Вирулентные свойства стафилококковой микрофлоры кожи при атопическом дерматите

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

ВИРУЛЕНТНЫЕ СВОЙСТВА СТАФИЛОКОККОВОЙ МИКРОФЛОРЫ КОЖИ ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ

Баязитова Лира Табрисовна

Уфа - 2009



Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Республика Татарстан, г. Казань).

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Фассахов Рустэм Салахович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Габидуллин Зайнулла Гайнулинович;

доктор медицинских наук, профессор Поздеев Оскар Кимович

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет»

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Защита диссертации состоится 20 октября 2009 года в 11 часов на заседании Объединенного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава».

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Лукманова К.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ, в мире ежегодно более 1 млн человек заболевают аллергическими болезнями, одним из наиболее распространенных среди которых является атопический дерматит (АтД). Заболеваемость АтД в экономически развитых странах мира составляет в среднем 15-20 человек на 1000 населения [Ильина Н.И., 2005; Ревякина В.А., Агафонов А. С., 2008]. Ухудшение здоровья населения, широкое распространение бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, а также увеличение частоты резистентных к антибактериальным препаратам микроорганизмов существенно меняют течение болезни, приводя к развитию более тяжелых форм, характеризующихся рецидивирующим течением и выраженными воспалительными проявлениями [Елисютина О.Г., Феденко Е.С., 2006].

Серьезной проблемой является частое присоединение вторичной инфекции кожи у 25-34 % больных с атопическим дерматитом [Смирнова Г.И., 2004]. Среди микробов, колонизирующих кожу пациентов, страдающих АтД, лидирующую роль занимает Staphylococcus aureus. По данным разных авторов, у 80-95 % пациентов, страдающих этим заболеванием, c кожных покровов высевается Staphylococcus aureus [Leung D.Y.M., 2002; Gong J.Q. et al., 2006]. Установлено, что с усилением колонизации кожи стафилококком наблюдаются более тяжелые патологические изменения и характер течения атопического дерматита [Szacos E. et al., 2004]. Присоединение стафилококковой инфекции к уже существующему аллергодерматозу часто становится пусковым фактором развития обострения заболевания.

Возможен и другой вариант развития АтД - колонизация кожи Staphylococcus aureus становится причиной развития АтД у лиц с атопическим фенотипом.

Накопленный клинический опыт показывает, что стафилококковая колонизация кожи у пациентов с АтД значительно изменяет характер течения этого аллергического заболевания. Однако, несмотря на значительное число работ, посвященных роли микробного фактора при данной патологии, особенности стафилококковой микрофлоры, колонизирующей кожу пациентов при АтД, раскрыты неполно. Недостаточно изучено влияние местной терапии на вирулентные свойства Staphylococcus aureus, персистирующего на коже больных атопическим дерматитом.

Исследования вирулентных свойств бактерий рода Staphylococcus, колонизирующих кожные покровы, необходимы для раскрытия механизмов взаимодействия макро- и микроорганизма, возникающих при развитии АтД, что будет способствовать развитию новых подходов к лечению пациентов с этим заболеванием.

Цель исследования

Определить вирулентные свойства и ферментативные особенности стафилококков, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом; oценить антибактериальную активность 1-окси-2(1Н)-пиридитиона цинка (пиритиона цинка) по отношению к Staphylococcus aureus при его применении в местной терапии больных атопическим дерматитом.

Задачи исследования

1 Определить видовой и количественный состав стафилококковой микрофлоры кожи при осложнённом и неосложнённом течении атопического дерматита в различных возрастных группах больных.

2 Изучить вирулентные свойства (адгезивный потенциал, активность гидролитических энзимов и ферментов антиоксидантной системы защиты) штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, колонизирующих кожу пациентов с атопическим дерматитом в зависимости от тяжести заболевания.

3 Оценить клиническую эффективность местной терапии с применением пиритиона цинка и его антибактериальные свойства в отношении штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих поражённую кожу больных атопическим дерматитом.

Научная новизна

Получены новые данные о различной степени выраженности адгезивного потенциала у штаммов стафилококков (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), колонизирующих кожу больных, в зависимости от степени тяжести атопического дерматита.

Впервые дана количественная характеристика активности протеиназ штаммов стафилококков, высеянных с пораженной кожи больных атопическим дерматитом; для Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis определён тип секретируемых протеиназ, обусловливающих эту активность.

Установлена зависимость активности каталазы и супероксиддисмутазы штаммов стафилококков, высеянных с кожи больных, от клинической формы, степени тяжести и периода течения атопического дерматита.

Выявлена высокая термонуклеазная активность Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу больных при тяжелом течении атопического дерматита. стафилококковый микрофлора кожа дерматит

Показана высокая эффективность местной терапии с применением пиритиона цинка, обусловленная антибактериальным действием препарата, способствующим элиминации с кожи больных Staphylococcus aureus и снижению их вирулентных свойств.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные о высокой частоте выделения с кожи больных с тяжелой степенью атопического дерматита метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus указывают на необходимость проведения антибактериальной терапии с учетом результатов определения метициллинрезистентности стафилококков.

