Актуальность проблемы. Несмотря на очевидную ценность метилирования ДНК как диагностического маркера, накопленных на сегодняшний день данных об особенностях метилирования участков генома человека в норме и при патологии недостаточно для формирования эффективных систем эпигенетических маркеров опухолевого процесса (Shin S.H. et al, 2010; Hong S.J. et al, 2010; Wang W. et al, 2010; Suijkerbuijk K.P.M. et al 2011). Предполагается, что прогресс в разработке новых высокотехнологичных методов скрининга дифференциального метилирования ДНК позволит переломить эту ситуацию (Bock C., 2009).

Подходы к скринингу дифференциального метилирования ДНК можно принципиально разделить на две группы. Первая группа подразумевает предварительный отбор локусов для исследования, осуществляемый на основании некоторой гипотезы, предсказывающей наиболее вероятное выявление дифференциального метилирования именно этих локусов. Задача методов, осуществляющих подходы этой группы, - проверка исходной гипотезы о наличии дифференциального метилирования заранее отобранных последовательностей ДНК (Nemtsova M.V. et al., 2005; Wojdacz T., 2009; Ushijima T., 2005). Вторая группа подразумевает непредвзятый скрининг дифференциального метилирования. При помощи соответствующих методов в ходе скрининга сначала выявляется дифференциальное метилирование заранее неизвестных локусов генома, а затем проводится идентификация их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг эффективно выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают ни под одну из современных гипотез и не включаются в анализ методами первой группы, что не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard C. et al., 2006).

До недавнего времени возможности применения методов непредвзятого скрининга были в значительной степени ограничены сложностью геномной идентификации выявляемых дифференциально метилированных участков ДНК. Предложенный Е.Б.Кузнецовой с соавторами в 2007 г. протокол прямого секвенирования дифференциально метилированных фрагментов ДНК облегчает процесс геномного картирования за счет исключения этапа клонирования фрагментов, однако все еще требует их физического извлечения из полиакриламидных гелей. Секвенирование генома человека в сочетании с математическим моделированием раскрыло ранее недоступный способ картирования дифференциально метилированных локусов, выявляемых методами непредвзятого скрининга. Были предприняты попытки разработки виртуального изображения результатов одного из методов скрининга дифференциального метилирования - рестрикционно-ориентированного геномного сканирования - для идентификации фрагментов ДНК с использованием симулирующего программного обеспечения (Rouillard J. et al., 2001, Koike K. et al., 2008). Разработанные системы не получили распространения, вероятно, вследствие сложности самого метода скрининга. Очевидно, разработка подходов к анализу дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга является актуальной задачей, что определило цель настоящей работы.

Цель работы. Разработать подходы к анализу дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга.

Задачи исследования.

1. Сформировать современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Разработать способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК, исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования.

3. Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей.

4. Охарактеризовать иерархию и описать количественные и качественные параметры продуктов амплификации интерметилированных сайтов, получаемых при различных экпериментальных условиях.

5. Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга дифференциального метилирования.

Научная новизна.

В результате настоящего исследования разработан принципиально новый современный алгоритм скрининга дифференциального метилированния геномов, основанный на сочетании классического генноинженерного подхода - амплификации интерметилированных сайтов (АИМС), высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярном электрофорезе, и оригинального компьютерного обеспечения. Разработанная в рамках исследования программа AIMS in silico является первым компьютерным симулятором адаптор-опосредованной ПЦР, применимым к полному геному человека. Впервые охарактеризованы количественные и качественные параметры продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях; критически переоценены закономерности редукции результирующей картины при увеличении длин универсальных праймеров АИМС в зависимости от нуклеотидного состава удлинителей. Впервые предложено рестриктазное картирование дифференциально метилированных фрагментов ДНК на основе математического моделирования.

Проведенный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1, HBL-100, HS 578 T, BT-474, MCF7 и T-47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

Теоретическая и практическая значимость.

Программа компьютерной симуляции результатов АИМС - AIMS in silico - позволяет в кратчайшие сроки провести научно обоснованное моделирование эксперимента с заранее заданными параметрами и определить оптимальный дизайн реальных экспериментов, исходя из задач исследования и приборной базы. Модуль программы AIMS in silico, обеспечивающий моделирование рестриктазного геномного картирования продуктов АИМС, позволяет быстро и эффективно проводить дизайн рестриктазного картирования. Разработанный способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК исключает необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования.

Охарактеризованная иерархия продуктов АИМС служит удобным руководством к предварительной оценке степени снижения сложности результирующей картины при увеличении длин универсальных праймеров АИМС в зависимости от нуклеотидного состава удлинителей. Программа просмотра и анализа электрофореграмм PeakPick обеспечивает удобную среду для осуществления дифференциального анализа репрезентаций эпигеномов и, кроме того, является одной из немногих общедоступных программ анализа результатов капиллярного электрофореза в целом. Разработанные алгоритмы, программы и методы оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новой медицинской ДНК-технологии, прошедших государственную регистрацию.

