Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРИЧИН АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ЭРИТРОЦИТОЗА В ЧУВАШИИ

Вассерман Наталья Наумовна

03.00.15 «Генетика»

МОСКВА, 2007

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.В. Поляков

доктор медицинских наук Р.Ф. Гарькавцева

кандидат медицинских наук В.О. Бобрынина

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «____»____________ 2007 г. в __ часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при ГУ МГНЦ РАМН

по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН

Автореферат разослан «____»_____________ 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило

Актуальность темы. Картирование, идентификация и исследование генов, ответственных за возникновение наследственных заболеваний, являются одним из важных источников знаний о функционировании организма человека. Знание гена и его локализации, кроме того, делает возможным прямую и косвенную ДНК-диагностику болезни. Становится возможным проведение дифференциальной диагностики сходных клинических заболеваний, а также предсказание развития определенной патологии до появления клинических признаков, в том числе у плода, т.е. проведение дородовой диагностики. Также можно разработать адекватную терапию на основе знания этиологии заболевания, в том числе генотерапию. До настоящего времени нет ясного представления о регуляции процессов кроветворения, в частности, эритропоэза. Исследование генов, приводящих к наследственным эритроцитозам, может помочь понять ключевые этапы этого процесса.

Эритроцитозы характеризуются увеличенным количеством эритроцитов в единице объема крови. В литературе описано несколько клинически отличающихся форм эритроцитоза. Среди них выделяют ненаследственные формы и семейно-наследственные эритроцитозы, которые являются редкими заболеваниями. Они представляют собой гетерогенную по патогенезу группу заболеваний с различным типом наследования. Известны следующие причины семейно-наследственных эритроцитозов: нарушение функциональных свойств гемоглобина, метаболизма эритроцитов, автономное повышение продукции эритропоэтина. В ряде случаев патогенез семейно-наследственых эритроцитозов остается невыясненным.

Мутация, приводящая к развитию эритроцитоза у чувашей, выявлена в гене VHL, который является геном-супрессором опухолевого роста. При мутациях в нем у больных с синдромом VHL развиваются опухоли. Однако, ни у больных эритроцитозом (гомозиготных носителей мутации), ни у их родственников - гетерозиготных носителей опухоли не обнаружены. Возможно, у них присутствует изменение в другом гене, являющимся модификатором, которое не позволяет развиться опухолям. Идентификация этого гена может помочь в понимании процесса опухолеобразования, а также в разработке генотерапии ряда опухолей.

Цель исследования

Изучение молекулярно-генетической природы аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии, картирование и исследование области локализации гена, ответственного за развитие заболевания.

Задачи исследования

1. Провести картирование локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза на выборке семей с больными из Чувашии.

2. Определить популяционную частоту мутации Arg200Trp в гене VHL, расположенном в локусе 3р25, среди чувашей и близких им народностей.

3. Разработать эффективную систему регистрации указанной мутации, пригодную для проведения популяционного скрининга.

4. Установить причину и время распространения мутации Arg200Trp в гене VHL среди чувашей.

5. Провести анализ независимости сегрегации картированных локусов в семьях с аутосомно-рецессивным эритроцитозом.

Научная новизна

Определены популяционные частоты мутации Arg200Trp в гене VHL, приводящей к развитию аутосомно-рецессивного эритроцитоза, среди чувашей и народов Волго-Уральского региона. Определен возраст этой мутации у чувашей. Установлена популяционная частота носительства мутации среди народов Волго-Уральского региона: чувашей, марийцев, удмуртов и башкир.

Показано сцепление локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза с хромосомой 11q23. Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов 3р25, несущего ген VHL, и 11q23 в семьях со случаями заболевания. В районе 11q23, вероятно, наличие модифицирующего фактора, ответственного за разное течение заболевания и отсутствие опухолей у носителей мутации.

Практическая значимость

В отягощенных семьях из Чувашии возможно проведение уточняющей, пресимптоматической диагностики, а также выявление гетерозиготного носительства в семьях чувашей, марийцев и удмуртов и на популяционном уровне. Разработана система быстрого скрининга носительства мутации Arg200Trp в гене VHL среди большого количества человек на основе real-time PCR. Результаты популяционных исследований распространенности мутации при эритроцитозе, возможно, внесут дополнения в понимание процесса этногенеза народов Волго-Уральского региона.