Результаты исследования клинической эффективности и антибактериальной активности препаратов на основе пиритиона цинка (препарат «Скин-кап») позволяют рекомендовать использование их при местной терапии у больных с атопическим дерматитом, ассоциированным с массивной колонизацией кожи Staphylococcus aureus.

Выраженная активность гидролитических, антиоксидантных ферментов и адгезивность штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом, характеризуют их высокую патогенность, что диктует необходимость учета роли бактериального фактора при проведении этиопатогенетической терапии.

По результатам диссертационной работы подана заявка и получено решение о выдаче патента на изобретение «Способ определения IgG-протеиназной активности» (заявка № 2008113407/13 от 28.03.2008 г.).

Внедрение результатов исследований в практику

Результаты диссертационного исследования используются в работе специализированной поликлиники Федерального государственного учреждения науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора; аллергологического отделения муниципального учреждения здравоохранения «Детская клиническая городская больница № 7» г. Казани; в учебном процессе на кафедрах микробиологии и аллергологии и клинической иммунологии Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Кожа пациентов первых двух лет жизни с тяжелым течением экссудативной формы атопического дерматита колонизирована Staphylococcus aureus в высокой степени плотности.

2 Штаммы Staphylococcus aureus, колонизирующие пораженную кожу больных атопическим дерматитом в периоде обострения, обладают выраженной адгезивной способностью, высоким уровнем активности Ig-протеиназ, нуклеаз, каталазы и супероксиддисмутазы.

3 Применение пиритиона цинка приводит к снижению плотности контаминации пораженной кожи Staphylococcus aureus, снижению их вирулентных свойств.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены на научных форумах: 15-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2005); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007); 17-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007); 10-м Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Основные положения диссертации обсуждены на расширенном заседании Ученого совета Федерального государственного учреждения науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора; кафедр аллергологии и клинической иммунологиии, микробиологии Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, специализированной консультативно-диагностической поликлиники инфекционно-аллергических заболеваний при Федеральном государственном учреждении науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора (протокол № 1 от 1 июня 2009 года).

Диссертация апробирована на расширенном заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» (протокол № 7 от 25 06.09 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 40 таблиц и 13 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 194 источника (75 отечественных и 119 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клинические исследования проводились в течение 2003-2005 гг. на базе специализированной консультативно-диагностической поликлиники инфекционно-аллергических заболеваний ФГУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора и аллергологического отделения муниципального учреждения здравоохранения «Детская городская клиническая больница № 7» (г. Казань).

Диагноз атопический дерматит (АтД) установлен у 114 пациентов, включённых в диссертационное исследование, в соответствии с рекомендациями Российского национального согласительного документа по атопическому дерматиту (2002) и согласительного документа «Современная стратегия терапии атопического дерматита: программа действия педиатра» (2004). Степень тяжести АтД оценивалась по международной системе SCORAD (Severity scoring of atopic dermatitis). Были выделены три степени тяжести: легкая (индекс SCORAD менее 30 баллов), среднетяжелая (индекс SCORAD от 30 до 60 баллов), тяжелая (индекс SCORAD более 60 баллов).

Контрольную группу составили 25 практически здоровых лиц (ПЗЛ) в возрасте от 6 месяцев до 18 лет. Основными критериями отбора в группу сравнения из числа практически здоровых лиц явились следующие: отсутствие жалоб на нарушения состояния здоровья в момент осмотра; отсутствие признаков аллергической и другой острой или хронической патологии [Хайруллина Р.М., 1999].

В работе использован комплекс методов: клинических, лабораторно-инструментальных, аллергологических, микробиологических, биохимических и статистических.

Общеклинические лабораторные методы исследования включали общий анализ крови и мочи, анализ кала на гельминты и простейшие.

Специфическая диагностика включала оценку данных аллергологического анамнеза, кожного тестирования, определение содержания общего иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови. Кожное тестирование проводили в аллергологическом кабинете на базе поликлиники ФГУН КНИИЭМ (зав. поликлиникой - к.м.н. Л.Р. Смирнова). Уровень общего IgE в сыворотке крови определяли количественным иммуноферментным методом с использованием наборов тестов производства ЗАО «БиоХимМак». Анализ аллергологического анамнеза проводили по общепринятым стандартам обследования аллергических больных.

Микробиологические методы исследования включали качественную и количественную оценку микрофлоры. Качественный состав микрофлоры кожи определяли методом агаровых мазков-отпечатков по Н. Н. Клемпарской в модификации А. Е. Максимовой (1997). Идентификацию микроорганизмов осуществляли по морфологическим, биологическим и биохимическим свойствам в соответствии с нормативными документами. Также использован количественный метод микробиологического исследования микрофлоры кожи - количество выросших колоний микроорганизмов выражали в колониеобразующих единицах на 1 см2 кожи (КОЕ/см2).