Выявленные при анализе геномов клеточных линий рака молочной железы ZR751, HBL100, HS 578 T, BT474, MCF7 и T47D дифференциально метилированные геномные локусы могут служить субстратом для разработки молекулярно-генетических маркеров РМЖ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенный алгоритм скрининга дифференциального метилированния геномов, объединяющий классические генноинженерные подходы, высокоразрешающий способ разделения фрагментов нуклеиновых кислот и оригинальное компьютерное обеспечение, представляет собой эффективную, завершенную систему, успешно прошедшую практическую апробацию.

2. Классический способ геномной идентификации дифференциально метилированных участков ДНК, выявляемых методом АИМС, может быть заменен рестриктазным картированием, проводимым на основе предварительного компьютерного моделирования.

3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.

4. Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование реальных экспериментов АИМС.

5. Непредвзятый характер скрининга дифференциального метилирования методом АИМС подтвержден выявлением в образцах клеточных линий РМЖ дифференциального метилирования неканонической локализации.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2008 и 2009 гг., V и VI Международных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в 2008 и 2009 гг., VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., 6-м симпозиуме “Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний” (г. Москва) в 2009 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 (диплом и премия), Всемирном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике солидных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г. Неймеген, 2010), III Международной Студенческой Научно-практической Конференции РУДН (г. Москва) в 2011 г., VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва) в 2011 г.

Разработанные в рамках исследования алгоритмы и компьютерные программы были использованы при выполнении НИР по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation “ Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers”.

Личный вклад автора.

Автором лично сформирован обобщенный алгоритм геномного скрининга дифференциального метилирования ДНК на основе поэтапного анализа существующих подходов к скринингу. Проведена оптимизация метода скрининга на основе критического анализа обобщенной схемы и алгоритма амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Разработаны алгоритм и компьютерная программа моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей. Охарактеризована иерархия продуктов АИМС и описаны количественные и качественные параметры репрезентаций АИМС. Разработана компьютерная программа визуализации данных экспериментов и дифференциации геномных профилей. Разработаны алгоритм и компьютерная программа геномной идентификации выявляемых дифференциально метилированных участков ДНК. Проведен анализ дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы, включающий: экстракцию геномной ДНК, амплификацию интерметилированных сайтов и сравнение геномных профилей, планирование и осуществление рестриктазного картирования дифференциально метилированных локусов, бисульфитную конверсию геномной ДНК, дизайн праймеров для метилспецифической ПЦР и проведение метилспецифической ПЦР, метилспецифическое секвенирование и построение детальных карт метилирования изучаемых участков генома, метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов. Все этапы анализа дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы выполнены лично.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 27 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 2 главы в учебниках, 17 тезисов, зарегистрирована 1 новая медицинская ДНК-технологии, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 59 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 100 ссылок, и 2 приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

дифференциальный метилирование геном скрининг

Материал для исследования.

Клеточные линии рака молочной железы ZR751, HBL100, HS 578 T, BT474, MCF7 и T47D, послужившие материалом для дифференциального метилирования ДНК, предоставлены Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Институт биологии гена» Российской академии наук.

Экстракция и анализ геномной ДНК.

Экстракцию ДНК клеточных линий проводили стандартным методом (Sambrook J. et al., 1989). Рестрикцию ДНК, лигирование с адаптерами, полимеразную цепную реакцию и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook J. et al., 1989). Использовали рестриктазы SmaI, XmaI (Сибэнзим, Россия), ДНК лигазу T4 (Fermentas, Литва), ДНК-полимеразу Taq (Сибэнзим, Россия).

Валидацию статуса метилирования изучаемых локусов проводили метилспецифическим секвенированием (Hajkova P., 2002) и метилспецифическим анализом конформации однонитевых фрагментов (Bianco T., 1999). Реакцию автоматического прямого секвенирования проводили на приборе ABI Prism 3100, с использованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) по протоколам производителя.

Разработка алгоритмов и программного обеспечения непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов.

При разработке программ использованы методы модульного, объектно-ориентированного и динамического программирования, цифровой обработки сигналов, численной оптимизации, разработки пользовательских интерфейсов, а также реляционная методология организации хранилища данных.

Использован портал организации совместной работы http://www.assembla.com, в состав которого интегрированы репозиторий с системой управления версиями, система управления задачами, пополняемая участниками проекта база знаний.

Целевой платформой разработки выбрана программная платформа .NET Framework для Microsoft Windows, позволяющая вести разработку с использованием различных специализированных языков программирования.

Программы написаны на языках программирования C# и С++.

