Размещено на http://www.allbest.ru/

Нарушение иммунного гомеостаза при сочетанном действии дихлорэтана и тяжелой механической травмы

03.00.13 - физиология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иванов Дмитрий ЮРЬЕВИЧ

Саратов 2007

Работа выполнена ГОУ ВПО «Саратовский военный медицинский институт МО РФ» и ГОУ ВПО «Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты МО РФ».

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Громов Михаил Сергеевич кандидат медицинских наук, доцент Германчук Валерий Генадьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Моррисон Виталий Викторович

доктор медицинских наук, профессор Пучиньян Даниил Миронович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Волгоградский ГМУ Росздрава»

Защита состоится « » 2007 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012 г. Саратов, улица Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан « » 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Бабиченко Н.Е.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение действия токсичных химических веществ на иммунный гомеостаз, а также оценка возможностей коррекции его нарушений при помощи иммуностимуляторов в настоящее время привлекают все большее внимание физиологов, токсикологов, иммунологов и специалистов самых различных направлений в биологии и медицине [Забродский П.Ф. и соавт., 1993, 2001, 2002, 2004а; Смирнов В.С и соавт., 2000; Агапов В.И. и соавт., 2004;Vos J.G. et al., 1984; Loose L.D., 1986; Miller K., 1985; Descotes J., 1986; Descotes J., Mazue G., 1987; Luster M. J. et al., 1987; Sullivan J. B., 1989; Kimber I. et al., 2001; Friedman H. et al., 2003].

Особую актуальность в настоящее время имеет проблема изучения иммунотоксичности хлорированными углеводородами, в частности, 1,2-дихлорэтаном (ДХЭ), так как частота отравлений данными соединениями в последнее десятилетие существенно увеличилась [Венгеровский А.И. и соавт., 1993; 2004; Давыдова Е.В. и соавт., 1995; 2004б; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Елькин А.И. и соавт.,2004; Забродский П.Ф., Трошкин Н.М., 2006].

Область применения 1,2-дихлорэтана весьма обширна. ДХЭ используется в органическом синтезе как растворитель лаков и красок, дезинфицирующие средство, пестицид, в военной практике - для экстракции токсичных химикатов при их индикации [Нацюк М.В., 1979; Гембицкий Е.В., Бонитенко Ю.Ю., 1983; Тиунов Л.А., 1990; Забродский П.Ф. и соавт., 2004]. Следует отметить, что дихлорэтан является растворителем для боевого применения ипритно-люизитной смеси, а также для создания хлорсодержащих рецептур - дегазаторов вещества VX и сернистого иприта.

Несмотря на небольшую частоту острых интоксикаций ДХЭ (до 5%), они характеризуются весьма высокой смертностью отравленных. В последнее десятилетие частота смертельных исходов после острых интоксикаций ДХЭ не уменьшается и составляет от 20 до 96% [Курашов О.В., Троцевич В.А., 1992; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Елькин А.И. и соавт., 2004].

Групповые острые отравления ДХЭ возможны в процессе уничтожения ТХ, а также при аварийных ситуациях на химических предприятиях, когда в силу его высокой летучести ингаляционным отравлениям может подвергаться большое количество людей [Кокоровцева М.Г., 1982; Курашов О.В., Троцевич В.А., 1992]. При этом поражения ДХЭ могут сочетаться с механическими повреждениями, обусловливающими травматическую болезнь с выраженным иммунодефицитом [Кожевников В.С. и соавт., 1991].

Нельзя исключить возможность террористических актов на химических объектах, при которых острые поражения ДХЭ будут сочетаться с механическими травмами. При этом в настоящее время формирование иммунодефицитного состояния при сочетанном действии ДХЭ и механической травмы практически не исследовано.

Не вызывает сомнения, что одной из причин танатогенеза при острых отравлениях ДХЭ в сочетании с тяжелой механической травмой (ТМТ) являются инфекционные заболевания и осложнения (постинтоксикационные пневмонии), обусловленные снижением показателей иммунной системы в результате иммунотоксических эффектов как ДХЭ, так и его высокотоксичных метаболитов, - 2-хлорэтанола, хлоруксусного альдегида, хлоруксусной кислотой [Забродский П.Ф. и соавт., 1998, 2002, 2004а, 2004б; 2006; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Friedman H. et al., 2003]. При этом механизм и характер изменений иммунной защиты в условиях острой интоксикации ДХЭ в сочетании с механической травмой в настоящее время изучены недостаточно; не исследована также взаимосвязь нарушений иммунного гомеостаза с перекисным окислением липидов (ПОЛ) и изменением функции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы [Алиев Н.А., 1991б; Забродский П. Ф., 1998, 1999б, 2002; Быкова А.А., Сединина Н.С., 2002; Descotes J., 1986; Luster M. I. et al., 1987; Friedman H. et al., 2003].

Изучение патогенетически обоснованной коррекции нарушений иммунного гомеостаза при остром действии ДХЭ в сочетании с механической травмой имеет как теоретическое значение, раскрывая неизвестные физиологические механизмы регуляции иммуногенеза, так и практическое, позволяя обеспечить профилактику и лечение возникающих при острых интоксикациях данным соединением в сочетании с физическими факторами многочисленных инфекционных заболеваний в результате дисфункций системы иммунитета вследствие формирования вторичного иммунодефицитного заболевания [Хаитов Р. М. и соавт., 1995; Забродский П. Ф., 1998, 2002, 2004а; Агапов В.И. и соавт., 2004; Descotes J., 1986; Luster M. I. et al., 1987; Georgiev V. S., Yamaguchi H., 1993; Sepulveda R.T. et al., 2002; Zhang P. et al., 2002]. Изучение нарушений физиологической регуляции различных звеньев иммуногенеза, Т- и В - системы иммунитета при сочетанном остром отравлении ДХЭ в сочетании с ТМТ имеет важное значение для целенаправленного применения иммуномодуляторов из большого арсенала известных веществ данного класса для профилактики инфекционных осложнений и заболеваний.

Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту дихлорэтана, высокую летальность при отравлении им, возможное сочетание острых отравлений с механической травмой при авариях, катастрофах и террористических актах, недостаточно изученные особенности его действия в сочетании с механической травмой на механизмы регуляции системы иммунитета, следует заключить, что проблема изучения механизмов и характера нарушений иммунного гомеостаза при острых отравлениях данным соединением в сочетании с ТМТ и исследование возможности их коррекции в постинтоксикационный (посттравматический) период важны как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования - изучить характер и механизмы нарушений иммунной защиты в условиях острой интоксикации 1,2-дихлорэтаном в сочетании с тяжелой механической травмой и разработать патогенетически обоснованные направления медикаментозной коррекции выявленных нарушений. иммунный интоксикация дихлорэтан травма

Задачи исследования:

1. Изучить влияние острого отравления 1,2-дихлорэтаном в сочетании с тяжелой механической травмой на функциональное состояние тимуса и селезенки, содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета.

2. Оценить основные клеточные иммунные реакции после действия 1,2-дихлорэтаном в сочетании с тяжелой механической травмой.

3. Исследовать изменения гуморального иммунного ответа и кооперации Т- и В-лимфоцитов после острого отравления 1,2-дихлорэтаном в сочетании с тяжелой механической травмой.

4. Определить роль специфических механизмов (изменение активности эстераз лимфоцитов) и неспецифических (состояние функции коры надпочечников, перекисного окисления липидов) в нарушении физиологической регуляции иммунного гомеостаза и формировании комбинированного постинтоксикационного и посттравматического иммунодефицитных состояний после сочетанного действия 1,2-дихлорэтаном и тяжелой механической травмой.

5. Обосновать коррекцию постинтоксикационного и посттравматического иммунодефицитных состояний после острой интоксикации 1,2-дихлорэтана в сочетании с тяжелой механической травмой.

Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые показано, что при острой интоксикации ДХЭ в дозе 0,7 ЛД₅₀ в условиях эксперимента на животных в сочетании с тяжелой механической травмой формирование вторичного иммунодефицита связано с суммацией иммуносупрессивных эффектов ДХЭ и ТМТ.

Установлено, что сочетанное действие острого отравления ДХЭ в дозе 0,7 ЛД₅₀ и ТМТ существенно снижает лимфоидные индексы тимуса и селезенки через 2 суток после воздействия. Уменьшение показателей, вызванных ДХЭ, под влиянием травматического повреждения усиливается. После воздействия травмы через 2 сут снижается содержание лимфоцитов в костном мозге, лимфоузлах и циркулирующей крови; острое отравление ДХЭ вызывает противоположный эффект, а при сочетанном действии факторов происходит редукция показателей, как и при травме.

Экспериментально показано, что сочетанный эффект острого отравления ДХЭ (0,7 ЛД₅₀) и травмы сопровождается уменьшением функции Т-лимфоцитов, оцениваемой по реакции торможения миграции лейкоцитов. При сочетании травматического воздействия и ДХЭ (0,7 ЛД₅₀) происходит суммация эффектов, снижающих реакцию ГЗТ, характеризующей как первичный, так и вторичный клеточный иммунный ответ. Отмечается аддитивный редуцирующий эффект факторов при оценке АЗКЦ и функции естественных клеток-киллеров спленоцитов крыс.

Показано, что после действия ДХЭ, травмы и их сочетания происходят преимущественно снижение Т-зависимого антителообразования, более выраженное в продуктивной фазе антителогенеза, нарушение функции Т- и В-лимфоцитов в эффекте кооперации клеток. Сочетанное действие факторов приводит к суммации их эффектов. Изменение динамики содержания антител в крови к Т-зависимому и Т-независимому антигенам после острого отравления ДХЭ и механической травмы носит сходный характер и при совместном действии химического и механического факторов происходит реализация аддитивного эффекта (суммация эффектов). Постинтоксикационная супрессия гуморальной иммунной реакции проявляется в большей степени, чем посттравматическая редукция тимусзависимого гуморального иммунного ответа.

Установлено, что снижение иммунных реакций при остром отравлении ДХЭ, травме и их сочетанном эффекте обусловлено значительным увеличением концентрации кортикостероидов в плазме крови. Супрессия клеточных иммунных реакций и Т-зависимого гуморального иммунного ответа при сочетанном действии ДХЭ и травмы, реализующаяся вследствие снижения активности ацетилхолинэстеразы Т- лимфоцитов тимуса и селезенки и числа спленоцитов, содержащих б-нафтил-АS-ацетатэстеразу и б-нафтилбутиратэстеразу, обусловлена эффектом ДХЭ.

Практически полное восстановление иммунного гомеостаза достигается применением наряду с антидотом ДХЭ ацетилцистеина, полиокисидония.

Практическая значимость. Доказано, что развитие комбинированного посттравматического и постинтоксикационн иммунодефицитных состояний в результате острой интоксикации ДХЭ в сочетании с тяжелой механической травмой предполагает применение иммуномодуляторов для его коррекции, действующих на гуморальное и клеточное звено иммунитета. На основе изучения характера формирования иммунодефицитного состояния после отравления ДХЭ в сочетании с ТМТ определены способы коррекции этого состояния, в частности, использование антидотной терапии ацетилцистеином.

Положения, выносимые на защиту

1. Под влиянием 1,2-дихлорэтана (0,7 ЛД₅₀) и тяжелой механической травмы, а также их сочетанного эффекта существенно снижаются лимфоидные индексы тимуса и селезенки, уменьшается содержание Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета и циркулирующей крови.