Определение ДНК-азной активности штаммов стафилококка проводили согласно приказу МЗ РФ от 22.04.1985 г. № 585 на питательной среде DNAse-Agar («Bio-RAD», Франция). Определение термонуклеазной активности штаммов бактерий рода Staphylococcus проводили методом кислоторастворимых фракций в жидкой среде культивирования по методу Н.Е. Кучеренко и соавт. (1988).

Определение чувствительности стафилококков к антимикробным препаратам и метициллинрезистентности выделенных штаммов осуществляли согласно Методическим указаниям МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности штаммов бактерий рода Staphylococcus к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом.

Идентификацию метициллинрезистентных стафилококков осуществляли по МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» с использованием питательной среды MRSA-SELECT-агар («Bio-RAD», Франция). Для контроля качества проводимых исследований использовали эталонный штамм Staphylococcus aureus ATCC № 25923.

Активность секретируемых стафилококками протеолитических ферментов определяли в питательной среде методом фибрин-агаровых пластин [Astrup Т., 1952]. Количественно протеиназную активность оценивали in vitro иммуноферментным методом в лаборатории иммунологии и разработки аллергенов ФГУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (зав. лаб. - старший научный сотрудник, к.м.н. Тюрин Ю.А). В качестве субстрата использовали иммуноглобулин G человека (IgG). Активность протеиназ выражали в единицах удельной активности фермента (мкмоль субстрата, расщеплённого за 1 минуту на 1 мг белка в питательной среде культивирования при оптимальных условиях). Концентрацию белка в питательной среде определяли по M. M. Bradford (1976).

Определение адгезивных свойств штаммов стафилококков проводили по методу В.И. Брилис и соавт. (1986). При этом изучение окрашенных мазков и подсчет клеток проводили в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН с использованием цифровой камеры AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Германия), адаптированной к световому микроскопу «Jenamed» (Carl Zeiss, Германия) совместно с научным сотрудником, к. б. н. Акуловым А. Н.).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в лизатах стафилококка определяли адренохромным методом в модификации Т. В. Сирота (1999). Лизаты стафилококков получали по методу R. Merchante (1995). Удельную активность СОД оценивали на 1 мг белка, содержащегося в лизате стафилококковых клеток. Концентрацию белка определяли по M. M. Bradford (1976).

Активность каталазы бактериальных штаммов определяли по методу М.А. Королюк и соавт. (1988), выражали в мкаталах на 1 млн микробных клеток.

Cхема местной терапии больных атопическим дерматитом в возрасте от 1 года до 18 лет, включающая препараты пиритиона цинка:

- при ограниченной форме АтД использовали крем для наружного применения 0,2 % 2 раза в день (утром и вечером) на 4-6 ч до полного разрешения процесса (21 день);

- при наличии экзематизации, мокнутия, отека использовали аэрозоль для наружного применения 0,2 % 2 раза в день до полного разрешения процесса (21 день).

- при лихеноидной форме и на участки лихенизации кожи - крем для наружного применения 0,2 % 1 раз в день до полного разрешения процесса (21 день).

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере в математических пакетах программ “Statistica 6.0” StatSoft USA. Определяли среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку средней арифметической (m). Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента и уровня значимости (p). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Микробиологические особенности стафилококковой микрофлоры кожи у больных атопическим дерматитом

Вначале нами была проведена оценка прогностически неблагоприятных факторов у пациентов с атопическим дерматитом. Было установлено, что у 91,3 % пациентов заболевание чаще дебютировало на первом году жизни: у 57,0 % - в первые 3 месяца, 20,3 % - в возрасте от 3 до 6 месяцев и 14,0 % - во втором полугодии жизни, т.е. был характерен ранний дебют заболевания. У 50 (43,8 %) пациентов наблюдалось сочетание нескольких аллергических заболеваний: в 60,0 % случаев АтД сочетался с атопической бронхиальной астмой, в 10,0 % - с аллергическим ринитом и в 10,0 % - с пищевой и/или лекарственной аллергией, проявляющейся в виде ангионевротического отёка и острой крапивницы.

Оценка наследственной отягощённости по аллергическим заболеваниям у пациентов с АтД позволила выделить группы больных с высокой, средней и низкой степенью наследственной отягощенности. Высокая степень наследственной отягощённости была выявлена у 30,7 % пациентов с атопическим дерматитом. В этой группе в период клинического обострения наблюдалось тяжелое течение заболевания (индекс SCORAD - 60 баллов и выше) и выявлены статистически значимые различия в числе обострений в течение года в сравнении с группой лиц со средней и низкой степенью наследственной отягощённости. В 57,0 % случаев у пациентов с АтД наблюдалась средняя степень наследственной отягощённости, тяжесть заболевания составила от 30 до 60 баллов по SCORAD. У пациентов с АтД низкая наследственная отягощённость встречалась редко (12,3 % случаев), тяжесть заболевания при этом составляла в период обострения менее 30 баллов по SCORAD, течение заболевания характеризовалось статистически значимо меньшим числом обострений в год по сравнению с пациентами с высокой и средней степенью наследственной отягощённости по аллергическим заболеваниям (таблица 1).



