Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 579.66 615.331

Повышение продуктивности штамма-продуцента антибиотика Бацитрацин

Лаборатория бионанотехнологии, микробиологии и вирусологии, Новосибирский государственный университет

ООО ПО «Сиббиофарм»

Лаборатория бор-нейтронозахватной терапии,

Институт ядерной физики им. Г.?И. Будкера СО РАН

E-mail: ungersy@mail.ru

В работе использовали культуру промышленного штамма B. licheniformis 356, продуцирующего бацитрацин с активностью 15000 мкг/мл. Получены и проанализированы мутанты B. licheniformis 356 после обработки химическими мутагенами 5-бромурацилом и этилметансульфонатом. Впервые получены и исследованы мутанты B. licheniformis 356 после обработки нейтронным облучением. Обнаружено 2 варианта (N2-6(C) и N4-1) с максимальными активностями (23900 мкг/мл и 23600 мкг/мл соответственно). На основании первого варианта N2-6(C) после его обработки этилметансульфонатом получены и проанализированы мутанты B. licheniformis N2-6(C). Проведен анализ варианта N2E1-2(С), продуцирующего бацитрацин с активностью 25500 мкг/мл, что в 1,7 раза превышает активность промышленного штамма.

Ключевые слова: Bacillus licheniformis, бацитрацин, мутагенез.

INCREASE IN PRODUCTIVITY OF THE ANTIBIOTIC-PRODUCING STRAIN BACITRACIN

Gvozdeva L.M., Lomovskaya T.F., Ilicheva T.N., Taskaev S.Y.

As a result of the study, variants of the first passage of culture of an industrial strain of B. licheniformis 356 producing bacitracin with an activity of 15000 мg/ml were obtained. The mutants of B. licheniformis 356 were obtained and analyzed after treatment with chemical mutagens with 5-bromouracil and ethylmethanesulfonate. The mutants of B. licheniformis 356 were obtained and studied for the first time after treatment with neutron irradiation. There were 2 variants (N2-6(C) and N4-1) with maximal activities (23900 мg/ml and 23600 мg/ml, respectively). Based on the first variant of N2-6(C), after its treatment with ethylmethanesulfonate, mutants of B. licheniformis N2-6 (C) were obtained and analyzed. An analysis of the variant N2E1-2(C) producing bacitracin with an activity of 25500 мg/ml was performed, which is 1,7 times higher than the planned activity of the industrial strain.

Keywords: Bacillus licheniformis, bacitracin, mutagenesis.

Микроорганизмов, синтезирующих продукты или осуществляющих реакции, полезные для

человека, известно несколько сотен видов, а биотехнологические функции бактерий разнообразны. Бактерии используются при производстве пищевых продуктов, микробных инсектицидов, белков, витаминов, растворителей и органических кислот, а также биогаза и фотоводорода [1].

Микробиологические реакции благодаря своей высокой специфичности широко используются в процессах химических превращений биологически активных природных соединений. Известно около 20 типов химических реакций, которые осуществляются микроорганизмами. Многие из них с успехом используются в фармацевтической химии. При проведении этих реакций применяются разные виды бактерий, актиномицетов, дрожжеподобных грибов и других микроорганизмов [2, 3].

Промышленное использование микроорганизмов для получения новых пищевых продуктов способствовало созданию таких видов промышленности как хлебопекарская и молочная, производство антибиотиков, витаминов, аминокислот, спиртов, органических кислот, интерферонов, и пр. [6]. При этом, производственные штаммы микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. Поэтому все микроорганизмы, используемые в промышленности, проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности, и фагоустойчивость [4, 5]. Одним из таких производственных штаммов является Bacillus licheniformis.

B. licheniformis является бактерией рода Bacillus и обычно встречается в почве. Это

грамположительные, мезофильные бактерии, оптимальная температура роста которых составляет около 30°С, хотя они могут выживать и при гораздо более высоких температурах. Способность образовывать споры в почве делает бактерию весьма полезной для различных промышленных целей. B. licheniformis является продуцентом полипептидного антибиотика бацитрацин, проявляющего активность в отношении грамположительных бактериальных штаммов [8, 9]. Помимо этого, данная бактерия производит множество различных гидролитических ферментов, например, протеаз, которые могут выживать при высоких уровнях рН, и аминопептидаз, гидролизующих белки [13, 14].

