Патоморфология раневого процесса в зоне глубокого ожога кожи в условиях применения низкоинтенсивного электромагнитного излучения

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Патоморфология раневого процесса в зоне глубокого ожога кожи в условиях применения низкоинтенсивного электромагнитного излучения

14.0015 - Патологическая анатомия

Автореферат

на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Болтовская Виолетта Викторовна

Саратов 2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: Доктор медицинских наук профессор Волова Лариса Теодоровна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук профессор Богомолова Нина Викторовна

Доктор медицинских наук профессор Туманов Владимир Павлович

Ведущая организация - Государственное учреждение «Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН»

Защита состоится декабря 2006 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.094.01 при ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет»

Автореферат разослан 12 ноября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Г.Н. Маслякова

электромагнитный ожог патоморфологический фибробласт

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Термические ожоги кожных покровов занимают видное место в структуре бытового и производственного травматизма. Технический прогресс не только не привел к снижению числа ожоговых травм; наоборот, частота термических поражений и летальность среди обожженных имеют явную тенденцию кросту (А.А. Алексеев и соавт.; 2000). Ожоги нередко сопровождают техногенные катастрофы и военные конфликты; количество ожогов, полученных в быту, также не уменьшается (Л.И. Герасимова 2000).

В нашей стране ежегодно получают ожоги более 400 тысяч человек, из них 30-35% составляют дети до 14 лет - «золотой фонд» и будущее нации. Общепризнанно, что наибольшую опасность для жизни представляют обширные глубокие ожоги, сопровождающиеся развитием тяжелой ожоговой болезни. Поэтому традиционно наибольшее внимание в комбустиологии уделяется этой проблеме. Однако в настоящее время отмечается прогрессивный рост локальных глубоких ожогов, при которых зона поражения не превышает 10% поверхности тела. Удельный вес этой категории пострадавших увеличился за последние 30 лет вдвое и достиг 60 % от общего числа находящихся на стационарном лечении (В.В. Азолов и соавт., 1998). Лечение таких больных представляет собой серьезную медико-социальную проблему, значение которой с каждым годом возрастает. Эти ожоги, особенно если они располагаются в области лица, шеи, кистей, стоп, крупных суставов, нередко приводят к тяжелым функциональным и/или эстетическим дефектам вплоть до инвалидизации пациентов (Б.А. Парамонов и соавт, 2000).

Одной из основных проблем лечения пострадавших от ожогов на протяжении всей истории развития комбустиологии является своевременность и полнота восстановления кожных покровов, утраченных в результате ожоговой травмы. От этого во многом зависят характер течения и исход периода реконвалесценции, а, значит, и качество жизни пострадавших. Не менее важной проблемой является профилактика послеожоговых рубцов. Используемые в этой связи наиболее распространенные в России консервативные методы оказываются зачастую недостаточно эффективными (Азолов В.В., Г.И. Дмитриев, 1995).

В связи с вышеизложенным разработка новых и совершенствование существующих консервативных методов, в том числе не инвазивных с использованием физиотерапевтических средств, направленных на профилактику образования грубых обезображивающих рубцов при глубоких ожогах кожных покровов, является весьма актуальным.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить эффективность применения низкоинтенсивного электромагнитного излучения (НЭМИ) в комплексе лечебных мероприятий при ограниченных ожогах III Б степени на основе изучения особенностей морфогенеза в зоне термического повреждения кожи.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать модель получения унифицированной ограниченной ожоговой раны III Б степени у крыс и проанализировать влияние экспериментального коагуляционного некроза кожи на организм животного.

2. In vivo в эксперименте на крысах исследовать в динамике влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения в комплексе со стандартным лечением коагуляционного некроза кожи на характер репаративных процессов в области ожоговой раны и сравнить с результатами только медикаментозной терапии.

3. Оценить на организменном, органном, и тканевом уровнях степень общей реакции организма и некоторые показатели гомеостаза у крыс в динамике при комплексном лечении ожоговой раны в различных сериях эксперимента

4. In vitro с помощью комплекса морфологических, в том числе авторадиографического, морфометрических и биохимических методов исследовать прямое воздействие НЭМИ на морфофункциональное состояние дермальных фибробластов в культуре.

5. In vitro оценить пролиферативную и коллагенсинтетическую активность монослоя дермальных фибробластов при воздействии НЭМИ и без него.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые предложен и разработан новый экспериментальный метод моделирования ожога III-Б степени кожи (удостоверение на рационализаторское предложение №400 от 07.04.2004г.). Необходимая степень повреждения тканей строго согласуется с дозой теплового воздействия, что позволяет получать унифицированную по площади и глубине ожоговую рану. Метод прост в выполнении и дает возможность применять для обработки цифровых данных компьютерные программы.

Впервые в эксперименте in vivo на организменном, органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях в динамике с помощью комплекса морфологических, морфометрических и биохимических методов изучено и обосновано использование НЭМИ в комбинированном лечении глубокой ожоговой раны.