Для хранения данных продуктов обработки исходной последовательности генома эндонуклеазой рестрикции используется реляционная система управления базами данных Microsoft SQL Server. Возможность задания индексов по предварительно вычисленным фланкирующим последовательностям фрагментов позволяет значительно ускорить выборку данных. Реляционная методология организации хранилища данных характеризуется простотой структуры данных, удобным табличным представлением и возможностью использования формального аппарата алгебры отношений и реляционного исчисления для обработки данных.

Программное обеспечение планирования и анализа результатов экспериментов.

Рис. 1. Схема метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Сплошная линия изображает участок геномной ДНК, содержащий семь сайтов узнавания изошизомеров рестриктаз SmaI и XmaI - CCCGGG. Неметилированные сайты обозначены синим цветом, метилированные - красным, адапторы и праймеры - зеленым. Радиоавтографы полиакриламидных гелей (ПААГ) иллюстрируют фингерпринты, полученные с использованием праймеров, удлиненных на 1-3 нуклеотида (Frigola J. et al., 2002).

В качестве инструмента для дизайна эксперимента по амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) путем предварительного компьютерного моделирования ожидаемых результатов использована собственная программа компьютерной симуляции AIMS in silico.

В модифицированном методе АИМС (схема оригинального метода представлена на рис. 1) разделение флуоресцентно меченых продуктов проводили капиллярным электрофорезом на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США). Результаты фрагментного анализа ДНК обрабатывали с использованием программы GeneMapper 2.0 (Applied Biosystems, США) и собственного программного обеспечения PeakPick. Геномную идентификацию дифференциально метилированных участков ДНК, выявляемых методом АИМС, проводили методом рестриктазного картирования на основе моделей, сформированных программой AIMS in silico.

В качестве материала для компьютерного моделирования эпигеномных экспериментов использовали последовательность генома человека hg19, GRCh37 Genome Reference Consortium http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/ grc/ в файлах формата FASTA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/fasta.shtml).

Данные электрофореграмм получены из выходных файлов автоматического генетического анализатора ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США) формата ABIF (http://www.appliedbiosystems.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилированния геномов

Идеологическую и методологическую основу проведенного исследования составил специально разработанный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов. Алгоритм состоит из трех основных блоков: 1) генноинженерный метод формирования репрезентаций эпигеномов; 2) метод высокоразрешающего разделения отдельных элементов репрезентации (исследуемых фрагментов ДНК); 3) методы компьютерного моделирования результатов экспериментов, планирования in silico, анализа результатов исследований in vitro.

В качестве основного подхода к формированию репрезентаций эпигеномов был принят метод, в наибольшей степени удовлетворяющий сформулированным требованиям - непредвзятому характеру скрининга, возможности стандартизации процедуры эксперимента, простоте и экономичности протоколов, возможности быстрой и технически несложной идентификации геномной принадлежности дифференциально метилированных участков ДНК, и возможности тестирования большого количества (десятков) образцов в одном эксперименте. Из опубликованных к настоящему времени методов таким требованиям в наибольшей степени удовлетворяет АИМС - амплификация интерметилированных сайтов (Frigola J. et al., 2002).

Серьезным недостатком метода АИМС является техническая сложность геномной идентификации идентификации продуктов реакции. Это относится как к методу визуализации (радиоавтография низкопроцентного денатурирующего полиакриламидного геля большого размера с последующим совмещением изображения с реальным гелем), так и к методу определения геномной принадлежности интересующих фрагментов (клонирование амплификатов, содержащихся в элюатах интересующих областей, с последующим секвенированием множества клонов). В идеале метод, генерирующий такое значительное количество целевых фрагментов ДНК, как АИМС (в чем его несомненный плюс) должен быть реализован на платформе, обеспечивающей разрешение фрагментов ДНК по длине с точностью до одного нуклеотида. Такая платформа представлена на сегодняшний день капиллярным электрофорезом в формате фрагментного анализа. Примененный способ дискриминации продуктов АИМС, синтезированных с флуоресцентно меченых праймеров, с помощью многоканального капиллярного электрофореза значительно повышает разрешающую способность метода и избавляет от необходимости использования радиоактивно меченых материалов.

Высокая разрешающая способность капиллярного электрофореза в сочетании с компьютерным обеспечением анализа результатов позволяют с высокой точностью определять длины выявляемых дифференциально метилированных фрагментов генома. Такая информация может использоваться для идентификации геномной локализации интересующих фрагментов in silico, что исключает этапы физической изоляции их из геля, клонирования и секвенирования, снижая, тем самым, временные затраты, трудоёмкость и ресурсоёмкость исследования.

Рис. 2. Блок-схема алгоритма непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов.

В целом, сочетание преимуществ АИМС, капиллярного электрофореза и компьютерного анализа позволяют разработать оригинальный современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов (рис. 2).