Механизм действия бацитрацина заключается в нарушении синтеза клеточной стенки

путем ингибирования дефосфорилирования липидов, предотвращая таким образом включение аминокислот и нуклеотидов в клеточную стенку. Он имеет низкий уровень токсичности при местном применении; но является нефротоксичным для человека, что ограничивает его использование в качестве системного антибиотика. Тем не менее, он широко используется в качестве кормовой добавки для животных в отрасли животноводства [7, 10, 11].

На ООО ПО «Сиббиофарм» производят препарат бацилихин, основой которого является антибиотик бацитрацин. Антибиотик получают промышленным культивированием штамма B. licheniformis 356. Эффективность данного производства в первую очередь определяется уровнем синтеза бацитрацина культурой-продуцентом. Приготовление рабочих партий посевного материала предполагает этапы постоянной текущей селекции с оценкой моноизолятов и отбором высоко активных колоний. Повышение способности культуры-продуцента к повышенному синтезу антибиотика является главной задачей специалистов, обеспечивающих производство посевным материалом.

В связи с этим, целью данной работы являлось получение высокопродуктивного штамма B. licheniformis, синтезирующего антибиотик бацитрацин.

Материал и методы

Производственный штамм B. licheniformis 356, тестовый штамм Micrococcus luteus ATCC-

10240 и контрольный раствор бацитрацина предоставлены для работы Центральной производственной лабораторией (ЦПЛ) ООО ПО «Сиббиофарм».

Наработка партии производственного штамма B. licheniformis 356 осуществлялась в соответствии с технологической инструкцией ООО ПО «Сиббиофарм» «Отбор вариантов и приготовление партий посевного материала культуры B. licheniformis в производстве бацилихина».

Мутагенное воздействие на культуру B. licheniformis 356 проводилось следующими методами:

- Обработка мутагеном 5-бромурацил.

- Обработка мутагеном этилметансульфонат (ЭМС).

- Обработка нейтронным облучением.

Обработка 5-бромурацилом и ЭМС производилась на разведенной суспензии ночной культуры B. licheniformis 356.

Обработка мутагеном 5-бромурацил. Клетки B. licheniformis 356 выращивали при температуре 37°С в течение ночи в ГРМ-бульоне. Затем культуру разводили 1: 25 в физиологическом растворе, содержащем 50 мкг 5-бромурацила в 1 мл. Инкубировали 5-6 ч при температуре 35-37°С при непрерывном перемешивании. Далее суспензию центрифугировали 10 мин при 1300g. Сливали супернатант, осадок ресуспендировали в свежем ГРМ-бульоне. Вновь центрифугировали 10 мин при 1300g, сливали супернатант, осадок ресуспендировали в свежем бульоне. 100 мкл полученной суспензии высевали на чашку Петри. Инкубировали при 37°С в течение суток. После этого отдельные колонии пересевали на свежую агаризованную среду (получали мутантные варианты).

Обработка мутагеном этилметансульфонат (ЭМС). Клетки B. licheniformis 356 выращивали при температуре 37°С в течение ночи в ГРМ-бульоне до поздней фазы роста (logфазы). Смешивали равные объемы бактериальной культуры и свежеприготовленного исходного раствора ЭМС (0,1 мл ЭМС в 2,5 мл минимальной среды (среда Цукамуры), подогретой до 37°С). Смесь аэрировали 1-2 часа при 37°С при постоянном перемешивании. Затем смесь разводили в 10 раз свежей средой Цукамуры и растили в течении нескольких часов, после чего высеивали на чашки Петри. Инкубировали 37°С в течение суток. После этого отдельные колонии пересевали на свежую агаризованную среду (получали мутантные варианты).