Исследования in vitro на культуре клеток фибробластов позволили впервые установить новый факт и раскрыть механизм воздействия НЭМИ на организм - его непосредственное влияние на морфофункциональное состояние клеток дермы. Использование комплекса количественных морфологических и биохимических методы исследования для оценки показателей пролиферативной и коллагенсинтетической функции фибробластов в культуре и ростовой среды обнаружило, что под действием НЭМИ происходит альтерация части клеток монослоя и выход в культуральную среду биологически активных веществ. В результате наблюдается стимуляция роста фибробластов при снижении их коллагенсинтетичсеской функции. Этим объясняется образование нежного рубца без грубых пучков коллагеновых волокон, наблюдаемых у животных со стандартной медикаментозной терапией в результате выраженного фиброза образовавшейся соединительной ткани.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Предложенный нами метод моделирования локального ожога кожи позволяет получить в эксперименте ожоговые раны, одинаковая по глубине и площади поражения. Метод прост в исполнении и воспроизводим с достаточно высокой точностью.

Применение НЭМИ в комплексе терапевтических мероприятий позволит качественно улучшить результаты лечения больных с локальными ожогами III Б степени, предотвращает развитие грубых келоидных рубцов в области термического ожога кожи.

Проведенные доклинические испытания на живых системах (животных и культурах клеток) позволяют проводить лечебные мероприятя у больных с использованием низкоинтенсивного электромагнитного излучения (НЭМИ), которое оказывает выраженное положительное действие на процессы регенерации в области ограниченной ожоговой раны кожных покровов III-Б степени

Проведенные впервые в мире исследования in vitro на культуре клеток дермальных фибробластов позволили раскрыть механизмы прямого действия НЭМИ на морфофункциональное состояние этих клеток. Количественные морфологические (морфометрические) и биохимические методы исследования показали стимулирующее влияние НЭМИ на пролиферативную и коллагенсинтетическую функции фибробластов за счет альтерации части клеток монослоя и выхода в культуральную среду биологически активных веществ и ростовых факторов (решение о выдаче патента на изобретение №2005105082/006440 от 24.02.2005 )

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные результаты диссертационного исследования были внедрены в Ожоговые центры городской больницы №7 г. Саратова и городской больницы №1 им.Н.И. Пирогова г. Самары, в учебный процесс кафедр патологической анатомии, гистологии и эмбриологии, восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии ИПО, общей хирургии с курсом оперативной хирургии и ЦНИЛ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» и подтверждены актами внедрения

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы доложены на 12^TH INTERNATIONAL CONGRESS OF THE EUROPEAN ASSOCIATION OF TISSUE BANKING. Brugge, Belgium. November 5-8, 2003

Материалы диссертации доложены на конференции «Теория и практика клеточных биотехнологий», проходившей в рамках II Всероссийского симпозиума с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты клеточных и тканевых биотехнологий (Самара, июнь 2004); на Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, сентябрь 2006); на Поволжском форуме по восстановительной медицине, курортологии и физиотерапии (Самара, октябрь 2006).

Диссертация апробирована на совместном заседании ЦНИЛ, кафедр патологической анатомии, общей хирургии с курсом оперативной хирургии и гистологии СамГМУ. Предзащита состоялась в Саратовском ГМУ на заседании кафедр патологической анатомии, гистологии и судебной медицинской экспертизы.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ, 2 из них - в журналах рекомендованных ВАК, 1рационализаторское предложение, 1 решение о выдачи патента «Способ стимуляции роста фибробластов в культуре» № 2005105082\13(006440).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 180 источника, в том числе 40 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами, 72 рисунками.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Разработанный способ моделирования локального ожога кожных покровов позволяет воспроизводить в эксперименте унифицированные ожоговые раны, строго дозированные по глубине и площади.

Ожоговые раны III Б степени при площади поражения 6 % в эксперименте при отсутствии лечения приводят к поражению всего организма и нарушению гомеостаза, о чем свидетельствует тяжелое общее состояние животных, стабильно высокие показатели лейкоцитов, гистамина, серотонина и свободного оксипролина в периферической крови, развитие гнойных осложнений и гибель животных в течение первых 10 суток эксперимента.

Стандартная мазевая терапия помогает сохранить жизнь экспериментальных животных в течение всего срока наблюдения, способствует полному заживлению ожоговой раны, но не препятствуют образованию грубых деформирующих рубцов в которых толстые тяжи коллагеновых волокон располагаются параллельно эпидермису, отсутствуют придатки кожи и очень мало кровеносных сосудов.