2. Острое отравление 1,2-дихлорэтаном (0,7 ЛД₅₀), действие тяжелой механической травмы и их сочетание сопровождаются уменьшением функции Т-лимфоцитов, редукцией реакции гиперчувствительности замедленного типа, антителозависимой клеточной цитотоксичности и супрессией активности естественных клеток-киллеров. При этом в снижении иммунных реакций роль 1,2-дихлорэтана более значима, чем эффект травматического повреждения.

3. 1,2-дихлорэтан (0,7 ЛД₅₀) в сочетании с тяжелой механической травмой уменьшает Т-зависимое антителообразование и Т-независимое преимущественно в продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивным периодом иммуногенеза. При этом в большей степени поражаются Th1-лимфоциты, с функцией которых связан синтез IgM, по сравнению с Th2-клетками, влияющими на продукцию В-лимфоцитами IgG, а эффекты химического и физического факторов суммируются

4. Нарушение регуляции иммунного гомеостаза и формирование комбинированного постинтоксикационного и посттравматического иммунодефицитных состояний при сочетанном действии 1,2-дихлорэтана и тяжелой механической травмы обусловлено реализацией неспецифических механизмов (активация функции коры надпочечников и перекисного окисления липидов) и специфических механизмов (снижение активности эстераз Т-клеток под влиянием 1,2-дихлорэтана). Выявлено аддитивное иммуносупрессивное действие 1,2-дихлорэтана и травматического повреждения.

5. Комбинированное применение ацетилцистеина (антидота 1,2-дихлорэтана) и иммуностимулятора полиоксидония восстанавливает показатели иммунного гомеостаза, сниженные сочетанным эффектом химического и физического факторов.

Апробация и реализация работы, публикации

Результаты исследований были доложены на межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» 25 октября 2006 г.Иркутск; на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Саратов, 2006г.); заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (октябрь 2005 г., май 2006 г., январь 2007г.); совместных научных конференциях кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава», технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты (декабрь 2005 г., апрель 2005 г., май 2007 г.); научно-практических конференциях Саратовского военно-медицинского института (апрель 2006 г., апрель 2007 г.) и внедрены в педагогический процесс кафедр технологии уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты, токсикологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института.

По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописи (включая таблицы, рисунки и библиографический указатель), состоит из обзора литературы; материалов и методов исследований; 5 глав собственных экспериментальных исследований; заключения, выводов. Работа иллюстрирована 34 таблицами. Библиографический указатель включает 296 источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований

Исследования проводились на 673 беспородных крысах, крысах Wistar обоего пола и на 73 мышах обоего пола. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180-240 и 18-22 г.

ДХЭ вводили внутрь в растворе оливкового масла в дозе 0,7 LD₅₀ (LD₅₀ для крыс и для мышей составляла 0,97+0,08 и 0,83+0,07 мг/кг соответственно).

Антидот ДХЭ ацетилцистеин (АЦ) [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000] применяли внутрибрюшинно однократно в дозе 300 мг/кг через 5-30 мин после отравления ДХЭ в дозе 1,5 ЛД₅₀ и затем ежедневно (однократно) в течение 2 сут в дозе 100 мг/кг. Тяжелую механическую травму вызывали сдавлением мягких тканей бедер с силой 1800 г/см² в течение 4 ч [Александров В.Н., 1982]. При моделировании сочетанного эффекта ДХЭ и ТМТ токсикант вводили через 10-30 мин после нанесения травматического повреждения.

Эксперименты проводили в светлое время суток (с 9.00. до 15.00 ч), характеризующееся минимальным содержанием кортикостерона (КС) в плазме крови крыс [Dhabhar F. S. et al., 1985].

Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).

Лимфоидный индекс тимуса и селезенки и содержание лимфоцитов в лимфоидных органах определяли общепринятым методом [Гольдберг Е. Д. и соавт., 1972; Сидельникова Н.М., 2004].

Исследование показателей Т-зависимого и Т-независимого гуморального иммунного ответа проводили через 5, 8 и 13 сутoк после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) и Vi-антигеном (Vi-Ag). Гуморальную иммунную реакцию к Т-зависимому и Т-независимому антигенам оценивали общепринятыми методами по титрам антител и числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке к ЭБ и Vi-Ag. Иммунизацию проводили путем внутрибрюшинного введения ЭБ в дозе 210⁸ клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и Vi-Ag в дозе 8 мкг/кг при изучении действия ДХЭ, ТМТ и их сочетания в индуктивной и продуктивной фазах гуморального иммунного ответа (иммунизацию проводили соответственно одновременно с действием факторов и за 3 суток до их воздействия).

Эффект кооперации Т- и В- лимфоцитов под влиянием ДХЭ, ТМТ и их сочетания для оценки роли Т- и В-лимфоцитов в обеспечение антителопродукции оценивали по методу J. K. Thomas, T. Imamura (1986).

Для оценки состояния клеточного звена системы иммунитета определялись функция Т-лимфоцитов по секреции ими фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов [Гембицкий Е.В. и соавт., 1987], реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), показатель антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [Зимин Ю.И., Ляхов В.Ф., 1985], активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) [Гордиенко С. М., 1984].

Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т-лимфоцитах крыс определяли методом G.M. Ellman et al. (1961), выделяя клетки по методике С.В Ширшева (1998). Активность ?-нафтил-АS-ацетатэстеразы и ?-нафтил-бутиратэстеразы спленоцитов крыс изучали гистохимическим методом [Хейхоу Ф. Г. Дж., Кваглино Д., 1983].

Для определения уровня кортикостерона в плазме крови крыс использовали флюорометрический метод определения уровня неконъюгированных 11-оксикетостероидов [Moor P., de et al., 1962; 1976] в модификации В.В. Давыдова (1970).

Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по активности каталазы и пероксидазы, содержанию малонового диальдегида общепринятыми методами [Валеева И.Х. и соавт., 2002].

Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых статистических методов. Расчеты проводились на персональном компьютере с использованием пакета программ Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Функциональное состояние тимуса, селезенки, содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета под влиянием 1,2-дихлорэтана, механической травмы и их сочетанного действия

Нами установлено, что при действии ДХЭ (0,7 ЛД₅₀), ТМТ и их сочетании через 2 сут происходит существенное снижение лимфоидного индекса (ЛИ) тимуса соответственно в 1,50; 1,75 и 1,99 раза (p<0,05). Аналогично изменялся ЛИ селезенки. Сочетанное действие ТМТ и ДХЭ приводит к суммации эффектов.

Проведенные эксперименты показали, что под влиянием ТМТ, ДХЭ, а также их сочетания число Т-лимфоцитов в тимусе крыс через 2 сут снижается соответственно в 2,12; 2,00 и 3,90 раза (p<0,05), а число лимфоцитов в селезенке - в 2,12; 2,06 и 3,10 раза (p<0,05) соответственно.

Через 6 сут после острого действия ДХЭ, ТМТ и их сочетания число Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоцитов в селезенке крыс практически восстанавливалось до контрольного значения. Отмечается аддитивное действие ДХЭ и травмы на данные параметры.

В результате проведенных опытов нами показано, что под влиянием ТМТ число лимфоцитов в костном мозге крыс через 2 сут снижается в 1,36 раза (p<0,05), а число лимфоцитов в лимфоузлах - в 1,38 раза (p<0,05). Острая интоксикации ДХЭ приводила к реализации такого же эффекта. При сочетанном действии факторов отмечался аддитивный эффект. Так, число лимфоцитов в костном мозге и лимфоузлах было снижено соответственно в 1,57 и 1,74 раза (p<0,05).

Через 6 сут содержание лимфоцитов в костном мозге и лимфоузлах практически восстанавливалось до контрольного уровня. При сочетанном действии факторов число лимфоцитов в органах системы иммунитета оставалось ниже контрольного уровня (p<0,05).

Нами экспериментально установлено, что под влиянием ТМТ содержание лимфоцитов в крови крыс через 2 сут снижается в 1,24 раза (p<0,05). Действие ДХЭ уменьшало содержание лимфоцитов в циркулирующей крови в 1,30 раза (p<0,05). При сочетанном действии факторов отмечался аддитивный эффект. Так, отмечалось снижение числа лимфоцитов в крови в 1,47 раза. Через 6 сут содержание лимфоцитов в крови статистически значимо не отличалось от контрольного уровня.

2. Влияние 1,2-дихлорэтана, тяжелой механической травмы и их сочетанного действия на клеточные иммунные реакции

Нами установлено, что при оценке функции Т-клеток по реакции торможения миграции лейкоцитов у крыс через 1 и 3 сут после острой интоксикации ДХЭ, механической травмы и их сочетанного действия отмечается увеличение миграции лейкоцитов Так, через 1 сут параметр, характеризующий редукцию функции Т-клеток, снижался соответственно на 17,8; 30,3 и 34,7% (р0,05). Тенденция к снижению функции Т-лимфоцитов при действии физического и химического факторов и их сочетанного эффекта сохранялась до 6 сут. Отмечалось более выраженное по сравнению с травмой действие ДХЭ на функцию Т-клеток. Сочетанное действие факторов приводило к суммации их эффектов.

В результате экспериментов на крысах нами установлено (табл. 1), что при

Таблица 1

Действие острого отравления ДХЭ (0,7 LD₅₀) в сочетании с механической травмой на формирование гиперчувствительности замедленного типа у крыс по приросту массы задней стопы, % (М+m; n=6-9)

Модель	Серии опытов	Факторы
		ДХЭ	Травма	ДХЭ+травма
ГЗТ без переноса клеток	К	33,1+2,0
	О	18,3+1,9*	22,4+1,8*	11,7+1,2?
Перенос клеток после иммунизации	К	80,5+6,4
	О	54,5+5,0*	61,0+5,3*	40,4+4,3?

Примечание: К, О - контроль, опыт, соответственно; * - различия достоверны по сравнению с контролем (р0,05); ? - различие достоверно по сравнению с контролем и изолированным действием травмы и ДХЭ - р0,05.

действии ДХЭ, ТМТ и их сочетания происходит снижение реакции ГЗТ, отражающей функцию Th1-лимфоцитов, соответственно в 1,81; 1,54 и 2,83 раза (р0,05). Аналогично уменьшалась реакция ГЗТ, характеризующая вторичный клеточный иммунный ответ (перенос клеток реципиентам после иммунизации доноров). При сочетании тяжелого травматического воздействия и ДХЭ отмечается суммация их эффектов. При этом основной вклад в редукцию реакции ГЗТ обеспечивается эффектом ДХЭ.

После действия ДХЭ (0,7 ЛД₅₀) на АЗКЦ в индуктивный и продуктивный периоды иммуногенеза происходило статистически значимое уменьшение АЗКЦ соответственно в 2,14 и 2,39 раза (р0,05). Аналогично снижала данный параметр ТМТ, а сочетанное воздействие факторов приводило к суммации их эффектов (табл. 2).

Таблица 2

Влияние острого действия ДХЭ (0,7 LD₅₀) в сочетании с ТМТ на антителозависимую клеточную цитотоксичность спленоцитов крыс через 5 сут, % (M+m; n=8-10)

Серии опытов	Время интоксикации по отношению к иммунизации, сут
	0	3
Контроль	10,5+1,2
ТМТ	6,1+0,9*	5,0+1,0*
ДХЭ	4,9+0,8*	4,4+0,6*
ДХЭ+ ТМТ	3,5+0,7?	2,7+0,5?