Обработка нейтронным облучением. Облучение эпитепловыми нейтронами проведено в лаборатории бор-нейтронозахватной терапии Института ядерной физики СО РАН. Клетки и споры B. licheniformis 356 выращивали при температуре 37°С в течение ночи в физиологическом растворе, после чего разливали по 1 мл в пробирки. Облучение проводили в ускорителе-тандеме с вакуумной изоляцией, генерирующий непрерывный пучок нейтронов. штамм licheniformis этилметансульфонат

Проверка активности полученных мутантных вариантов осуществлялась в соответствии с типовой технологической инструкцией по определению содержания бацитрацина в культуральной жидкости методом биологического титрования. Тестовый штамм - Micrococcus luteus, наиболее чувствительный к бацитрацину. Культуру каждого варианта инкубировали с 30 мл ферментационной среды в течение 24 ч, затем экстрагировали пробы 0,2М раствором HCl и готовили разведение 3125 (исходя из типовой инструкции). Наносили разведение 3125 в лунки чашек Петри и инкубировали в течение 20 ч, после чего замеряли зоны отсутствия роста тесткультуры M. luteus.

Построение калибровочной кривой. Готовили чашки Петри с тест-культурой M. luteus и рабочий стандартный раствор бацитрацина. Разбавляли 5 мл раствора фосфатным буфером до 50 мл и делали пять разведений с концентрациями 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,80 ЕД/мл (разведение 0,20 ЕД/мл - это контроль, 1 ЕД = 24 мкг). В часть лунок в агаре вносили по 100 мкл контрольного раствора, в часть лунок вносили по 100 мкл соответствующего разведения. Измеряли диаметры зон задержки роста тест-культуры после инкубации при 34°С в течение суток. По полученным данным на полулогарифмической сетке строили калибровочную кривую. На ось абсцисс наносили средние величины зон задержки роста тест-микроба стандартными растворами, а также среднюю величину зоны задержки роста тест-микроба контрольным раствором. На ось ординат наносили соответствующие концентрации растворов. Из полученных точек строили перпендикуляры, получали точки пересечения, через которые проводили линию, являющуюся калибровочной характеристикой. Для удобства пересчитывали полученные значения активности (ЕД/мл) в мкг/мл.

Результаты исследования и обсуждение

Всего в результате проведенных исследований было отобрано 205 мутантных вариантов производственного штамма B. licheniformis 356. Все варианты проверяли на величину их активности

и затем сравнивали с контрольными значениями калибровочной характеристики (табл.1).

Таблица 1. Подсчет активности бацитрацина по калибровочной кривой.

Активность мутантных вариантов экспериментов с 5-бромурацилом не достигла даже производственной активности 15000 мкг/мл. Низкая активность мутантных вариантов, полученных при обработке 5-бромурацилом, может иметь место по нескольким причинам:

1. неправильно прошедшая ферментация;

2. малая вероятность обнаружения нужной мутации в клетках;

3. низкая эффективность мутагена.

Исходя из этого, было принято решение обработать культуру новым, более сильным мутагеном ЭМС.

Активность мутантных вариантов двух первых экспериментов (после обработки ЭМС) фактически на уровне фона, что может свидетельствовать о неправильном расчете дозы для культуры или неправильном времени инкубации культуры с мутагеном (т.к. с B. licheniformis такие эксперименты ранее не проводились). Поэтому для последующих экспериментов доза ЭМС была снижена в 2 раза. Активность полученных мутантных вариантов в ряде случаев достигает плановой, но высокоактивных вариантов не удалось обнаружить на этом этапе. Но, т.к. данные, полученные с ЭМС, весьма обнадеживающие, необходимо было продолжить работу с этим мутагеном.

Облучение бактериальных клеток эпитепловыми нейтронами производилось впервые. Установка работает по следующей схеме: стационарный пучок отрицательных ионов водорода инжектируется в электростатический ускоритель-тандем с вакуумной изоляцией, и после перезарядки отрицательных ионов водорода в протоны (в перезарядной мишени) на выходе из тандема формируется протонный пучок, ускоренный до энергии, соответствующей удвоенному потенциалу высоковольтного электрода. При сбросе протонного пучка на литиевую мишень в результате пороговой реакции 7Li(p,n)7Be генерируется поток нейтронов, направленный на подложку [12]. В результате облучения ночной культуры исходного штамма B. licheniformis 356 и ее спор были получены результаты, представленные в табл. 2.

Таблица 2. Продуктивность мутантных вариантов 1-8, полученных в экспериментах после облучения нейтронами.

В - мутантный вариант культуры B. licheniformis 356; С - споры; А - активность мутантного варианта; К - активность контрольного штамма B. licheniformis 356, не обработанного мутагеном.