2. Алгоритм и компьютерная программа моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей

В классическом варианте реализация АИМС приводит к формированию сложных фингерпринтов, количественный и качественный состав которых практически невозможно предугадать. С точки зрения идеологии непредвзятости скрининга метилирования такая ситуация оптимальна. В то же время получение четких информативных наборов продуктов АИМС возможно далеко не при любых условиях экспериментов.

Технология АИМС исключительно консервативна. На этапе лигирования фланкирующие участки всех продуктов рестрикции образцов геномной ДНК унифицируются с точки зрения последующей ПЦР, проводимой с универсальных праймеров. Нуклеотидный состав праймеров на 90-100% определяется составом адаптеров. Жесткие условия ПЦР, дающие высокую специфичность реакции и отсутствие неспецифичных продуктов, обеспечивают высокий уровень стандартизации метода и повторяемости результатов. Во всем протоколе АИМС существуют только два относительно гибких сегмента. Это выбор изошизомеров рестриктаз, используемых при подготовке репрезентаций геномов, и вариации 3'-концов праймеров, которые могут различаться по длине на 1-4 нуклеотидов. Эти вариабельные участки праймеров («удлинители») могут различаться не только по длине, но и по нуклеотидному составу. Таким образом, дизайн эксперимента включает в себя лишь выбор рестриктаз, протяженности и нуклеотидного состава удлинителей. От этих факторов зависит количество возможных результирующих фрагментов АИМС и их геномная принадлежность. Тем не менее, разнообразие картин АИМС, возникающее при разных сочетаниях указанных переменных параметров, исключительно велико.

Адекватный дизайн экспериментов АИМС можно обеспечить путем предварительного математического моделирования ожидаемых результатов. Такая возможность обеспечивается разработанной программой компьютерной симуляции AIMS in silico. Алгоритм работы программы включает моделирование полного набора фрагментов ДНК, получаемых при обработке исследуемого генома рестриктазой, выбранной для формирования геномной библиотеки (традиционно для АИМС это рестриктаза XmaI). Полученный набор фрагментов представляет собой полную репрезентацию АИМС, служащую основой для моделирования возможных исходов АИМС in vitro при различных условиях. Полученная полная репрезентация виртуально подвергается лигированию с предложенным пользователем адаптером и ПЦР с универсальными праймерами, содержащими заданные удлинители на 3'-конце. Получаемые полные наборы возможных продуктов АИМС для заданных условий можно характеризовать с количественной и качественной точек зрения, причем в последнем случае реальное клонирование и секвенирование отдельных фрагментов ДНК заменяется сравнением с уже существующими геномными базами данных. Таким образом, алгоритм моделирования результатов экспериментов воспроизводит лабораторный протокол АИМС.

Интерактивный интерфейс разработанной на основе этого алгоритма программы AIMS in silico позволяет осуществлять ввод файлов, содержащих нуклеотидные последовательности, предназначенные для анализа, и выбор пользователем исходных условий эксперимента. К вводимым условиям эксперимента относятся: сайт узнавания рестриктазы, используемой для скрининга дифференциального метилирования, нуклеотидный состав короткой и длинной частей адаптера, нуклеотидный состав специфического удлинителя универсального праймера. Предусмотрена возможность ограничения длин результирующих фрагментов АИМС, в зависимости от способа их физического разделения. Выходные данные: общее количество продуктов ПЦР, которые могут быть получены при проведении АИМС с заданными условиями, их распределение по длинам, нуклеотидные последовательности каждого из ПЦР-продуктов. В графическом виде информация представляется как виртуальная хроматограмма капиллярного электрофореза, построенная в виде суперпозиции пиков Гаусса, соответствующих индивидуальным продуктам АИМС. Выбор отдельного пика при помощи курсора вызывает информацию о нем в специальном окне (рис. 3).

При составлении программы использованы преимущества технологии баз данных. Собственно анализ целевых последовательностей начинается с создания пользователем базы данных, содержащей информацию о каждом участке изучаемого генома, возникающем после обработки геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции: длину продукта рестрикции и его нуклеотидный состав. После того, как такая база данных создана и сохранена, возможность быстрого обращения к ее содержимому обеспечивает высокую скорость симуляции результатов АИМС для различных удлинителей универсального праймера.

Рис. 3. Пример окна программы AIMS in silico с выходными данными

3. количественная и качественная характеристика продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях

Характеристика распределения сайтов узнавания эндонуклеазы рестрикции XmaI в геноме человека.