Положения, выносимые на защиту

1. Существует генетическое сцепление аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии с хромосомными локусами 11q23 и 3р25.

2. Популяционная частота мутации Arg200Trp в гене VHL в чувашской популяции составляет 1.84%, у марийцев - 0.87%, у удмуртов - 0.47%. Среди башкир и русских мутация Arg200Trp не выявлена.

3. Разработана система простой и быстрой идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL на основе real-time PCR.

4. Время распространения мутации Arg200Trp в чувашской популяции составляет 1250±733 лет.

5. Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов 3р25 и 11q23 в семьях со случаями аутосомно-рецессивного эритроцитоза, что может указывать на наличие гена-модификатора в области 11q23.

Апробация работы

По материалам исследования опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 1 главу в монографии. Материалы диссертации доложены на 29, 30, 32, 37 съездах Европейского общества генетики человека (Генуя, 1997; Лиссабон, 1998; Амстердам, 2000; Прага, 2005); конференции “Геном человека - 99”; съезде HGM (Шанхай, 2002); на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005) и на Всероссийской научно-практической конференции “Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы” (Москва, 2006).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы (143 источника, из них 9 отечественных и 134 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Для выделения геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови использовали готовый набор реактивов DIAtom™ DNA Prep100 (Isogene Lab.ltd., Россия) по протоколу производителя.

Для исследования использовали 27 микросателлитных маркеров для геномного скрининга, 29 полиморфных маркеров на хромосоме 11q23 для исследования картированного локуса аутосомно-рецессивного эритроцитоза, 11 микросателлитных маркеров, фланкирующих ген VHL на хромосоме 3р25.

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы “ДНК-технология” (Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq (“БиоМастер”).

Исследование микросателлитных и SNPs маркеров проводилось методами ПДАФ- и ПДРФ-анализа, соответственно. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-свете. В работе использовались эндонуклеазы производства Fermentas (Литва).

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности генов FXY D2, FXY D6 и VHL использовались метод SSCP-анализа (Orita et al., 1989) со щелочной денатурацией амплифицированных фрагментов ДНК с последующим разделением в неденатурирующем полиакриламидном геле, окраской 0.5*Sibr® Gold nucleic acid gel stain (Invitrogene™Molecular Probes™, США) и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-свете, а также автоматическое секвенирование по протоколу производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США). В качестве матрицы для прямого сиквенса использовали фрагменты, полученные после проведения ПЦР. Анализ результатов секвенирования проводился с помощью программ Chromas и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Прямую идентификацию мутации Arg200Trp в гене VHL проводили с помощью разработанных тест-систем: методом ПДРФ-анализа и методом Real-time PCR (для популяционных исследований гетерозиготного носительства среди башкир) на термоциклере с Real-time PCR детектирующей системой iCycler ThermalCycler фирмы BIO-RAD. Пробы типа TaqMan и праймеры синтезировались в НПО SYNTOL.

Оценку сцепления локуса заболевания с полиморфными ДНК-маркерами проводили на основании статистического анализа сегрегации заболевания в семье с аллелями маркеров, используя метод максимального правдоподобия (Ott, 1991).

Двухлокусный анализ сцепления осуществлялся с помощью программы MLINK, входящей в пакет программ “LINKAGE”, версия 5.1 (Rockfeller University, URL=http:/linckage.rockfeller.edu). Значение частоты рекомбинации , которому соответствовало максимальное значение LOD-балла, вычислялось с помощью программы MLINK. За область исключения принималась область, прилежащая к ДНК-маркеру, внутри которой значения LOD-балла было меньше или равно -2.

Для статистического сравнения частот аллелей полиморфных маркеров, расположенных на хромосомах, несущих мутацию, и на хромосомах без мутации, использовали стандартный критерий 2 для двупольной таблицы, а также точный критерий Фишера для случаев, когда критерий 2 не применим при малом числе наблюдений.

Для оценки степени неравновесия по сцеплению использовали предложенный Bengtsson and Thomson в 1981 году параметр = (PD-PN)/(1-PN), где PD и PN - частоты аллеля на хромосомах, несущих мутацию, и на нормальных хромосомах, соответственно, с доверительным интервалом по Diaz et al (2000).