У животных, получавших НЭМИ на фоне медикаментозной терапии, по сравнению с крысами, получавшими только медикаментозную терапию, наблюдали улучшение общего состояния уже со вторых суток эксперимента, выраженный противовоспалительный эффект с характерным появлением большого количества тучных клеток, отсутствие фиброза, восстановлении е дериватов кожи в зоне коагуляционного некроза. Использование в комплексе лечебных

Исследования in vitro на культурах клеток позволили установить не описанный ранее механизм непосредственное воздействие НЭМИ на морфофункциональное состояние дермальных фибробластов: усиление пролиферативной активности клеток с одновременным снижение их коллагенсинтетической функции. Этим объясняется формирование у экспериментальных животных нежных нормотрофических рубцов, за счет дозированного синтеза и отсутствия избытка выработки коллагена.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика объектов, материала и методов исследования

Экспериментальное исследование выполнено на базе Центрального научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) Сам ГМУ (директор - профессор, д.м.н. Л.Т. Волова) в рамках научной тематики ЦНИЛ: «Регуляция регенераторных процессов в опорных и покровных тканях организма за счет дифференцированного применения аллогенных тканей, культуры клеток, тканевых компонентов, лекарственных и немедикаментозных факторов воздействия». Работа состоит из двух частей: в первой на лабораторных животных (крысах) изучали влияние низкоинтенсивной электронейростимуляции на течение ожоговой раны, во второй исследовали прямое действие этого физического фактора на аллогенные фибробласты в культуре.

Экспериментальный ожог III Б степени площадью 6% от поверхности тела воспроизводили разработанным нами способом в течение 35 сек. (Удостоверение на рационализаторское предложение № 400 от 7.04.2004).

Модель ожоговой раны получали следующим образом. В межлопаточной области у крыс под эфирным наркозом тщательно выбривали кожу. Операционное поле обрабатывали 70° спиртом. Плоскодонную стеклянную колбу с диаметром дна 5 см, наполненную кипятком, прикладывали к выбритому участку кожи на 35 секунд.

Экспериментальные исследования на животных проведены на 164 белых лабораторных крысах обоего пола с соблюдением всех этических требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными (Приказ № 755 МЗ СССР от 12.08.77 года). Вес животных в начале эксперимента был от 170 до 190 граммов. В 12 предварительных экспериментах было отработано время получения ожога III Б степени. Остальные 152 крысы были разделены на две группы: опытную (140) и контрольную (12 здоровых крыс). Всем крысам опытной группы воспроизводили термический ожог в межлопаточной области. После воспроизведения ожога разработанным нами способом. животные были разделены на 3 серии: в 1 серии рана заживала без какого-либо медикаментозного воздействия; во 2 серии рану в течение 14 дней (до отторжения струпа) ежедневно обрабатывали многокомпонентым препаратом на водорастворимой основе «Левомеколь», а затем рану вели под повязкой с метилурациловой мазью до заживления; в 3 серии к вышеописанной стандартной схеме лечения добавляли физиотерапевтичесое воздействие в виде низкоинтенсивного электромагнитного излучения (НЭМИ). Хирургическую обработку раны не проводили.

Электромагнитное воздействие осуществляли бесконтактным методом с зазором 3 см над раной в постоянном режиме при минимальной энергии 50 мкА в течение 10 минут. Сеансы проводили ежедневно, начиная со следующего дня после нанесения ожога, в течение 10 дней. Использовали аппарат ЭСИ-032-1 «Протон».

В течение всего срока эксперимента животных ежедневно осматривали, отмечали их общее состояние, активность, характер шерстного покрова, состояние раны и окружающих тканей.

Из эксперимента крыс выводили при помощи гильотины через 7, 14, 28 и 45 суток и через 3 месяца после воспроизведения ожога. Во все указанные сроки забирали материал для общеклинического, гистологического и биохимического исследования.

Морфологическому анализу подвергали область раневого дефекта с прилежащей кожей и подлежащими мышцами. Серийные парафиновые срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон, орсеином по Унна-Тенцеру для выявления эластических волокон, а также проводили авторадиографию с ³Н-тимидином (Меркулов Г.А., 1969; Лилли Р., 1969). ³Н-тимидин вводили в дозе 40 МБК на 1 кг массы за час до выведения из эксперимента. Полученные препараты обрабатывали фотоэмульсией в течение 2 недель, промывали в дистиллированной воде и окрашивали гематоксилином и эозином. Всего было изготовлено и изучено 900 гистологических препаратов. Гистологические срезы изучали, анализировали и фотографировали с помощью системы анализа изображений на базе Pentium 4, состоящей из светового микроскопа Olympus и цифровой фотокамеры Olympus С 310.

Для количественной оценки процессов воспаления определяли в периферической крови количество лейкоцитов с развернутой лейкоцитарной формулой, в сыворотке крови - содержание гистамина и серотонина по методике Л.Я.Прошиной (1981) в модификации Подковкина В.Г. и соавт. (2003).

Для оценки метаболизма коллагена в организме экспериментальных животных определяли количественное содержание свободного и белковосвязанного оксипролина в плазме крови реакцией с п-диметиламинобензальдегидом по методике Т.В. Замараевой (1977).

Прямое действие НЭМИ на фибробласты, являющиеся главными клетками репаративной фазы воспаления, изучали на первичной культуре дермальных фибробластов крыс.