Таблица 1 - Зависимость тяжести атопического дерматита от степени наследственной отягощённости по аллергическим заболеваниям

Степень наследственной отягощённости	Возраст пациентов, мес. (мin.- max.)	Степень тяжести АтД по индексу SCORAD	Частота обострений в год
Высокая	6,5-60,8	Тяжелая	6,51,0*
Средняя	36,5-216,0	Среднетяжелая	4,40,2
Низкая	46,4-52,8	Легкая	3,80,4

* Различие с больными с высокой и низкой степенью наследственной отягощенности статистически значимо (p<0,05).

Учитывая, что уровень IgE у детей и взрослых может быть использован для оценки выраженности сенсибилизации и определения атопического генеза заболеваний, нами было проведено исследование его содержания у больных с разной степенью тяжести атопического дерматита. Было показано, что у 38 (33,3 %) пациентов с тяжелым течением АтД (экссудативная и пруригоподобная формы) в возрасте от 6 месяцев до 2 лет отмечались максимальные уровни общего IgE - (392,018,3) МЕ/мл (p<0,05). В возрастной группе от 3 до 14 лет АтД протекал в лихеноидной и эритематосквамозной форме (средняя степень тяжести), уровень сывороточного IgE - (228,08,03) МЕ/мл - статистически значимо отличался от его уровня в младшей и старшей возрастных группах. У пациентов в возрасте от 15 до 18 лет АтД протекал в эритематосквамозной форме с лихенизацией (легкая степень тяжести), уровень общего сывороточного IgE при этом был наименьшим и составил (146,011,3) МЕ/мл (p<0,05) .

Напряжённость сенсибилизации у пациентов с АтД подтверждалась высокими значениями абсолютного и относительного содержания эозинофилов в периферической крови. Так, уровень эозинофилии был наибольшим у пациентов в возрасте до двух лет с тяжелым течением АтД, наименьший уровень эозинофилии был выявлен в старшей возрастной группе с эритематосквамозной формой АтД с выраженной лихенизацией кожи. Уровень эозинофилии периферической крови коррелировал с уровнем общего IgE (r=0,67, p<0,05).

Для оценки роли микробного фактора в развитии АтД нами были проведены микробиологические исследования в двух группах больных: в 1-й группе АтД протекал без клинических проявлений вторичной инфекции кожи (n=84); во 2-й группе наблюдались осложнения течения заболевания с присоединением местной инфекции кожи (n=30).

В первой группе частота выделения Staphylococcus aureus с поражённой кожи составила 59,5 %, с непораженной - 27,7 %, против 8,0 % в группе практически здоровых лиц. Частота встречаемости у больных Staphylococcus еpidermidis составила от 5,0 до 11,9 % (с непораженной и пораженной кожи соответственно); в контрольной группе (ПЗЛ) Staphylococcus epidermidis был обнаружен на коже у 20,0 % обследованных.

Установлено, что наиболее часто и с максимальной плотностью обсемененности Staphylococcus aureus выделялся с кожи детей в возрасте до 2 лет с экссудативной формой АтД, протекавшего с максимальной степенью тяжести в период обострения кожного процесса - (5,5±0,3) lg КОЕ/см2 против (3,3±0,4) lg КОЕ/см2 у практически здоровых лиц (p<0,05). По мере снижения тяжести течения АтД наблюдалось уменьшение частоты выделения и плостности колонизации поверхности кожи золотистым стафилококком.

Во 2-й группе пациентов (с осложненным инфекцией течением АтД) у 16 (14,0 %) пациентов (дети в возрасте от 6 мес. до 3 лет) было отмечено развитие бактериальной, у 7 (6,1 %) - микотической, обусловленной дрожжеподобными грибами рода Candida и Malassezia; и у 7 (6,1 %) больных - микст-инфекции, обусловленной ассоциацией бактериальной (Staphylococcus aureus) и грибковой микрофлорой (Candida, Malassezia). Закономерных изменений в степени колонизации поверхности кожи Staphylococcus аureus в зависимости от тяжести заболевания не выявлено.

Полученные данные согласуются с данными других исследователей, показавших четкие видовые различия в частоте встречаемости Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis в микробиоценозе коже больных АтД, характеризующих патогенетическую значимость бактерий рода стафилококков в развитии заболевания [Мокроносова М.А., 2003; Gong J. Q. et al., 2006]. При АтД без клинических проявлений инфекционного процесса на коже частота обнаружения и степень обсемененности поверхности пораженной кожи Staphylococcus aureus определяется уровнем тяжести, характером течения заболевания, обусловленными особенностями реагирования организма. Осложненные вторичной инфекцией клинические формы АтД характеризуются более тяжелым течением, что обусловлено снижением реактивности организма и развитием иммунной недостаточности у больных [Leung D. Y. M., 2002]. Различия в патогенетической роли основных видов стафилококков, колонизирующих кожу ПЗЛ и больных АтД, могут быть обусловлены особенностями вирулентных свойств этих бактерий. В связи с этим далее нами были изучены вирулентные свойства бактерий рода Staphylococcus, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом.