В классическом варианте АИМС используется эндонуклеаза рестрикции XmaI с сайтом узнавания C^CCGGG. Программа AIMS in silico позволила оценить количественный и качественный состав продуктов гидролиза геномной ДНК человека этой рестриктазой. Общее число продуктов гидролиза составило 374146. Распределение последовательности CCCGGG по геному оказалось в целом случайным. Характер распределения сайтов узнавания XmaI одинаков на всех хромосомах. Митохондриальный геном последовательностей CCCGGG не содержит. Случайное пространственное распределение сайтов CCCGGG отличает рестриктазу XmaI от часто используемой в эпигенетических исследованиях HpaII, сайты узнавания которой преимущественно концентрируются в областях CpG-островков. Случайное распределение сайтов CCCGGG дало основание предположить, что использование XmaI в экспериментах АИМС позволит проводить дифференциальный анализ метилирования самых разнообразных, с точки зрения структуры и функции, геномных элементов. Это предположение полностью подтверждается более детальным анализом продуктов рестрикции XmaI.

Характер распределения XmaI-фрагментов, ограниченных порогом длин эффективного разделения капиллярным электрофорезом, показан на рис. 4, А. Общее число продуктов АИМС длиной до 600 нуклеотидов составило 73102.

Рис. 4. Виртуальные электорофореграммы АИМС, полученные с помощью программы AIMS in silico: А - характер распределения продуктов АИМС без удлинителей, отражающий распределение в геноме XmaI-фрагментов длиной до 600 н.п. Б, В - виртуальные электорофореграммы АИМС с удлинителями CG и CCG, соответственно.

Качественный анализ полученной репрезентации генома показал, что она обогащена повторяющимися последовательностями с длинами коровых единиц от 100 до 1000 нуклеотидов, принадлежащими самым разнообразным классам рассеянных и тандемных повторов: Alu, LTR, прителомерным повторам, неклассифицированным повторам низкой сложности и др. Некоторые близкородственные, или, по крайней мере, в значительной степени гомологичные высококопийные повторяющиеся последовательности образовали выраженные кластеры продуктов АИМС (несколько высоких, до 1500 копий, пиков на хроматограмме, в области длин до 80 нуклеотидов, рис. 4, А). Присутствуют в разных соотношениях и другие классы геномных последовательностей (уникальные межгенные и интронные участки, CpG-островки и т.д.).

Количественная иерархия продуктов АИМС генома человека

Для ограничения сложности картин АИМС с целью облегчения анализа электрофореграмм при проведении ПЦР используются праймеры, удлиненные на несколько нуклеотидов. Обычно выбор удлинителей праймеров проводится случайным образом и утверждается либо отвергается по результатам экспериментов.

Авторы метода АИМС изначально постулировали, что при прочих равных условиях добавление каждого дополнительного нуклеотида к универсальным праймерам предполагает снижение сложности результирующей картины (т.е. снижение количества продуктов АИМС) примерно в 5 раз для C,G и в 3 раза для A,T. Такое предположение сделано, исходя из представленности нуклеотидов в геноме человека.

Случайный выбор удлинителей с использованием такой приблизительной эмпирической формулы для оценки сложности репрезентаций геномов снижает ценность АИМС как универсального метода скрининга, необходимой характеристикой которого должен стать высокий уровень стандартизации. Кроме того, использование различных наборов нуклеотидов в качестве удлинителей должно сдвигать спектральный состав результирующих репрезентаций либо в А,Т-богатые области, либо в области CpG-островков, и это влияние должно, несомненно, учитываться не только при анализе результатов, но и на самом первом этапе исследования - в процессе определения дизайна эксперимента.

Для предоставления исследователям возможности обоснованного выбора удлинителей с помощью программы AIMS in silico сформировано графическое представление количественной иерархии продуктов АИМС генома человека (рис. 5). Приведенная гистограмма ясно показывает, что для подавляющего числа семейств удлинителей достаточно трех нуклеотидов, чтобы снизить сложность картины АИМС таким образом, чтобы продукты ПЦР можно было четко дифференцировать после разделения в полиакриламидном геле. Речь идет о количестве продуктов, не превышающем второго порядка в пределах длин до одной тысячи нуклеотидов.

Предоставляемая программой симуляции АИМС in silico возможность построения иерархического дерева конечных продуктов в зависимости от длин и нуклеотидного состава удлинителей не только позволяет уточнить функцию снижения сложности для каждого конкретного случая, но и демонстрирует удивительные результаты. Так, характер первого же нуклеотида в удлинителе практически не влияет на сложность картины: присоединение нуклеотида А, Т, С или G приводит к ограничению количества продуктов соответственно до 8.5, 5.5, 7 и 7 тысяч. При этом разница результатов присоединения А и Т значительно более выражена, чем разница между А/Т и C/G. Чрезвычайно выраженные различия наблюдаются на уровне удлинителей из двух нуклеотидов. Так, в семействе удлинителей с первым нуклеотидом Т значения результирующих количеств продуктов АИМС для ТА, ТС, ТG и ТТ составляют 20, 152, 191 и 2547 соответственно, т.е. разница в степени сложности репрезентаций составляет целых два порядка.