Первичную культуру фибробластов получали по стандартной методике первичных эксплантатов (Р.Адамс, 1983; К.Н. Гринберг и соавторы, 1988; Б.А.Парамонов и соавт., 2000) из кожи крысят в возрасте 2 дней. Клетки культивировали в стандартных условиях в термостате Sanyo - Incubator MIR-262 при температуре 37°С в среде МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки в пластиковых культуральных флаконах Corning (производство США) площадью 25 смІ. Опыты проводили на клетках 4-8 и 15-20 пассажей. Облучение проводили в постоянном режиме бесконтактным методом со стороны дна флакона с зазором 1 см при минимальной энергии 50 мкА, частоте импульсов 77±3 Гц, амплитуде импульса не менее 50 В и времени воздействия 5 минут. Сеансы проводили ежедневно, начиная со следующего дня после пересева, в течение 5 дней. Использовали аппарат ЭСИ-032-1 «Протон». Контролем служили фибробласты той же линии и одноименного пассажа.

Ежедневно проводили визуальные наблюдения и морфометрию нативной культуры. Оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структурные элементы клеток.

Плотность клеток монослоя на единицу площади и количество поврежденных клеток (на 200 клеток) определяли с помощью окулярной сетки Автандилова, а количество слущенных клеток в культуральной жидкости и соотношение живых и мертвых клеток (при пересеве) - с помощью камеры Горяева. Рассчитывали время удвоения культуры. При пересеве забирали из экспериментальных и контрольных флаконов культуральную среду, в которой исследовали содержание свободного и белковосвязанного оксипролина для оценки коллагенсинтетической функции дермальных фибробластов ( ). По окончании эксперимента ростовую среду из чашек удаляли, клетки фиксировали 96% спиртом и окрашивали азур-эозином по Романовскому.

Весь цифровой материал обработан методом вариационной статистики с использованием критерия Стъюдента с заданной вероятностью 95 %.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами был разработан способ моделирования ожога III Б степени (Удостоверение на рационализаторское предложение № 400 от 7.04.2004), достоинствами которого являются: простота выполнения; возможность дозирования повреждающего фактора по времени, что позволяет ожоги необходимой глубины; возможность получения ожоговой раны заранее заданной площади; возможность точного вычисления площади ожоговой раны. Устройство для создания модели термического поражения состоит из плоскодонного стеклянного стакана с диаметром дна 5 см, наполненного водой, кипятильника и термометра.

В предварительных экспериментах на 12 крысах мы установили, что для воспроизведения ожога III Б степени площадью 6 % от поверхности тела крысы и при использовании нашего устройства необходимо время 35 сек. Площадь ожога вычисляли по формуле круга рr². В нашем эксперименте она составляет 3,14 х 2,5² = 19,625 см ^2. Для расчета поверхности тела у крыс использовали формулу Мее-Рубнера: S=К· W^0,60 в модификацию Lee (1929), где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, K - коэффициент, равный 12,54 , W - вес животного в граммах.

Площадь поверхности тела животных в нашем эксперименте была равна в среднем 336,44±12,67 см ². Так как абсолютная площадь поражения была одинаковой во всех случаях (19,625 см ²), то относительная площадь ожога составит 5,83±0,17 %.

Наши исследования показали, что такое воздействие вызывает у крыс развитие коагуляционного некроза, распространяющегося на все слои кожи. Ожоговая рана формируется на 2-е сутки от начала опыта. У крыс, которым не применяли никакого лечения (1 серия экспериментов), уже с третьих суток начиналось размягчение центральной части грубого толстого струпа, при надавливании из-под него выделялся серозно-гнойный экссудат. На седьмые сутки зона термического поражения представляла собой типичный коагуляционный некроз: наблюдалась деструкция всех компонентов кожи (эпидермиса, сосочкового и сетчатого слоев дермы), весь очаг был обильно инфильтрирован полиморфноядерными лейкоцитами с небольшой примесью лимфоцитов и макрофагальных элементов. Можно было видеть детрит, кровоизлияния различного размера, как в зоне диффузной, так и очаговой лейкоцитарной инфильтрации. В тканях дна раны сохранялись отек, застойное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла, появлялись макрофагальные элементы. Грануляционная ткань росла в виде коротких тонких тяжей пролиферирующих фибробластов веретенообразной формы, сопровождаемых капиллярами, по направлению от краев раны к ее центру, вместе с тем у 34% животных такие явления отсутствовали. Количество пролиферирующих фибробластов в поле зрения составляло 1,8±0,5. На расстоянии 0,1-0,3 мм от краев раны мы наблюдали регенерацию эпидермиса в виде небольших тонких пластов новообразованных кератиноцитов. В 63% случаев некоз распространялся на гиподерму и подлежащие мышцы. При биохимическом исследовании у животных наблюдался высокий лейкоцитоз (на 3 сутки 23,80,910⁶ , ри норме 11,81,210⁶ ), значимое увеличение процентного содержания нейтрофилов и снижение лимфоцитов в лейкоцитарной формуле (соответственно 64,51,8% при норме 34,31,6% 28,81,3% и при норме 57,81,8% ). Следует отметить, что в крови здоровых крыс преобладают лимфоциты при соответственно низком содержании полиморфноядерных лейкоцитов. Уже на 3 сутки остоверно повышается содержание в плазме свободного оксипролина (28,80,25 мкг/мл при норме 1 4,60,43 мкг/мл)^,, гистамина (0,387± 0,003 мкг/мл при норме 0,143± 0,004 мкг/мл) и падает содержание серотонина (0, 185± 0,004мкг/мл при норме 0,546± 0,004 мкг/мл). Такие биохимические сдвиги сохраняются в крови вплоть до гибели животных. При отсутствии лечения все крысы погибают в первые 10 суток опыта, находясь в тяжелом состоянии и при явлениях кахексии. По-видимому, у них развивается симптоиокомплекс ожоговой болезни.