Адгезивность - способность экспрессировать факторы адгезии и колонизации является пусковым механизмом реализации патогенности бактерий. Выбор эритроцитарной модели для оценки адгезии был обусловлен тем, что эритроциты несут на своей поверхности фибронектин, фибриноген и такие компоненты гликокаликса, как гликозаминогликаны, которые создают специфические эпитопы для взаимодействия с адгезивными поверхностными протеинами стафилококка и другими факторами адгезии этих бактерий [Clarke S.R. et al., 2004]. Для оценки адгезивного потенциала применялся индекс адгезии стафилококка (ИАС) - среднее число адгезированных клеток на одном эритроците [Брилис В.И. и др., 1986]. Неадгезивными считали штаммы при среднем числе клеток на одном эритроците 1,75; низкоадгезивными - от 1,76 до 2,50; среднеадгезивными от 2,51 до 4,00 и высокоадгезивными при ИАС >4,00.

Было показано, что в период обострения заболевания с кожи пациентов выделяются гетерогенные по адгезивности стафилококки, которые условно можно разделить на низко- и среднеадгезивные варианты (ИАС от 1,78 до 3,40) видов Staphylococus aureus, Staphylococcus epidermidis (50,0 % всех выделенных штаммов) и высокоадгезивные варианты (ИАС от 4,50 до 6,00) вида Staphylococcus aureus (25,0 % штаммов). В отличие от больных АтД, с кожи ПЗЛ выделялись стафилококки (Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis), большая часть которых (75,0 %) была отнесена к неадгезивным (ИАС от 0,6 до 1,0) и низкоадгезивным вариантам (ИАС от 1,0 до 2,0). Установлена чёткая зависимость встречаемости высоко-, средне- и низкоадгезивных вариантов Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus от тяжести течения атопического дерматита. Так, при среднетяжёлых и тяжёлых формах АтД кожа пациентов колонизировалась только высокоадгезивными штаммами Staphylococcus aureus и среднеадгезивными штаммами Staphylococcus epidermidis, при легких формах тяжести АтД выделялись низкоадгезивные и среднеадгезивные варианты Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus (таблица 2).

Таблица 2 - Адгезивность стафилококков кожи пациентов с различной степенью тяжести атопического дерматита

Степень тяжести АтД	Индекс адгезии стафилококков (ИАС)
	S. aureus	S. epidermidis
Легкая (n=19)	3,50,5*	2,80,5*
Среднетяжелая (n=27)	4,50,3*	2,70,3
Тяжелая (n=14)	5,50,5*	3,70,3*
ПЗЛ	2,5±0,5	2,00,5

* Различие с ПЗЛ статистически значимо (p<0,05).

Преимущественная колонизация кожи при АтД видом Staphylococcus aureus обусловлена, прежде всего, протеолитической инактивацией протеазами бактерицидного действия антимикробных пептидов кожи (LL-37). Нами были получены статистически значимые различия в активности протеиназ между штаммами стафилококка, выделенными от пациентов с АтД и ПЗЛ - (1,40,21 и 0,360,08, соответственно, p<0,01). Эти различия носили у Staphylococcus aureus внутривидовой характер (рисунок 1).

Рисунок 1 - Протеиназная активность штаммов стафилококков, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом

Установлено, что протеиназная активность штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих кожу больных АтД, превышала эту активность почти в 4 раза у штаммов данного вида, выделенных от практически здоровых лиц (1,550,36 и 0,420,09 соответственно, p<0,02), что свидетельствует о различной степени вирулентности штаммов, колонизирующих кожу в норме и при патологии. С помощью ингибиторов протеиназ определяли два профиля Ig-протеиназ по типу активных центров.

Таблица 3 - Профиль протеиназ (по типу активных центров) стафилококков кожи пациентов с атопическим дерматитом

Виды стафилококков	Тип протеиназ
	сериновые	металлозависимые
S. aureus	+	+
S. epidermidis	+	-

Примечание: «+»- наличие активности Ig-протеиназ данного типа ; «»- отсутствие активности Ig-протеиназ данного типа у всех исследованных штаммов.

Определение профиля протеиназ по типу активных центров у Staphylococccus aureus, колонизирующих кожу больных АтД и ПЗЛ, показало, что энзимы, образуемые этими штаммами, относятся к металлозависимым и сериновым протеиназам. У вида Staphylococcus epidermidis преимущественно активность обеспечивалась за счет сериновых протеиназ (таблица 3).

Полученные нами данные о степени протеиназной активности штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, колонизирующих кожу в норме и при АтД, а также данные о видовом различии в профиле протеиназ (по типу активных центров) согласуются с работами исследователей, установивших, что протеолиз кателицидинов LL-37 сериновыми протеазами, секретируемыми Staphylococcus epidermidis, на фрагменты, не теряющие антимикробные свойства, позволяет данному виду конкурировать за данную экологическую нишу; в то время как металлопротеиназа Staphylococcus aureus расщепляет пептид LL-37 на фрагменты, не обладающие противомикробным действием и, тем самым, разрушает врожденную противомикробную систему защиты кожи.