Рис. 5. Иерархическая диаграмма продуктов АИМС до 1 т.п.н., предсказанных для классических условий эксперимента. Синим цветом обозначено общее количество первичных фрагментов (при отсутствии удлинителей) - около 100 тыс. Красным цветом указаны количества продуктов, получаемых при использовании однонуклеотидных удлинителей, желтым - двухнуклеотидных, зеленым - трехнуклеотидных. Диапазон предсказанных количеств фрагментов составляет от 1 до 100000, поэтому ось абсцисс представлена логарифмической шкалой.

Снижение сложности до состояния практически полной неинформативности для некоторых удлинителей наступает уже на уровне трех нуклеотидов. В частности, АИМС in silico с одним из удлинителей ААТ, ТАТ, ТСА и GТА приводит к возникновению лишь одного продукта реакции. В то же время, использование некоторых других тринуклеотидных удлинителей приводит к едва заметному снижению сложности исходной картины: например, для АGG количество фрагментов составляет 2829, для ТТС - 2161. Экспериментальное определение этих параметров потребовало бы невероятных затрат труда, времени и материалов, а неопределение наверняка привело бы к ложной интерпретации опытных данных.

Важным качественным параметром, определяющим дизайн АИМС, является характер распределения продуктов ПЦР по длинам в анализируемой области. Распределение должно быть в целом равномерным, длины отдельных фрагментов в идеале должны различаться не менее чем на два нуклеотида. В этом случае будет обеспечиваться четкая идентификация пиков на хроматограмме капиллярного электрофореза и однозначность результатов анализа.

Не менее важным фактором, влияющим на выбор удлинителей для проведения АИМС, является их полная гомология с теми или иными структурно-функциональными элементами генома, определяющая конечный качественный состав анализируемых фрагментов ДНК.

Качественный состав продуктов АИМС генома человека и дизайн экспериментов АИМС при помощи программы AIMS in silico

Нуклеотидные последовательности продуктов АИМС, предоставляемые программой AIMS in silico, позволяют однозначно локализовать анализируемые фрагменты и, пользуясь доступными базами данных, определить принадлежность каждого из них к тому или иному классу геномных последовательностей. Используя эту возможность, можно целиком осуществить обоснованный дизайн эксперимента АИМС в зависимости от целей исследования и доступной приборной базы, ни разу не прибегая к планировочным экспериментам. Ниже приводится конкретный пример, демонстрирующий возможности дизайна экспериментов АИМС in silico.

Поставим задачу определения условий АИМС для изучения характера метилирования не менее 100 CpG-островков в образцах условно нормальной и опухолевой тканей молочной железы. Планирование такого эксперимента будет включать следующие этапы. Прежде всего, предложим рабочую гипотезу, ограничивавшую качественный состав потенциальных удлинителей. Гипотеза заключается в простом и очевидном предположении, что для обогащения фракции продуктов АИМС фрагментами классических CpG-островков необходимо использовать удлинители, содержащие по крайней мере один динуклеотид CG. Среди двухнуклеотидных такой удлинитель, очевидно, лишь один - CG, и результаты компьютерной симуляции АИМС (рис. 4, Б) показывают, что его использование в эксперименте нецелесообразно: в пределах длин до 600 нуклеотидов он создает 308 фрагментов, причем их распределение не соответствует сформулированным выше требованиям.

Среди тринуклеотидных удлинителей последовательностей, содержащих CG, восемь: ACG, CCG, CGA, CGC, CGT, CGG, GCG, и TCG. Количество продуктов АИМС длиной до 600 нуклеотидов для каждого из них - соответственно 10, 71, 3, 73, 3, 43, 65, и 21. Ни один из этих удлинителей не дает возможности анализа 100 фрагментов АИМС, поэтому выберем из них три, обещающих достаточно высокую информативность - CCG, CGC и GCG. Рассмотрение результатов виртуального электрофореза для удлинителя CGC (рис. 6, Б) показывает, что его высокая информативность, предполагаемая исходя из количества продуктов АИМС, обманчива. Из 73 фрагментов 60 группируются в области до 250 нуклеотидов; формируются 8 кластеров фрагментов одной длины, относящихся к 2-10 геномным локусам. Кластер фрагментов с длинами 222 н.п. включает в себя 5 продуктов АИМС, представляющих участки сателлитных повторов и не имеющих отношения к CpG-островкам. Одиннадцать фрагментов с общей длиной 44 н.п. и три фрагмента с общей длиной 46 н.п. представлены высокогомологичными участками непромоторных CpG-островков. Что же касается предсказанных продуктов АИМС, получаемых при использовании удлинителей CCG и GCG, то их распределение более равномерно, расстояние между большинством пиков превышает два нуклеотида, обе репрезентации содержат лишь по одному кластеру из трех продуктов АИМС (рис. 6, А и В). По этим признакам удлинители CCG и GCG в большей степени соответствуют оптимальным параметрам репрезентации, чем CGC.