Применение стандартной мазевой терапии (2 серия экспериментов) приводило к сохранению жизни крыс. Однако наблюдение позволило предположить развитие и у них симптомов ожоговой болезни: животные до конца эксперимента (90 суток) оставались несколько вялыми, отставали в весе от здоровых крыс того же возраста, нормализация биохимических показателей у них запаздывала по сравнению с животными, которым в комплексе лечебных мероприятий применяли НЭМИ, а в ряде случаев вообще не происходила.

В 3-ей серии, там, где дополнительно к стандартной медикаментозной терапии начали применять НЭМИ, уже с третьих суток опыта мы отмечали улучшение общего состояния крыс и несомненный анальгезирующий эффект. Формирование и отторжение струпа, также образование рубца у них происходило в те же сроки, что и во 2-й серии, однако мы отмечали здесь качественные отличия. Применение НЭМИ приводило к ослаблению экссудативной фазы воспаления у подопытных крыс, что выражалось макроскопически в значительно меньшей приподнятости краев раны и отсутствии серозно-гнойного отделяемого. Гистологически определяется ослабление отека, клеточной инфильтрации, микроциркуляторных расстройств в зоне термического поражении. Сформировавшийся струп был заметно тоньше, чем во 2-й серии, слабее инфильтрирован клеточными элементами, причем эритроциты практически отсутствовали. Характерно, что отклонения биохимических показателей от показателей здоровых животных были заметно слабее, чем в серии сравнения.

На 7 сутки эксперимента наблюдалось активная эпителизация раневого дефекта, причем если у края пласта в группе со стандартной мазевой терапией было не более 2 рядов клеток, то в основной группе - до 4 рядов. Следует отметить появление в группе сравнения очагов деструкции и лизиса вновьобразованного эпителия, чего мы не наблюдали в основной группе опытов. Образование грануляционной ткани у крыс, леченых только мазевыми препаратами в группе сравнения идет преимущественно на границе очага поражения, в центре сохраняется зона коагуляционного некроза, в то время как в основной группе этот процесс происходит равномерно по всему очагу поражения. Обращает на себя внимание появление вокруг сосудов на периферии регенерата тучных клеток.

На 14 сутки от начала лечения с НЭМИ у животных в основной группе была выявлена молодая грануляционная ткань. Она состояла из большого количества формирующихся сосудистых петель, ориентированных перпендикулярно к раневой поверхности, и многочисленных тяжей фибробластов. Тонкостенные сосуды расположены равномерно по всей грануляционной ткани, практически одинакового диаметра. Сосудистая сеть занимает 29,6±4,7% регенерата. Среди фибробластов встречались клетки с митозами. Отек практически отсутствовал, лейкоцитарной инфильтрации регенерата мы не наблюдали ни в одном случае. Характерной особенностью этой серии было выявление периваскулярно в грануляционной ткани и в дерме прилежащей интактной кожи большого количества тучных клеток (рис. 1).

Рис. 1. Тучные клетки в соединительной ткани регенерата вблизи кровеносных сосудов. Ожог+медикаментозная терапия+НЭМИ, 14 суток. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400

Со стороны сохранившейся кожи наползал новообразованный пласт, закрывающий раневую поверхность. Эпителий формировал характерные пласты светлых клеток с широкой цитоплазмой. В дерме можно было видеть фибробласты с митозами. При авторадиографии большое количество меток располагалось над ядрами фиброласов и эндотелиальных клеток (рис2). Вместе с тем в серии сравнения (с использованием стандартной мазевой терапии) на 14 сутки в зоне поражения сохранялись отек и нейтрофильная инфильтрация тканей с распространением некротических изменений в некоторых случаях на гиподерму и прилежащие скелетные мышцы, что мы рассматривали :как признаки продолжающейся экссудативной фазы воспаления. Микроциркуляторные расстройства выражены в форме венулярного полнокровия, явления стаза в капиллярах, гемолиза эритроцитов и краевого стояния (пристеночного расположения) форменных элементов в венулах и капиллярах. Сосудистая сеть занимала 21, 6±3,8%, однако сосудистые петли неравномерно располагались и заметно отличались по размерам друг от друга.