Примечание: * - различие с контролем достоверно - р0,05; ? - различие достоверно по сравнению с контролем и действием ДХЭ и ТМТ - р0,05

При изучении влияния на ЕКК (естественную цитотоксичность - ЕЦ) ДХЭ, ТМТ и их сочетания нами установлено (табл. 3), что токсикант, ТМТ и их

Таблица 3

Влияние острого отравления ДХЭ (0,7 DL₅₀), ТМТ и их сочетания на активность (%) естественных клеток-киллеров крыс (M+m; n=8-10)

Серии опытов	Время после интоксикации, сут
	1	3	6	9
Контроль	32,7+ 3,0
ТМТ	18,0 +2,1*	21,1+2,1*	24,0+ 2,6*	29,7+ 2,9
ДХЭ	11,3 +2,0?	16,1+2,2*	20,5+ 2,4*	28,5+ 2,7
ДХЭ+ ТМТ	7,8+1,4?	13,5+2,0?	17,5+2,5*	25,9+2,6

Примечание: * - различие с контролем достоверно - р0,05; ? - различие достоверно по сравнению с контролем и действием травмы - р0,05

сочетание снижают активность естественных клеток-киллеров через 1, 3 и 6 сут после воздействия. Так, через 1 сут ДХЭ, ТМТ и их сочетание уменьшали показатель соответственно в 2,89; 1,82 и 4,19 раза (р0,05). К 9 сут сохранялась тенденция к снижению параметра при сочетанном действии факторов.

Эффект ДХЭ был более выраженным по сравнению с действием ТМТ при оценке активности ЕКК через 1 сут. При сочетании острого отравления ДХЭ и ТМТ отмечалась суммация иммуносупрессивных эффектов данных факторов.

3. Действие острой интоксикации 1,2-дихлорэтаном, механической травмы и их сочетания на гуморальные иммунные реакции

Нами в опытах на белых крысах показано, что под влиянием действия ДХЭ, ТМТ и их сочетания в индуктивной и продуктивной фазах иммунного ответа статистически значимо снижался отрицательный двоичный логарифм титра антител (ОДЛТА) к ЭБ через 5 и 8 сут после иммунизации. Супрессия иммунной реакции после травматического воздействия проявляется в меньшей степени, чем постинтоксикационная, а редукция, обусловленная сочетанным действием факторов была более выражена (p<0,05), чем супрессирующий эффект изолированного действия ДХЭ и ТМТ.

Проведенные нами экспериментальные исследования свидетельствуют (табл. 4), что при иммунизации крыс одновременно с действием ДХЭ, ТМТ и их сочетания (индуктивный период антителогенеза) число антителообразующих клеток (АОК) уменьшалось соответственно в 1,67; 1,32 и 3,74 раза (p<0,05). При действии ДХЭ, травматического повреждения и их сочетания в продуктивной фазе иммуногенеза формирование АОК в селезенке крыс снижалось соответственно в 2,17; 1,63 и 4,78 раза (p<0,05). Исследуемый показатель при действии ДХЭ снижался в большей степени, чем при действии ТМТ.

Полученные нами результаты исследований свидетельствуют о более выраженной редукции антителопродукции под влиянием ДХЭ по сравнению с действием травмы, суммации эффектов факторов, а также о снижении под влиянием травмы, ДХЭ и их сочетания функции Th1-лимфоцитов, индуцирующих синтез IgM [Ройт А. и соавт., 2000; Pfeifer C. et al., 1991] плазмоцитами селезенки, в большей степени в продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивной.

Таблица 4

Влияние ДХЭ (0,7 LD₅₀) в сочетании с тяжелой механической травмой на число антителообразующих клеток к эритроцитам барана (·10³), синтезирующим IgM, в селезенке белых крыс через 5 сут (M+m; n=8-10)

Серии опытов	Время интоксикации по отношению к иммунизации, сут
	0	3
Контроль	32,5+2,6
ДХЭ	19,5+2,4*	15,0+2,2*
ТМТ	24,6+2,5*	19,9+2,0*
ДХЭ+ ТМТ	8,7+1,3*?	6,8+1,5*?

Примечание: * - различие с контролем достоверно - р0,05; ? - различие с контролем и действием ДХЭ и ТМТ достоверно - р0,05

Нами установлено, что ДХЭ (0,7 ЛД₅₀), ТМТ и их сочетание снижали гуморальный иммунный ответ, оцениваемый по числу АОК к ЭБ, синтезирующим IgG соответственно в 1,43; 1,80 и 2,49 раза (p<0,05). Сочетанное действие факторов приводило к суммации их эффектов.

Нами показано, что после действия ДХЭ, травмы и их сочетанного эффекта через 1 сут функция В-лимфоцитов в кооперации с Т-клетками снижалась соответственно в 1,36; 1,62 и 2,15 раза (р<0,05), а функция Т-клеток - в 1,85; 2,15 и 3,00 (р<0,05) раза соответственно. Острое отравление ДХЭ, воздействие травмы и сочетание факторов в большей степени снижают функцию Т-лимфоцитов (р<0,05). При этом ДХЭ по сравнению с травмой оказывает больший поражающий эффект в отношении Т- и В-лимфоцитов.

Опыты in vitro показали, что ДХЭ нарушает кооперацию Т- и В-лимфоцитов преимущественно вследствие иммунотоксического эффекта продуктов его биотрансформации. Под влиянием ДХЭ и его метаболитов в большей степени поражаются Т-клетки.

При оценке содержания числа АОК к Vi-Ag в селезенке у крыс выявлено, что при их иммунизации антигеном одновременно с действием ДХЭ, ТМТ и их сочетания происходит уменьшение их количества соответственно в 1,56; 1,37 и 2,52 раза (p<0,05). При острой интоксикации ДХЭ, тяжелом травматическом повреждении и их сочетании в продуктивной фазе иммуногенеза количество АОК к Vi-Ag в селезенке крыс уменьшалось соответственно в 2,11; 1,82 и 3,21 раза (p<0,05).

Супрессия Т-независимой гуморальной иммунной реакции после отравления и после действия ТМТ проявлялась в равной степени. Снижение Т-независимого гуморального иммунного ответа после действия химического и физического факторов проявлялось в существенно меньшей степени, чем его редукция, обусловленная сочетанным эффектом ДХЭ и ТМТ.