На следующем этапе необходимо определить качественный состав продуктов АИМС, получение которых возможно с выбранными удлинителями CCG и GCG. Используя нуклеотидные последовательности продуктов АИМС, с помощью программы BLAT определяем их геномную локализацию и принадлежность к классу CpG-островков.

Рассмотрим результаты этого этапа более подробно на примере удлинителя CCG. Пример соответствующей виртуальной хроматограммы представлен на рис. 6, А. Состав предсказанной репрезентации генома отражен на рис. 7. Анализ показывает, что абсолютное большинство результирующих продуктов АИМС при удлинителе CCG принадлежит классическим протяженным CpG-островкам с высоким содержанием CpG-динуклеотидов: от 25 до 400, в среднем 125.

Аналогичные результаты дает количественный и качественный анализ продуктов АИМС при удлинителе GCG. Таким образом, совместный анализ образца биологического материала с использованием удлинителей CCG и GCG позволяет определять состояние метилирования 136 геномных участков, 122 из которых представлены CpG-островками. Дизайн эксперимента АИМС с заранее заданными параметрами завершен.

Рис. 6. Виртуальные электорофореграммы АИМС с удлинителями CCG(А) и CGC(Б) и GCG(В).

Рис. 7. Состав геномной репрезентации, предсказанной для АИМС с удлинителем CСG. А - фракции CpG-островков и других последовательностей; Б - отношение CpG-островков к кодирующим последовательностям.

4. Алгоритм и компьютерная программа геномной идентификации выявляемых дифференциально метилированных участков ДНК

Особенности первичной нуклеотидной последовательности продуктов АИМС не позволяют проводить их точную идентификацию по молекулярной массе в соответствии с распределением, предсказанным in silico. Исключительно обогащенные G,C-нуклеотидами фрагменты ДНК мигрируют в среде разделения со скоростями, отличными от таковых, характерных для фрагментов с усредненным нуклеотидным составом. Кроме того, использование денатурирующей среды для проведения капиллярного электрофореза зачастую вызывает различия электрофоретической подвижности G,C-обогащенных комплементарных фрагментов ДНК, приводя к двоению соответствующих сигналов на электрофореграмме.

Традиционный дизайн АИМС предполагает клонирование и секвенирование интересующих фрагментов ДНК для определения их геномной принадлежности. Пользуясь тем, что определение нуклеотидной последовательности генома человека уже практически полностью завершено и, соответственно, последовательности возможных продуктов АИМС также известны, этапы клонирования и секвенирования заменены последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro.

Для осуществления рестриктазного картирования in silico был введен дополнительный модуль в программу AIMS in silico. Моделирование рестриктазного картирования проводится на основе полной репрезентации АИМС, предсказанной для конкретных условий эксперимента, с использованием рестриктаз, выбираемых из заранее сформированного списка. Сигналы виртуальной электрофореграммы, соответствующие «гидролизованным» продуктам АИМС при выборе конкретной рестриктазы, определяются по изменению цвета.

Виртуальная электрофореграмма результатов рестриктазного картирования продуктов АИМС интерактивна; предусмотрена возможность копирования полной нуклеотидной последовательности выбранного продукта АИМС при помощи курсора (рис. 8).

Рис. 8. Пример определения последовательности продукта АИМС в рамках виртуального рестриктазного картирования в программе AIMS in silico.

Разработан алгоритм интеграции рестриктазного картирования in silico и in vitro. Картирование реально получаемых продуктов АИМС проводится, как и в случае компьютерного моделирования, на основе полной репрезентации АИМС, получаемой для конкретных условий эксперимента. Для создания полной репрезентации in vitro из лабораторного протокола АИМС исключается этап гидролиза ДНК метилчувствительной рестриктазой SmaI. Таким образом моделируется состояние полного метилирования изучаемого генома.

5. Анализ дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы

При сравнении электрофореграмм продуктов АИМС геномов клеточных линий с удлинителем CCG выявлены дифференциально метилированные локусы в диапазонах длин 150-167, 167-176 и 176-190 п.н. (рис. 9).

Рис. 9. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС с удлинителем CCG клеточных линий РМЖ.

Моделирование с помощью программы AIMS in silico предсказывает получение в эксперименте АИМС с удлинителем CCG в указанном диапазоне трех групп продуктов: 1)ccg164, ccg165, ccg168; 2) ccg176, ccg177.1, ccg177.2, и 3) ccg189. Краткая характеристика геномной принадлежности локусов продуктов приведена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика геномной принадлежности локусов.