Рис. 2. Многочисленные метки над ядрами фибробластов и эндотелиальных клеток на 14 сутки опыта у крыс, получавших НЭМИ. АРГ с с ³Н-тимидином. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400

К 28 суткам ожоговая рана в обеих сериях была, за исключением центральной зоны, эпителизирована. В основной серии отмечалось равномерное формирование соединительной ткани по всему регенерату, в то время как в серии сравнения зрелость соединительной ткани уменьшалась от поверхности раны к ее дну. Полное заживление раны наступало на 45-е сутки опыта с образование тонкого нежного рубца, в котором появляются зачатки сальных желез и волосяных фолликулов. В серии сравнения формируется грубый рубец, в котором толстые пучки коллагеновых волокон расположены параллельно эпидермису. регенераторного процесса.

К концу опыта (90 суток) крысы опытной серии по внешнему виду и массе не отличались от здоровых; на месте ожоговой раны произошло полное восстановление волосяного покрова, при пальпации определялся мягкий подвижный рубец. В серии сравнения, где применялось только медикаментозное лечение, крысы до конца наблюдения оставались вялыми, с непостоянным аппетитом и отставали в массе и размерах от животных того же возраста. Такие полученные нами результаты косвенно подтверждают сведения об опосредованном действии НЭМИ на различные системы регуляции организма, иммуномодулирующем и общеукрепляющим действии этого фактора.

Выявленные морфологические изменения коррелируют с показателями периферической крови и результатами биохимических исследований медиаторов воспаления и коллагеногенеза. При использовании НЭМИ отмечаются более низкие показатели общего количества лейкоцитов периферической крови и меньшие сдвиги лейкоцитарной формулы, в то время как в серии животных, леченных только мазевыми препаратами, отмечается высокий лейкоцитоз, сопровождающийся значительным повышением содержания нейтрофилов и понижением - лимфоцитов. Наибольшие сдвиги количества клеток периферической крови наблюдаются на 7-е сутки опыта (количество лейкоцитов в 3-ей серии 18,3±1,2Ч10⁶ , во 2-й серии - 20,71,310⁶ при норме 11,81,210⁶; процентное содержание полиморфноядерных нейтрофилов соответственно 49±2,0% и 56,52,0% при норме 34,31,6%, лимфоцитов соответственно 36,7±1,5% и 35,61,6% при норме 57,81,8%. Содержание гистамина в сыворотке крови изменяется однонаправленно, однако у животных с НЭМИ, повышение его запаздывает по сравнению с крысами, не получавшими это воздействие, и снижение этого показателя начинается тоже раньше (на 28 сутки соответственно 0,332± 0,005 и 0,456± 0,005 при норме 0,143± 0,004 мкг/мл. В то же время показатели серотонина в сыворотке крови в группах сравнения значительно отличаются между собой. Если в группе со стандартной местной терапией серотонин остается на низком уровне, за исключением повышения его на 28 сутки, в серии с применением НЭМИ серотонин повышается в 3,5-6 раз с пиком тоже на 28 сутки. Этот медиатор воспаления очень лабилен и может служить тестом для оценки течения воспалительного процесса.

Выполненные нами экспериментальные исследования на живых системах in vitro позволили установить неизвестный ранее факт наличия прямого действия НЭМИ на морфофункциональное состояние малодифференцированных клеток дермы.

В эксперименте была использована первичная культура дермальных фибробластов крысы при различных вариантах интенсивности ее роста, разных посевных дозах и разном «возрасте» культуры. Проведенное нами комплексное исследование с морфологической, морфометрической и количественной оценкой клеток монослоя и использование нового способа определения маркеров коллагена в культуральной жидкости позволили нам раскрыть механизм действия данного физиотерапевтического фактора. Первичной культуре мы отдали предпочтение перед линейными клетками потому, что такие культуры наиболее чувствительны ко всем внешним факторам, а клетки таких культур по своим фенотипическим и генотипическим характеристикам наиболее близки к соответствующим клеткам здорового организма.

Дермальные фибробласты, которые мы получали из кожи двухдневных крысят, в чистой культуре растут в виде типичных «завитков», формируя полный монослой в ранних пассажах (4-й - 12-й) к концу четвертых суток после пересева. Плотность насыщения достигается на 5-е -6-е сутки и составляет 204,1±3,6 кл/0,1 мм². В первые дни культивирования фибробласты в культуре распластаны по дну флакона, каждая клетка имеет от 2 до 4 отростков, которые анастомозируют с отростками соседних клеток (рис.). Цитолемма и кариолемма нативных клеток четко контурируют, цитоплазма гомогенная, центрально расположенные ядра пузырьковидные, округлой формы, имеют гладкую тонкую оболочку и содержат 1-2 крупных ядрышка. При достижении полного монослоя форма фибробластов становится веретеновидной, тела клеток прилежат друг к другу (рис.), поэтому анастомозы между клетками прослеживаются плохо. В эти сроки культивирования можно видеть единичные клетки в состоянии апоптоза: цитолемма выглядит грубой толстой полосой, в цитоплазме - грубая зернистость, иногда вакуоли, ядра уменьшены в размерах, с утолщенной, несколько «гофрированной» оболочкой и нередко располагаются эксцентрично. В дальнейшем, по нашим наблюдениям, такие клетки погибают и слущиваются в ростовую среду.