Анализ ДНК-азной активности - значимого маркера патогенности штаммов Staphylococcus, показал, что ДНК-азоположительные штаммы стафилококков высеваются с кожи больных АтД в 91,2 % случаев, а ДНК-азоотрицательные - в 8,8 % случаев. Установлено, что при тяжелом варианте течения АтД у детей первых двух лет все выделенные штаммы Staphylococcus aureus с кожи пациентов были способны образовывать ДНК-азы, тогда как при легкой степени тяжести АтД кожа колонизируется ДНК-азоположительными штаммами в 71,0 % случаев. Такая высокая частота встречаемости ДНК-азной активности среди штаммов Staphylococcus aureus может служить характерным фенотипическим маркёром персистенции на коже штаммов этого вида у пациентов с атопическим дерматитом. Выявлено, что уровень активности термонуклеазы у штаммов стафилококков, колонизирующих кожу больных АтД, в 1,24 раза выше, чем у штаммов стафилококков, заселяющих кожу практически здоровых лиц.

Известно, что реактивные формы кислорода (O2- , OH•) и перекись водорода (H2O2) оказывают токсическое действие на микробные клетки, но вирулентные виды микроорганизмов эволюционно выработали систему ферментативной защиты (каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др.) от окислительного киллинга в фагоцитах. Наши исследования показали, что в период обострения АтД кожа пациентов колонизируется штаммами стафилококков, для которых характерна высокая активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), по сравнению со штаммами, выделяемыми с кожи в период ремиссии заболевания (таблицы 4 и 5). Выявленная закономерность не зависела от видовой принадлежности стафилококков. Анализ уровня активности каталазы у штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus еpidermidis, колонизирующих кожу пациентов с различной степенью тяжестью АтД и ПЗЛ, выявил статистически значимые различия в уровне активности этого фермента. Активность СОД у штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, выделенных с кожи пациентов с различной тяжестью АтД, также была статистически значимо более высокой, чем активность этого фермента у штаммов этих видов, колонизирующих кожу практически здоровых лиц.



Таблица 4 -Активность основных антиоксидантных ферментов у штаммов Staphylococcus epidermidis, выделенных с кожи больных атопическим дерматитом в различные периоды заболевания

Период заболевания	Aктивность каталазы, мкат/ млн м.т.	Aктивность супероксиддисмутазы, у.е.
Ремиссия (n=19)	2103,111,9*	273,17,9*
Обострение (n=10)	3200,66,9	416,86,5

* - Различия в среднем уровне активности у штаммов, полученных в разные периоды заболевания, статистически значимы (p<0,05).

Таблица 5 - Активность основных антиоксидантных ферментов у штаммов Staphylococcus aureus, выделенных с кожи пациентов с атопическим дерматитом в различные периоды заболевания

Период заболевания	Активность каталазы, мкат/млн м.т.	Активность супероксиддисмутазы, у.е.
Ремиссия (n=35)	2208,112,4*	323,18,5*
Обострение (n=35)	3013,68,9	497,86,8

* - Различия в среднем уровне активности между штаммами, полученными в разные периоды заболевания, статистически значимы (p<0,05).

Выраженная активность ферментов каталазы и супероксиддисмутазы у штаммов стафилококов, составляющих бактериоценоз кожи, по-видимому, позволяют этим бактериям колонизировать среду, богатую кислородом, а также противостоять кислородзависимому киллингу, реализуемому в фагоцитах макроорганизма. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при атопическом дерматите кожа колонизируется штаммами стафилококка, максимально адаптированными к окислительному киллингу при фагоцитозе и внешним аэробным условиям.

Таким образом, в период обострения атопического дерматита кожа пациентов колонизируется штаммами стафилококков с выраженными адгезивными свойствами, высокой активностью ферментов распространения (протеиназы и термонуклеазы) и ферментов антиоксидантной защиты (каталазы и супероксиддисмутазы), по сравнению со штаммами, составляющими бактериоценоз кожи в норме.

Эффективность пиритиона цинка при местной терапии атопического дерматита и его антибактериальная активность в отношении штаммов Staphylococcus aureus

В ряде рандомизированных исследований была показана безопасность и клиническая эффективность применения пиритиона цинка («Скин-кап», Cheminova International S.Q., Испания) в терапии больных атопическим дерматитом [Мокроносова М.А. и др., 2004; Скрипкин Ю.К. и др., 2007; Фассахов Р.С. и др., 2007].

В нашем исследовании проведена оценка эффективности местной терапии АтД с применением одной из лекарственной формы пиритиона цинка по следующим показателям: бактериологическим (оценка элиминации, плотности колонизации кожи больных атопическим дерматитом Staphylococcus аureus, изменений вирулентных свойств штаммов стафилококков, колонизирующих кожу пациентов); и клиническим критериям эффективности (степень тяжести заболевания, динамика основных симптомов дерматита).