4. Оценка функции коры надпочечников, активности эстераз в иммуноцитах и перекисного окисления липидов при остром отравлении 1,2-дихлорэтаном в сочетании с механической травмой

Нами установлено, что острое отравление ДХЭ, действие ТМТ существенно увеличивали концентрацию кортикостерона (КС) в плазме крови через 1 ч в 5,37 и 6,30 раза соответственно, а через 3 ч - соответственно в 3,87 и 3,00 раза. Через 12 и 24 ч содержание кортикостерона в плазме крови крыс существенно не отличалось от исходного уровня. Сочетанное действие ДХЭ и ТМТ приводило к увеличению содержания в крови КС через 1 и 3 ч соответственно в 9,56 и 5,47 раза соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии ДХЭ и ТМТ происходит суммация их эффектов.

При вычислении коэффициентов корреляции между концентрацией кортикостерона в крови (через 1 ч) и АОК к ЭБ при остром отравлении крыс ДХЭ и действии травмы установлено, что они составляли соответственно -0,710 (p<0,05) и -0,721 (p<0,05). Коэффициенты корреляции при остром отравлении ДХЭ, ТМТ и их сочетания между концентрацией кортикостерона в крови (через 1 ч) и реакцией ГЗТ составляли соответственно -0,732 (p<0,05); -0,742 (p<0,05) и -0,774 (p<0,05).

Введение КС в данных концентрациях приблизительно соответствовало содержанию КС в плазме крови после действия ДХЭ в дозе 0,7 ЛД₅₀ и ТМТ.

Под влиянием экзогенного КС в дозах, обеспечивающих концентрацию кортикостерона, соизмеримую с содержанием этого гормона в крови при острой интоксикации ДХЭ и действии ТМТ, отмечалась супрессия гуморальных и клеточных иммунных реакций. Эта редукция была выражена в меньшей степени, чем при действии ДХЭ, ТМТ и их сочетания.

Проведенные нами эксперименты показали (табл. 5), что под влиянием ДХЭ и его сочетанного эффекта с травмой активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т- лимфоцитах тимуса у крыс через 3 сут существенно снижается в 1,70 и 1,79 раза соответственно, а в Т-клетках селезенки - в 1,68 и 1,47 раза соответственно. Тяжелая механическая травма на активность АХЭ Т-лимфоцитов влияния не оказывает.

Изучение эстераз в селезенке по относительному содержанию эстеразопозитивных клеток в органе (преимущественно Т-клеток [Хейхоу Ф. Г. Дж., Кваглино Д., 1983; Ройт А. и соавт., 2000]) показало, что острое действие ДХЭ вызывало статистически значимое уменьшение активности б-нафтил-АS-ацетатэстеразы в 1,45 раза (р0,05), а б-нафтилбутиратэстеразы - в 1,42 раза (р0,05). Активность б-нафтил-АS-ацетатэстеразы при действии ДХЭ и его сочетания с ТМТ снижалась соответственно в 1,45 и 1,51 раза, а активность б-нафтилбутиратэстеразы спленоцитов - в 1,42 и 1,57 раза соответсвенно. Действие травмы на активность б-нафтил-АS-ацетатэстеразы и б-нафтилбутиратэстеразы Т-лимфоцитов влияния не оказывало.

Таблица 5

Действие острого отравления ДХЭ (0,7 LD₅₀) в сочетании с тяжелой механической травмой на активность ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах тимуса и селезенки у крыс (мЕд/10⁹) через 3 сут (M+m; n=8-10)

Серии опытов	Тимус	Селезенка
Контроль	72,1+7,0	59,5+6,1
ДХЭ	42,4+4,4*	35,3+ 4,2*
ТМТ	61,2+6,2	48,7+5,8
ДХЭ+ТМТ	40,2+4,4*	40,6+4,0*

Примечание: * - различие с контролем и действием травмы достоверно - р0,05

Таким образом, при сочетанном действии ДХЭ и ТМТ вторичное постинтоксикционное иммунодефицитное состояние связано с ингибированием эстераз Т-клеток и обусловлено только действием ДХЭ.

Исследования влияния ДХЭ, ТМТ и их сочетания на ПОЛ показали (табл. 6) уменьшение под влиянием токсиканта активности каталазы и пероксидазы, характеризующей АОС, соответственно в 1,70 и 1,57 раза (p<0,05).

Основной продукт ПОЛ малоновый диальдегид (МДА) при остром отравлении ДХЭ повышался в 1,36 (p<0,05). Изменения показателей ПОЛ в крови отражают процесс свободнорадикального окисления липидов, как всех клеток организма, так и органов системы иммунитета и, в частности, лимфоцитов [Забродский П.Ф., 2002]. Активация ПОЛ под влиянием ДХЭ и ТМТ может являться одним из механизмов, приводящим к формированию комбинированного постинтоксикационного и посттравматического иммунодефицитного состояния.

Таблица 6

Влияние действия ДХЭ (0,7 ЛД₅₀) в сочетании с тяжелой механической травмой на показатели перекисного окисления липидов у крыс через 3 сут (М+m, n = 9-13)

Серии опытов	Каталаза, ммоль/мин/л	Пероксидаза, мкмоль/мин/л	Малоновый диальдегид, нмоль/мл
Контроль	1	230,5+23,1	30,3+3,2	6,22+0,53
ТМТ	2	152,4+20,2	21,2+2,7	7,98+0,56
ДХЭ	3	135,2+25,0	19,3+1,9	8,45+0,55
ДХЭ + ТМТ	4	87,9+17,4	12,0+1,4	10,01+0,60
Достоверность различий-р0,05	1-2; 1-3; 1-4; 2-4: 3-4	1-2; 1-3; 1-4; 2-4: 3-4	1-2; 1-3; 1-4; 2-4: 3-4

После воздействия ТМТ на крыс показатели антиоксидантной системы (АОС) и связанными с ними ПОЛ через 3 сут существенно изменялись: снижалась активность каталазы и пероксидазы и увеличивалось содержание МДА в крови в 1,28 раза (p<0,05).