Воздействие НЭМИ на культуру дермальных фибробластов 4-20 пассажей оказывало однонаправленное эффект вне зависимости от срока от момента пересева.

Под действием первого и второго сеансов облучения индуцируется апоптоз клеток в культуре, часть клеток гибнет и слущивается, причем этот процесс тем более выражен, чем более плотным является монослой. Так, если облучение было начато через 24 часа после пересева, таких клеток в ростовой среде значительно меньше, чем при достижении полного монослоя, но достоверно больше, чем в контроле. В результате в культуральную среду выходят биологически активные вещества (ростовые факторы, фибронектин, цитокины), которые активируют пролиферацию оставшихся фибробластов. Время удвоения клеток в культуре уменьшается в 1,5 раза, плотность клеток, достигаемая за одинаковое время, достоверно увеличивается по сравнению с контролем.

Количество погибших клеток зависит от плотности монослоя при первом воздействии НЭМИ. Так, при плотности менее 10 кл/0,1 мм² образование монослоя даже в молодой (до 10 пассажа) культуре происходит очень медленно (в течение 10-14 суток), а в некоторых случаях не происходит совсем. Применение НЭМИ приводит к слущиванию в ростовую среду от 3 до 5% клеток (4,12±0,87%), после чего достижение полного монослоя происходит не позднее 7 суток от момента пересева.

В «старых» культурах (15 и более пассажей) время удвоения клеток заметно увеличивается даже при посевной дозе 40 000 кл/0,1 мм² . Характерно, что НЭМИ активизирует пролиферацию не только на ранних сроках после пересева, но и при достижении «старой» культурой плотности насыщения. В течение нескольких часов после первого сеанса слущивается 31,7±2,94% всего монослоя, в результате плотность его через сутки составляет 135 кл/0,1 мм² вместо 204,1±3,6 кл/0,1 мм² до начала воздействия (табл). К концу вторых суток эксперимента, после двух сеансов НЭМИ, плотность монослоя составляет только 35,4% от исходной, в то же время количество поврежденных клеток в монослое значительно уменьшается, большинство фибробластов по своим структурным характеристикам соответствуют клеткам нормальной культуры 4-10 пассажа. Затем начинается активная пролиферация фибробластов, и к концу наблюдения они образуют ровный монослой.

При этом трансформации клеток не происходит. Клетки в культуре до 30 пассажа сохраняли характерные для нормальных фибробластов форму, размеры, структуру цитоплазмы, ядерно-цитоплазменные отношения. Ни разу после воздействия НЭМИ, мы не наблюдали стратификации слоя или резкого уменьшения времени удвоения культуры. После пересева фибробласты ведут себя подобно клеткам 4-8 пассажа; время удвоения составляет 24±1, 2 часа, характер роста не отличается от обычного.

Следует отметить, что характерной особенностью воздействия НЭМИ на культуру дермальных фибробластов является то, что активизация пролиферации клеток во всех случаях сопровождается падением содержания белковосвязанного оксипролина в культуральной жидкости ( во всех сериях содержание его от 1,39 до 1,44 мкг/мл при норме 3,45±0,37 мкг/мл), что свидетельствует об ослаблении коллагенсинтетической функции клеток. При этом содержание свободного оксипролина в этой среде значимо повышается (соответственно 1 серия - 5, 00±0,32 мкг/мл; 2 серия - 27,1±0,37 мкг/мл; 3 серия - 6,05±0,46 мкг/мл; 4 серия - 7,82±0,49 мкг/мл при норме 2,29±0,12 мкг/мл), что подтверждает разрушение части клеток под действием излучения.

ВЫВОДЫ

1. Предложенный и разработанный нами простой способ моделирования термического ожога кожи позволяет получать унифицированные ожоговые раны, строго дозированные по площади и глубине. Коагуляционный некроз всех слоев кожи (ожог III Б степени), занимающий 6% площади кожного покрова крыс без лечения вызывают тяжелые нарушения гомеостаза животных и приводят в результате к 100 % их летальности в течение первых 10 суток от начала эксперимента.

2. Местное лечение мазевыми препаратами глубокого ограниченного ожога кожи способствует сохранению жизни животных, но не приводит к нормализации гомеостаза и не предохраняет от развития на месте поражения грубых деформирующих рубцов.