У всех больных до начала терапии определяли тяжесть заболевания: индекс SCORAD; индекс IGA (Investigatorґs Global Assessment) - исследовательская глобальная оценка, учитывающая выраженность местных изменений, выраженность кожного зуда и нарушения сна; а также проводили бактериологическое исследование пораженных участков кожи.

Результаты, отражающие клинические критерии эффективности проведённой терапии, с применением пиритиона цинка показали, что на 21-й день терапии у всех больных было отмечено снижение индекса тяжести заболевания (SCORAD) в 3,6 раза по сравнению с исходным уровнем (соответственно 51,20,5 и 14,20,7, p<0,05), отмечено также значительное купирование местных воспалительных изменений кожи (гиперемии, зуда, мокнутия), что сопровождалось улучшением общего самочувствия пациента. Объективные критерии положительной динамики общего состояния пациентов к 21-му дню терапии, такие как снижение в 3 раза выраженности зуда кожи, снижение значения показателя нарушения сна в 2,5 раза, уменьшение индекса IGA почти в 3 раза - (3,30,3) балла и (1,20,2) балла соответственно (p<0,05) - подтверждают клиническую эффективности трехнедельного курса терапии с применением пиритиона цинка в данных пациентов.

К 21-дню терапии у пациентов отмечается статистически значимое снижение, по сравнению с исходным уровнем, плотности колонизации поражённой кожи Staphylococcus aureus на 15 % - (4,30,2) lg КОЕ/см2 и (3,70,1) lg КОЕ/см2, соответственно (p<0,05).

Отмечено, что к концу терапии пиритионом цинка с участков поражённой кожи детей в возрасте до 5 лет выделяются штаммы Staphylococcus aureus со сниженными адгезивными свойствами (ИАС до терапии 4,60,5, после - 3,00,5 (p<0,05), по сравнению со штаммами, колонизировавшими кожу этих пациентов до терапии (рисунок 2).

Рисунок 2 - Индекс адгезивности штаммов Staphylococcus aureus до и после терапии у детей в возрасте до 5 лет

У детей в возрасте старше 5 лет к концу терапии пиритионом цинка статистически значимых различий в адгезивных свойствах между штаммами Staphylococcus аureus, выделенных как до так и после терапии, нами не было выявлено (ИАС до терапии 4,80,5, после - 4,70,5, p>0,05), (рисунок 3).

Рисунок 3 - Индекс адгезивности штаммов Staphylococcus aureus до и после терапии у группы детей в возрасте от 6 до 16 лет

Изучение ферментативных свойств у штаммов Staphylooccus аureus, выделенных с кожи до и после лечения (21-й день), показало, что к концу терапии кожа пациентов колонизировалась штаммами со сниженной ферментативной активностью, по сравнению со штаммами, выделенными до начала терапии. Установлены статистически значимые различия в удельной активности гидролитических ферментов у штаммов Staphylococcus aureus, выделяемых до и после терапии: IgG-протеиназ - в 1,5 раза, термонуклеазы - в 1,2 раза (p<0,05) (рисунки 4 и 5).

Активность антиоксидантных ферментов (каталазы и супероксиддисмутазы) у штаммов Staphylococcus aureus, выделяемых к концу терапии с кожи пациентов, получавших пиритион цинка, была также статистически значимо снижена в 1,36 и 1,48 раза соответственно, по сравнению с активностью этих ферментов у штаммов Staphylococcus aureus до терапии (рисунки 6 и 7).



Рисунок 4 - Протеиназная активность внеклеточных протеаз штаммов Staphylococus aureus, выделенных до и после лечения

Рисунок 5 - Активность термонуклеазы лизатов штаммов Staphylococcus aureus, выделенных с кожи до и после лечения

Рисунок 6 - Активность каталазы штаммов Staphylococcus aureus, выделенных до и после лечения



Рисунок 7 - Активность супероксиддисмутазы лизатов штаммов Staphylococcus aureus, выделенных до и после лечения

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование препарата пиритиона цинка для местного лечения больных АтД дает выраженный терапевтический эффект. После курса лечения пиритионом цинка статистически значимо снижается плотность колонизации кожи золотистым стафилококком; к 21-му дню терапии с кожи больных высеваются штаммы Staphylococcus aureus cо сниженными вирулентными свойствами. Терапевтическая эффективность активированного пиритиона цинка обусловлена выявленной антистафилококковой активностью.

ВЫВОДЫ

1 У больных атопическим дерматитом бактерии Staphylococcus aureus являются значимым компонентом микрофлоры кожи. Частота выделения Staphylococcus aureus с поражённой кожи при атопическом дерматите составляет 59,5 %, против 8,0 % в группе сравнения. Частота выделения этого вида с непоражённой кожи пациентов не превышает 27,7 %.

2 У детей раннего возраста (до двух лет) с тяжелой степенью атопического дерматита отмечается наиболее выраженная степень плотности колонизации Staphylococcus aureus (lg 5,5 0,9) КОЕ/см2, что сопровождается высоким уровнем общего сывороточного иммуноглобулина E и эозинофилией.

