давала различия в исходных концентрациях матриц почти на 4 порядка, то есть в 10 000 раз. Согласно нашим исследованиям, количественные различия между образцами с T.vaginalis по содержанию исходной матрицы гена бета-тубулина были незначительными. Так, разница количеств амплифицированных ДНК генов бета-тубулина T.vaginalis между образцами при выходе в логарифмическую фазу составила всего 6 циклов (27 и 33), то есть менее чем на два порядка (10²). Указанные различия количеств амплифицированной ДНК, возможно, объяснялись невысокой эффективностью ПЦР с праймерами к гену бета-тубулина при низких исходных концентрациях матрицы, что свойственно тест-системам, предназначенным для детекции уникальных или слабоповторенных генов, присутствующих в единичных копиях в геномах выявляемых патогенов.

Чувствительность ПЦР в реальном времени с использованием праймеров TrVa11 и TrVa22 (100%) была сопоставима с чувствительностью классического варианта ПЦР с указанными праймерами. При использовании праймеров BTUB9 и BTUB2 чувствительность ПЦР в реальном времени составляла 90,3%, что было выше, чем у «классической» ПЦР с этими же праймерами (83,9%) (p>0,05). Вместе с тем, ПЦР в реальном времени с использованием праймеров TrVa11 и TrVa22 была более чувствительной, нежели с праймерами BTUB9 и BTUB2, в связи с большим содержанием копий гена 18S рРНК в T.vaginalis и меньшим исходным количеством копий гена бета-тубулина.

Таким образом, в связи большей копийностью гена 18S рРНК в клетках T.vaginalis, вероятность обнаружения возбудителя при использовании праймеров к данному гену, существенно возрастает. Использование праймеров TrVa11 и TrVa22 позволяет проводить детекцию T.vaginalis в течение одного рабочего дня не только в «классическом» варианте, но и при проведении ПЦР в реальном времени. При ПЦР в реальном времени использование праймеров TrVa11 и TrVa22 позволяет сократить время проведения анализа, а также проводить количественное определение T.vaginalis в биоматериале, полученном от больного. Применение ПЦР в режиме реального времени с праймерами к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале. Данная методика практически полностью исключает загрязнение ампликонами рабочих помещений, таким образом, снижает риск получения ложнопозитивных результатов к абсолютному минимуму, что при использовании «классической» ПЦР удается не всегда.

ВЫВОДЫ

1 Наиболее адекватную группу пациентов с урогенитальным трихомониазом для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям в моно- и микствариантах составляют мужчины в возрасте 20-29 лет, имеющие высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющие алкоголем (82,7%), часто пользующиеся практикой незащищенного секса (55,5%).

2 Сокращение сроков культуральной детекции и идентификации Trichomonas vaginalis до 2 суток достигается внесением к 5 мл питательной среды 0,03г (0,06 мл) комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения).

3 Классическая полимеразная цепная реакция при диагностике урогенитального трихомониаза отличается высокой чувствительностью и специфичностью не зависимо от выраженности и локализации воспалительного процесса, длительности течения заболевания.

4 Сконструированные праймеры TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к 18S рРНК обеспечивают высокоспецифичную детекцию Trichomonas vaginalis в клиническом материале без образования димеров и перекрестных реакций с человеческой ДНК как в качественном варианте полимеразной цепной реакции, так и при проведении ее в режиме реального времени.

5 Real-time ПЦР с праймерами TrVa 22/TrVa 11 к консервативному видоспецифичному фрагменту 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis обеспечивает высокую чувствительность и специфичность исследования, возможность получения количественных данных и их автоматическую регистрацию, что существенно оптимизирует лабораторную диагностику урогенитального трихомониаза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При диагностике урогенитального трихомониаза у мужчин культуральным методом рекомендуется использовать модифицированную среду, содержащую в 5мл 0,03г комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат (0,06 мл жидкого лекарственного средства Феррум лек, LEK Pharmaceuticals, Словения).

2 Для повышения качества лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза рекомендуется использовать полимеразную цепную реакцию с праймерами TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis.

3 При диагностике различных форм урогенитального трихомониаза у мужчин рекомендуется использование полимеразной цепной реакции для исследования отделяемого из уретры, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью не зависимо от локализации, длительности и выраженности воспалительного процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р., Ибраева Р.А. Ретроспективный анализ распространенности урогенитального трихомониаза среди женщин// Мать и дитя: матер. всероссийского форума. - М., 2006. - С. 649.

2 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р. Социально-гигиеническая характеристика больных урогенитальным трихомониазом// Вестник перинаталогии, акушерства и гинекологии. - Красноярск, 2006. - №13.- С. 428-430.

3 Мустафина Г.Р., Ибраева Р.А. Актуальность выявления анаэробной микрофлоры, ассоциированной с урогенитальным трихомониазом /Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике. - Уфа, 2006.- С.173-174.

4 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р., Ибраева Р.А. Анализ ошибок в диагностике хронического урогенитального трихомониаза// Фундаментальные исследования в биологии и медицине: сборник научных трудов. - Вып.1.-Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006.- С.148-150.

5 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Ибраева Р.А. Социально-гигиенические особенности урогенитальной трихомонадной инфекции на современном этапе// Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике. - Уфа, 2006. - С. 177-178.

6 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р. Разработка и испытание «ПЦР в реальном времени» для детекции Trichomonas vaginalis в клиническом материале// Матер. IX съезда всероссиско-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - Т. 3. - С. 67-68.

7 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Зиганшина С.Р., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р. Использование полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) для детекции Trichomonas vaginalis в клиническом материале// Биомика - наука XXI века. Матер. школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. - Уфа, 2007. - С.99-100.

8 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р. Возможности и перспективы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике урогенитального трихомоноза// Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №9. - С. 45.

9 Мустафина Г.Р., Хисматуллина З.Р., Мавзютов А.Р., Шакирова Г.Р. Способ выделения Trichomonas vaginalis// Пермский медицинский журнал. - 2008. - Т.25. - №5. - С. 61-64.

10 Мустафина Г.Р., Хисматуллина З.Р., Мавзютов А.Р., Шакирова Г.Р. Современные аспекты гипердиагностики урогенитального трихомониаза// Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2009. - Т. II. - №.10 - С.134-135.

11 Белоусова Н., Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для мониторинга трихомониазной инфекции/ Полевые и экспериментальные исследования биологических систем: матер. всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Ишим, 2009. - С.116.

12 Hismatullina Z.R., Sigajev N.I., Mustafina G.R., Sakirova G.R. Eraroj en diagnozado de urogenitala trihomoniaso. Medicina internacia revuo. - Junio 2009.-Vol. 23a. - №3 (92). - P. 86-87.

Размещено на Allbest.ru