3. Использование НЭМИ в сочетании с местным стандартным лечением ожоговой раны обеспечивает улучшение общего состояния животных, предотвращает развитие кахексии, наблюдаемой у подопытных крыс без применения физиотерапевтического фактора и способствует формированию нежного бледно окрашенного рубца вследствие полноценного восстановления эпидермиса, волокнистого компонента дермы и появления дериватов кожи.

4. Исход регенераторного процесса напрямую зависит от выраженности воспалительного компонента в зоне термического повреждения кожи. У крыс, леченных с применением НЭМИ, отмечалось уменьшение лейкоцитарной инфильтрации и отека, по сравнению с животными, получавшими только мазевую терапию. Отличительной особенностью опытной серии является появление вокруг сосудов новообразованной соединительной ткани тучных клеток, синтезирующих медиаторы воспаления.

5. Морфологические данные на всех этапах эксперимента коррелируют с показателями периферической крови и результатами биохимических исследований. У животных, получавших НЭМИ, снижается лейкоцитоз и значимо повышается уровень серотонина, в отличие от группы крыс, получавших только медикаментозную терапию. Закономерным является повышение на протяжении всех сроков показателей как свободного, так и белковосвязанного оксипролина. с пиком на 28-е сутки.

6. Исследования на культуре дермальных фибробластов позволили впервые выявить ранее не известный факт прямого действия НЭМИ на морфофункциональное состояние малодифференцированных клеток соединительной ткани кожи.

7. Использование при воздействии НЭМИ комплекса морфологических, морфометрических и биохимических методов в изучении монослоя фибробластов и маркеров коллагена в культуральной жидкости позволили раскрыть механизм его влияния на процессы пролиферации и синтетической функций фибробластов, Установлено, что после облучения часть клеток погибает, вследствие этого в среду выходят биологически активные вещества, стимулирующие рост фибробластов. При этом усиление пролиферативной функции фибробластов сопровождается уменьшением коллагеногенеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Устройство, состоящее из стеклянного стакана с круглым плоским дном, кипятильника и термометра, может быть использовано для моделирования у животных термических поражений кожи, унифицированных по площади и глубине. Площадь ожога легко рассчитывается по формуле рr² С целью определения относительной площади ожога для расчета поверхности тела у крыс удобно использовать формулу Мее-Рубнера: S=К· W^0,60 в модификацию Lee (1929), где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, K - коэффициент, равный 12,54 , W - вес животного в граммах. Изменяя диаметр дна устройства и время воздействия, можно воспроизводить термические поражения необходимой глубины и площади. Проведенные доклинические испытания на живых объектах (животных и культуре клеток) позволяют рекомендовать применение НЭМИ в комплексе местной терапии у больных с ограниченными глубокими термическими ожогами кожи.

Полученные нами в эксперименте данные позволяют рекомендовать применение НЭМИ в комплексном лечении локальных глубоких ожоговых ран. Проводить такое терапевтическое лечение необходимо по следующей схеме: длительность сеанса 10 минут, продолжительность лечения - 2 курса по 10 ежедневных сеансов с перерывом между курсами 10 дней, постоянный режим, минимальная энергия, частота 77 Гц, зазор 2-5 см над поверхностью раны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bioethical aspects of cellular technologies // 12^th International Congress of the European Association of Tissue Banking. Abstracts. Brugge, Belgium - 2003. - p. 129-130 (В соавторстве с L.T. Volova, V.V. Rossinskaya, I.N. Naumova).

2. Косметические аспекты хирургической ортопедической практики // Сб. статей Самарской городской юбилейной конференции, посвященной 75-летию городской детской больницы восстановительного лечения. - Самара, 2004. - С. 36. (В соавторстве с В.И. Рыжовым, С.В. Юрченко, П.В. Рыовым).

3. Cпособ лечения больных с инфицированными ожогами кожного покрова // Клинические и фундаментальные аспекты клеточных и тканевых биотехнологий. Теория и практика клеточных биотехнологий. Материалы II Всероссийского симпозиума с международным участием. - Самара, 2004. - С. 160-161 (В соавторстве с А.В. Колсановым, А.А. Филимоновым, К.А. Филимоновым).

4. Особенности морфогенеза ожоговой раны в условиях применения электромагнитной терапии // Морфология. 2006, т. 129, № 4. - С. 25 (В соавторстве с В.В. Россинской, Л.Т. Воловой, Л.Т. Кулагиной).

5. Низкоинтенсивное электромагнитное излучение как фактор регуляции восстановительных процессов кожи при глубоких термических ожогах // Сб. тезисов Поволжского форума по восстановительной медицине, курортологии и физиотерапии. - Самара, 2006. - С. 24-26.

6. Морфогенез глубокой ожоговой раны в условиях применения низкоинтенсивного электромагнитного излучения // Вестник Самарского государственного университета (естественнонаучная серия). 2006. - № 6/1 (46). - с. 212-219.

Размещено на Allbest.ru