На основании данных таблицы 2 можно заключить, что у большинства клеток активность бацитрацина упала до фоновых значений. Видимо, нейтронное облучение негативно влияет на ферменты, отвечающие за синтез бацитрацина. Тем не менее, были варианты, достигшие плановой активности, и даже превышающие плановую активность. Контрольное значение активности необработанного штамма составило 15500 мкг/мл.

В результате проведенного исследования мы обнаружили два варианта с активностью, превышающей активность промышленного штамма, - вариант 6 в эксперименте 2 (вариант N2-6(C)) (продуцирующий бацитрацин с активностью 23900 мкг/мл) и вариант 1 в эксперименте 4 (N4-1) (продуцирующий бацитрацин с активностью 23600 мкг/мл). Эти варианты были отобраны для обработки мутагеном ЭМС. Данные о продуктивности мутантных вариантов B. licheniformis N2-6(C), полученных после инкубации с ЭМС, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Продуктивность мутантных вариантов B. licheniformis N2-6(C), полученных в эксперименте 1 после инкубации с ЭМС.

В - мутантный вариант культуры B. licheniformis N2-6(C); С - споры; А - активность мутантного варианта; К1 - активность контрольного штамма B. licheniformis 356, не обработанного мутагеном; К2 - активность B. licheniformis N2-6(C), не обработанного ЭМС.

Три варианта из пяти полученных утратили свою активность, один несколько превысил плановую. Вариант N2E1-2(C) превышал плановую активность продуцирования бацитрацина в 1,7 раза (25500 мкг/мл). Было сделано 5 пассажей на плотной среде (состав среды: 1% триптон, 0,8% NaCl, 1,5% агар), после чего еще раз измеряли активность N2E1-2(C). Величина активности составила 25500 мкг/мл, что подтверждает стабильность варианта. Этот вариант будет передан на завод «Сиббиофарм», где его активность будет тестирована в промышленных условиях.

Заключение

В результате исследования был получен штамм B. licheniformis N2E1-2(С), продуцирующий бацитрацин с активностью 25500 мкг/мл, что в 1,7 раза превышает активность промышленного штамма B. licheniformis 356. Впервые исследовано воздействие нейтронного облучения на бактериальную культуру и ее способность синтезировать антибиотик.

Список литературы

1. Альбертс Б, Брей Д, Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. - М.: Мир. - 1994. - 517 C.

2. Безбородов А.М. Ферменты микроорганизмов и их применение. // Биотехнология. - М.:

Наука. - 1984.

3. Быков В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н. и др. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. - М .: Высшая школа. - 1987.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Высшая школа. - 1986. - 448 C.

5. Кефели В.И., Дмитриева Г.А. Биотехнология // Курс лекций. - Пущино. - 1989. - 96 С.

6. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение - М.: Мир. - 1988. - 480 C.

7. Ciesiolka J et al. Antibiotic bacitracin induces hydrolytic degradation of nucleic acids. // Biochimica et Biophysica Acta. - 2014. - N 1840. - P. 1782-1789.

8. Epperson J, Ming L. Proton NMR studies of Co(II) complexes of the peptide antibiotic bacitracin and analogues: insight into structure-activity relationship. // Biochemistry. - 2000. - N 39. - P. 4037-4045.

9. FEichenwald H. Antibiotic drug therapy in the newborn. // Pediatr. Pharmacol. - 1983. - N 3. -

P. 181-187.

10. Huyghebaert G, De Groote G. The bioefficacy of zinc bacitracin in practical diets for broilers and laying hens. // Poultry Sci. - 1997. - N 76. - P. 849-856.

11. Ming L, Epperson J. Metal binding and structure-activity relationship of the metalloantibiotic peptide bacitracin. // Inorg. Biochem. - 2002. - N 91. - P. 46-58.

12. Taskaev S, et al. Accelerator based neutron source for the neutron-capture and fast neutron therapy at hospital. // Nuclear Instr. and Methods in Physics Research. - 1998. - N 413(2-3). - P. 397-426. 13. Taylor A. Aminopeptidases: Structure and function. // FASEB Journal. - 1993. - N 7(2). - P. 290-298.

13. Veith B et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. // Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2004. - N 7(4). - P. 204-211.

Размещено на Allbest.ru