Острое действие ДХЭ в сочетании с ТМТ вызывало суммацию прооксидантных эффектов химического и физического факторов. Так, сочетанное действие ДХЭ и ТМТ приводило к снижению активности каталазы и пероксидазы в 2,62 и 2,52 раза (p<0,05) соответственно. При этом сочетание ДХЭ и ТМТ увеличивало содержание МДА в крови в 1,61 раза (p<0,05).

При вычислении коэффициентов корреляции (r) между числом АОК к ЭБ, реакцией ГЗТ при остром отравлении ДХЭ и содержанием каталазы в крови установлено, что они составляли соответственно 0,722 (p<0,05) и 0,753 (p<0,05). Коэффициенты корреляции при действии ТМТ между АОК к ЭБ, реакцией ГЗТ и содержанием пероксидазы в крови крыс составляли соответственно 0,710 (p<0,05) и 0,720 (p<0,05). Коэффициенты корреляции между содержанием МДА в крови и показателями иммунного статуса при действии ДХЭ, ТМТ и их комбинации составляли от -0,708 до -0,770. Значения r между параметрами были статистически значимы.

5. Коррекция нарушений регуляции иммунного гомеостаза при сочетанном действии 1,2-дихлорэтана и механической травмы на показатели системы иммунитета

Данные литературы [Маркова И.В. и соавт., 1998; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000] и результаты наших исследований свидетельствуют о том, что иммуносупрессирующий, гепатотоксический и прооксидантный эффекты сочетанного действия ДХЭ и ТМТ предполагают использование из применяемых в настоящее время в клинической практике иммуностимуляторов полиоксидоний

Для изучения иммуностимулирующего эффекта полиоксидония применялась доза ДХЭ, превышающая среднелетальную дозу на фоне использования его антидота ацетилцистеина [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000].

Проведенные нами исследования показали, что применение ацетилцистеина после сочетанного действия ДХЭ в дозе 1,5 ЛД₅₀ и ТМТ лишь незначительно повышало гуморальные, клеточные иммунные реакции и снижало ПОЛ. При этом ДХЭ в дозе 0,7 ЛД₅₀ в сочетании с ТМТ, как было показано ранее, вызывал существенный прооксидантный эффект.

При действии ацетилцистеина после сочетанного действия ДХЭ и ТМТ отмечалось снижение Т-зависимого, Т-независимого антителообразования (число АОК к ЭБ и к Vi-Ag cоответственно), АЗКЦ, активности ЕКК (ЕЦ), реакции ГЗТ, соответственно в 1,78; 1,50; 1,58; 1,44; и 1,32 раза (p<0,05). После применения ацетилцистеина в комбинации с полиоксидонием данные показатели были несущественно ниже контрольных значений в 1,17; 1,14; 1,23; 1,13; и 1,17 раза (p>0,05), что свидетельствует о практически полном восстановлении исследованных показателей.

После использования ацетилцистеина при сочетанном эффекте ДХЭ и ТМТ отмечалось снижение активности каталазы и пероксидазы и увеличение содержания в крови малонового диальдегида (МДА) соответственно в 1,30; 1,31 и 1,23 раза (p>0,05). После применения ацетилцистеина в комбинации с полиоксидонием отмечались незначительная редукция активности каталазы и пероксидазы и повышение содержания в крови МДА соответственно в 1,17; 1,15; 1,12 раза (p>0,05), свидетельствующая о практически полном восстановлении исследованных параметров.

Данные проведенных нами исследований доказывают, что при отравлении ДХЭ в сочетании с ТМТ полиоксидоний активирует все звенья иммунного ответа, а также обладает способностью восстанавливать функцию ЕКК.

Таким образом, практически полное восстановление нарушения иммунного гомеостаза после сочетанного действия ДХЭ (1,5 ЛД₅₀) и ТМТ достигается комбинированным применением антидота 1,2-дихлорэтана ацетилцистеина и полиоксидония.

Выводы

1. Нарушение механизмов регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении 1,2-дихлорэтаном (0,7 ЛД₅₀) в сочетании с тяжелой механической травмой в условиях эксперимента на животных характеризуется снижением содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета, показателей клеточного звена иммунитета, Т-зависимого и Т-независимого антителобразования, кооперации Т- и В-лимфоцитов. Эффекты 1,2-дихлорэтана превышают иммуносупрессию, обусловленную тяжелой механической травмой. Выявлена суммация иммунодепрессивных эффектов химического и физического факторов.

2. Под влиянием 1,2-дихлорэтана (0,7 ЛД₅₀) и тяжелой механической травмы, а также их сочетанного эффекта существенно снижаются лимфоидные индексы тимуса и селезенки, уменьшается содержание Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета и циркулирующей крови. Отмечается более выраженный по сравнению с травмой эффект 1,2-дихлорэтана. Выявлено аддитивное действие 1,2-дихлорэтана и тяжелой механической травмы на данные параметры.

3. Острое отравление 1,2-дихлорэтаном (0,7 ЛД₅₀), действие тяжелой механической травмы, а также их сочетанный эффект существенно снижают функцию Т-лимфоцитов, формирование гиперчувствительности замедленного типа в первичном и вторичном клеточном иммунном ответе, активность естественных клеток-киллеров, антителозависимую клеточную цитотоксичность. Сочетанное действие факторов приводило к суммации их эффектов.