3 При обострении атопического дерматита кожа колонизируется низко- и среднеадгезивными вариантами Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и высокоадгезивными вариантами Staphylococcus aureus. Кожа практически здоровых лиц заселена неадгезивными и низкоадгезивными вариантами Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus еpidermidis. Установлена прямая зависимость между степенью выраженности адгезивного потенциала по индексу адгезии стафилококков для Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus от степени тяжести атопического дерматита.

4 Выявлены различия по фенотипическим свойствам, отражающим вирулентность штаммов стафилококков, колонизирующих кожу больных атопическим дерматитом и практически здоровых лиц. Активность протеиназ у штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от пациентов, в 4,0 раза, термонуклеазы - в 1,24 раза выше, чем у штаммов этого вида стафилококка, выделенного с кожи практически здоровых лиц. Установлены статистически значимые различия в уровне активности каталазы и супероксиддисмутазы у штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, выделенных с кожи больных со среднетяжелой и тяжелой степенью атопического дерматита, и штаммов стафилококка этих же видов, колонизирующих кожу практически здоровых лиц.

5 При применении пиритиона цинка в местной терапии больных атопическим дерматитом, наряду с клинической эффективностью, отмечается снижение плотности колонизации кожи Staphylococcus aureus. После курса местной терапии пиритионом цинка с кожи больных высеваются штаммы Staphylococcus aureus со сниженными вирулентными свойствами.

Практические рекомендации

1 Данные о высокой частоте выделения у больных атопическим дерматитом метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus указывают на необходимость использования теста для выявления метициллинрезистентных стафилококков при проведении бактериологической диагностики

2 Местную антибактериальную терапию больных атопическим дерматитом проводить с учетом результатов исследования антибиотикорезистентности штаммов Staphylococcus aureus, выделенных с кожи.

3 На основании результатов исследования клинической эффективности и антибактериальной активности пиритиона цинка рекомендуется его использование при местной терапии в период обострения атопического дерматита.

4 При видовой идентификации стафилококков предлагается, наряду с исследованием ДНКазы, определять термонуклеазную активность бактерий рода Staphylococcus.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шарифуллина А. А., Фассахов Р. С., Баязитова Л. Т. Аллергический ринит у детей: особенности микробиоценоза полости носа // Сборник тезисов / 15-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания. 1-й Учредительный конгресс Евроазиатского респираторного общества. - М., 2005. - С. 31.

2. Баязитова Л. Т., Тюпкина О.Ф., Долбин Д. А., Куликов С. Н., Тюрин Ю. А. Фенотипические особенности изолятов Staphylococcus aureus кожи детей с атопическим дерматитом // Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Секция «Биология». М., 2007. - C. 104-105.

3. Баязитова Л. Т., Фассахов Р. С., Тюрин Ю. А., Сукманская Е. О., Круглова Е. Б., Куликов С. Н, Тюпкина О. Ф., Долбин Д. А. Фенотипические особенности кокковой микрофлоры кожи в норме и при атопическом дерматите // Российский аллергологический журнал. -2007. - № 4. - С. 48-52.

4. Шарифуллина А. А., Агафонова Е. В.,. Баязитова Л.Т. Микробиоценозы полости носа у детей с различными вариантами аллергического ринита и подходы к терапии // Практическая медицина. - 2007. - № 4 (23). - С. 35.

5. Баязитова Л. Т., Тюрин Ю. А., Сукманская Е. О., Куликов С. Н. Фенотипические характеристики кокковой микрофлоры кожи при атопическом дерматите // Там же. - С. 41.

6. Баязитова Л. Т., Тюрин Ю. А., Сукманская Е. О., Решетникова И. Д., Владимирова Д. И., Куликов С. Н., Долбин Д. А. Изменение ферментативных свойств S. aureus кожи больных атопическим дерматитом при лечении активированным цинк пиритионом // Российский аллергологический журнал.. - 2008. - № 1. - Приложение 1.С. 298-299.

7. Баязитова Л. Т., Фассахов Р. С., Тюрин Ю. А., Шарифуллина А. А., Тюпкина О. Ф. Термонуклеазная (TNASE) активность стафилококков, выделенных от пациентов с аллергической патологией //. Российский аллергологический журнал. - 2009. - № 3, вып.1. - С. 277-278.

8. Фассахов Р. С., Баязитова Л. Т., Тюрин Ю. А., Тюпкина О. Ф., Куликов С. Н. Антибиотикорезистентность Staphylococcus aureus, колонизирующего кожу и кишечник, у больных атопическим дерматитом // Практическая медицина. - .2009. - № 3 (35). - С. 66-69.

9. Баязитова Л. Т., Тюрин Ю. А., Куликов С. Н., Долбин Д. А., Фассахов Р. С. Исследование антибактериальной активности препарата «Скин-кап» в отношении Staphylococcus aureus при местной терапии атопического дерматита // Там же. - С. 89-91.

Патенты

10. Тюрин Ю. А., Баязитова Л. Т., Куликов С. Н., Фассахов Р. С., Долбин Д. А. Способ определения IgG-протеиназной активности (получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2008113407/13 от 28.03.2008 г.).

Размещено на Allbest.ru