* расстояние до TSS (transcription start site - сайт инициации транскрипции)

Виртуальная электрофореграмма продуктов представлена на рис. 10. С помощью программы AIMS in silico получен план рестриктазного картирования (табл. 2)

Рис. 10. Результаты моделирования продуктов АИМС с удлинителем CCG в диапазоне длин 160-190 п.н.

Таблица 2. План рестриктазного картирования

Гидролиз продуктов АИМС эндонуклеазами рестрикции и сравнение электрофореграмм позволили однозначно определить положение пиков продуктов на электрофореграммах (рис. 11).

Рис. 11. Пример позиционирования пиков продуктов на электрофореграмме продуктов АИМС клеточной линии MCF7 до (черным) и после гидролиза BssHII (красным). Зеленой стрелкой обозначен пик продукта, соответствующий ccg177.2, синей стрелкой - продукт гидролиза.

С использованием метода метилспецифического секвенирования (рис. 12) построены карты метилирования (рис. 13) выявленных локусов дифференциального метилирования.

Рис. 12. Пример электрофореграммы метилспецифического секвенирования локуса ccg177.2 в клеточной линии MCF7. Стрелками указаны сайты узнавания рестриктазы SmaI в полностью метилированном состоянии (после бисульфитной обработки - TTCGGG).

Рис. 13. Карты метилирования локуса генома человека, содержащего фрагмент АИМС ccg177.2. Белыми кружками показаны неметилированные CpG-динуклеотиды, черными - метилированные, серыми - частично метилированные, желтыми - CpG-динуклеотиды, состояние метилирования которых определить не удалось.

Сравнение результатов, полученных методами АИМС и метилчувствительного секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования сайтов SmaI по всем исследуемым локусам во всех образцах, кроме локуса ccg164 (PURB) в линии HBL и локусов ccg168 и ccg177.1 в линии T47D, для которых метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования. Возможно, наблюдаемые расхождения объясняются более высокой чувствительностью метода АИМС по сравнению с секвенированием по Сэнгеру.

Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС клеточной линии HBL100 (рис. 14) показало, что уровень сигнала продукта АИМС, соответствующего локусу ccg168, примерно вдвое ниже, чем на электрофореграмме полной репрезентации, что согласуется с данными карты метилирования по локусу ccg168 для клеточной линии HBL100 - один сайт SmaI полностью метилирован, второй в полуметилированном состоянии (рис. 15). Уровень сигнала продукта АИМС, соответствующего локусу ccg164, значительно ниже, чем на электрофореграмме полной репрезентации, что позволяет предположить наличие в образце минорной субпопуляции геномов (мозаичность), в которых соответствующие CpG-динуклеотиды находятся в метилированном состоянии.

Рис. 14. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации (черным) и продуктов АИМС (красным) клеточной линии HBL-100.

Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС клеточной линии T47D (рис. 16) показывает, что уровень сигналов продуктов АИМС, соответствующих локусам ccg168 и ccg177.1 значительно ниже, чем на электрофореграмме полной репрезентации, что может быть объяснено тем же явлением.

Рис. 15. Карты метилирования локуса генома человека, содержащего фрагмент АИМС ccg168 (ANK3). Здесь и далее белыми кружками показаны неметилированные CpG-динуклеотиды, черными - метилированные, серыми - в полуметилированном состоянии, желтым - CpG-динуклеотиды, состояние метилирования которых определить не удалось.

Рис. 16. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации (черным) и продуктов АИМС (красным) клеточной линии T47D.

Метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов АИМС ccg168 показал в образце клеточной линии HBL100 наличие метилированных молекул, обладающих измененной электрофоретической подвижностью относительно неметилированной ДНК (рис. 17). Для образца клеточной линии T47D показано наличие только фракций молекул с измененной электрофоретической подвижностью, в то время как результаты метилспецифического секвенирования (рис. 15) не показывают наличия метилирования ни по одному CpG-динуклеотиду, что может быть объяснено высокой гетерогенностью клеточной линии по статусу метилирования в связи с повреждением механизма поддержания метилирования в этой клеточной линии (Ting A.H. et al., 2006).

Рис. 17. Метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов по локусу АИМС ccg168. 1, 3, 4, 5, 7 - образцы неметилированной ДНК. 2 - образец ДНК клеточной линии HBL100. 6 - образец ДНК клеточной линии T47D. Стрелками указаны сигналы, соответствующие неметилированным молекулам.

Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR751, HBL100, HS 578 T, BT474, MCF7 и T47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования: участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

ВЫВОДЫ

1. Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза - с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов амплификации интерметилированных сайтов в процессе определения их геномной принадлежности.

3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов амплификации интерметилированных сайтов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.

4. Проведенная характеристика иерархии продуктов амплификации интерметилированных сайтов и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов.

5. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1, HBL-100, HS 578 T, BT-474, MCF7 и T-47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.