4. Действия 1,2-дихлорэтана (0,7 ЛД₅₀), тяжелой механической травмы и их сочетания приводят к снижению тимусзависимого и тимуснезависимого антителообразования, более выраженному в продуктивной фазе антителогенеза. При этом в большей степени поражаются Th1-лимфоциты, с функцией которых связан синтез IgM, по сравнению с Th2-клетками, влияющими на продукцию В-лимфоцитами IgG, а эффекты химического и физического факторов суммируются. ДХЭ нарушает кооперацию Т- и В-лимфоцитов преимущественно вследствие иммунотоксического эффекта продуктов его биотрансформации. Под влиянием ДХЭ и его метаболитов в большей степени поражаются Т-клетки. Иммуносупрессивный эффект 1,2-дихлорэтана превышает действие тяжелой механической травмы. Установлено аддитивное действие 1,2-дихлорэтана и тяжелой механической травмы на исследованные параметры.

5. Редукция иммунных реакций при остром отравлении 1,2-дихлорэтаном, действии тяжелой механической травмы и их сочетанном эффекте связана с реализацией неспецифических механизмов: значительным увеличением концентрации кортикостерона в плазме крови, инициацией перекисного окисления липидов. Специфические механизмы супрессии Т-зависимого антителообразования, клеточных иммунных реакций при сочетанном эффекте 1,2-дихлорэтана и тяжелой механической травмы определяются ингибированием токсикантом эстераз Т-лимфоцитов. Установлена отрицательная корреляция активности энзимов с показателями системы иммунитета.

6. Коррекция выявленных нарушений иммунного гомеостаза при сочетанном действии 1,2-дихлорэтаном и тяжелой механической травмы достигается комбинированным применением антидота 1,2-дихлорэтана ацетилцистеина и иммуномодулятора полиоксидония.

Практические рекомендации

1. В экспериментах на животных наиболее информативными показателями для оценки иммуносупрессивных эффектов сочетанного воздействия острого отравления ДХЭ и тяжелой механической травмы являются: содержание лимфоцитов в тимусе и селезенке, активность естественных клеток-киллеров, тимусзависимый гуморальный иммунный ответ в продуктивной фазе антителогенеза, функция Т-клеток в реакции гиперчувствительности замедленного типа.

2. После сочетанного действия ДХЭ и тяжелой механической травмы возникает супрессия специфической иммунной защиты, требующая применения медикаментозных средств для ее устранения с целью профилактики и лечения возможных инфекционных осложнений и заболеваний.

3. После сочетанного действия ДХЭ и тяжелой механической травмы для восстановления основных гуморальных и клеточных иммунных реакций целесообразно применение ацетилцистеина в комбинации с полиоксидонием.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

* - публикации в печатных изданиях перечня ВАК РФ

1. Иванов, Д.Ю. Сравнительная оценка влияния антидотов дихлорэтана на изменение его иммунотоксичности / Д.Ю. Иванов, П.Ф. 3абродский, В.Г. Германчук // Новые информационные технологии как средство интенсификации образовательного процесса в вузах. Ч.II: Межвуз. сб. науч. статей - Саратов: Саратовский военный институт ВВ МВД России, 2005. С. 151-152.

2. Иванов, Д.Ю. Взаимосвязь ингибирования ацетилхолинэстеразы Т-клеток дихлорэтаном и тетрахлорметаном с показателями их иммунотоксичности / Д.Ю. Иванов, П.Ф. Забродский, Н.Д. Киселев // Актуальные вопросы военной медицины и военно-медицинского образования: Сб. науч. работ. Саратов: Саратовский военно-медицинский институт, 2005. С. 103-105.

3. Иванов, Д.Ю. // Модуляция диэтиксимом клеточного иммунного ответа при острой интоксикации дихлорэтаном / Д.Ю. Иванов, П.Ф. Забродский, В.Г. Германчук // Доклады Академии военных наук, 2006. № 1(19). С. 71-74.

4. Иванов, Д.Ю. Влияние полиоксидония на показатели системы иммунитета и перекисного окисления липидов после острых отравлений хлорированными углеводородами / Д.Ю. Иванов, П.Ф. Забродский, В.Г. Германчук // Доклады Академии военных наук, 2006. № 1(19). С. 82-85.

5. *Иванов, Д.Ю. Сочетанное действие дихлорэтана и тяжелой механической травмы на показатели системы иммунитета / Д.Ю. Иванов, В.Г. Германчук, П.Ф. Забродский // Вестник новых медицинских технологий - 2006. Т.XIII. № 4. С. 99-100.

6. Иванов, Д.Ю. Оценка роли кортикостерона в реализации иммуносупрессивных эффектов при сочетанном действии дихлорэтана и тяжелой механической травмы / Д.Ю. Иванов, В.Ф. Киричук, П.Ф. Забродский // Саратовский научно-медицинский журнал. Саратов, 2007. № 1. С. 51-54.

7. Иванов, Д.Ю. Антихолинэстеразный механизм как фактор иммунотоксичности хлорированных углеводородов / Д.Ю., Иванов, В.Ф. Киричук, П.Ф. Забродский // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Сер. «Медицинские науки». 2007. № 1. С. 3-7.

8. *Иванов, Д.Ю. Сочетанное действие хлорированных углеводородов в условиях высокой температуры воздуха на систему иммунитета и перекисное окисление липидов / Д.Ю. Иванов, П.Ф. Забродский, В.Г. Германчук // Токсикологический вестник. 2007. № 1. С. 14-17.

9. *Иванов, Д.Ю. / Нарушения иммунного гомеостаза и антиоксидантной системы при сочетанном действии 1,2-дихлорэтана и тяжелой механической травмы и их коррекция ацетилцистеином и полиоксидонием / Д.Ю. Иванов., В.Ф Киричук., П.Ф. Забродский // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2007. Т. 70ю. № 2. С. 56-58.

10. Иванов, Д.Ю. Инициация перекисного окисления липидов под влиянием хлорированных углеводородов в сочетании с тяжелой механической травмой / Д.Ю. Иванов, П.Ф. Забродский, М.С. Громов // Сб. науч. тр. Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты. Саратов: СВИРХБЗ, 2007. выпуск 8. С. 65-67.