Для определения возраста мутации Arg200Trp в гене VHL использовался подход, основанный на понятии «генетических часов» (Labuda et al, 1997) и оценивающий количество поколений g с момента появления мутации в популяции до настоящего времени, исходя из изменения неравновесия по сцеплению полиморфных маркеров с локусом заболевания за этот период времени Risch et al (1995).

Результаты и обсуждение

В 2002 году Ang с соавторами была идентифицирована мутация Arg200Trp в гене VHL у чувашских больных с АРЭ. Однако при исследовании чувашских семей с больными АРЭ нами было обнаружено сцепление локуса АРЭ с двумя локусами: 11q23 и 3р25.

Нами был проведен аналог полногеномного скрининга с использованием полиморфных микросателлитных маркеров, имеющихся в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН. Было проанализировано 25 полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных на хромосомах: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, а также маркер в интроне 12 гена COL1A2 на хромосоме 7q21.3 для исключения сцепления с геном-кандидатом Еро и повтор на 5'-конце гена-кандидата EPOR на хромосоме 19р13.2. Исследование сцепления с указанными полиморфными маркерами позволило исключить область генома с генетическим размером 277 сМ (8.4% генома).

При проведении анализа сцепления положительные LOD-баллы были получены для двух маркеров. LOD=2.47 получен с маркером D11S1294 на хромосоме 11 для десяти семей.

Было проведено исследование дополнительных полиморфных маркеров: D11S4175, находящегося на расстоянии 18 млн.п.н. от D11S1294 в сторону центромеры, и D11S1356 - на расстоянии 9.52 млн.п.н. в сторону теломеры. По обоим маркерам были получены положительные Lod-баллы, равные 1.20 и 3.38 для D11S4175 и D11S1356, соответственно. Это указывает на сцепление гена, ответственного за развитие АРЭ, с интервалом D11S1294-D11S1356. Дальнейший анализ сцепления с маркерами из данного интервала позволил локализовать ген эритроцитоза в районе 11q23. Максимальный LOD=4.23 при иmax=0.05 был получен для маркера АР757/98 (табл. 1).

Таблица 1. Значения LOD-баллов для полиморфных маркеров на хромосоме 11

Также получен LOD=11.5 при и=0 для маркера D3S1597 из локуса 3р25. При использовании маркера D3S1263, находящегося на расстоянии 6.18 сМ от маркера D3S1597, LOD=12.4.

В 2002 году Ang с соавторами была выявлена замена С598Т в гомозиготном состоянии, ведущая к изменению аминокислоты Arg200Trp в экзоне 3 гена VHL, находящегося в локусе 3р25, у всех исследованных больных АРЭ. Нами было проведено исследование ДНК 34 больных и 39 их здоровых родственников из 14 больших семей на наличие мутации Arg200Trp в гене VHL. Все больные, для которых был поставлен клинический диагноз эритроцитоз, оказались гомозиготными носителями мутации Arg200Trp в гене VHL, за исключением отца из семьи № 6. Показатели красной крови у него находятся на верхней границе нормы, однако фенотипические характеристики подходят под описание больных эритроцитозом. При анализе его ДНК мутация Arg200Trp была выявлена в гетерозиготном состоянии.

Кроме больных из 14 больших семей у нас были изолированные пациенты, для которых диагноз полицитемии стоял под вопросом. Из 8 таких больных мутация Arg200Trp была выявлена в гомозиготном состоянии у 4 человек, т.о. диагноз для них был подтвержден. Для четырех человек, для которых мутация Arg200Trp не была найдена, а также для отца из семьи № 6 был проведен поиск мутаций во всей кодирующей области гена VHL и экзон-интронных соединениях. Ни для кого из исследованных людей изменения нуклеотидной последовательности обнаружены не были.

Молекулярно-генетические методы идентификации мутации Arg200Trp

Для идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL нами была разработана система ПДРФ-анализа для прямого выявления мутации (рис. 1). Для идентификации мутации фрагмент экзона 3 амплифицировался с праймеров 3F и 3R1, в последний была введена замена для создания сайта узнавания рестриктазы Hin6I. Эта система была использована при исследовании носительства мутации в семьях с больными АРЭ, а также при проведении популяционных исследований среди чувашей, марийцев, удмуртов и русских. Однако данный метод удобен при проведении анализа небольшого количества образцов. Для одновременного анализа большого количества образцов был разработан быстрый способ выявления мутации, основанный на методе real-time PCR.

Рисунок 1. ПДРФ-анализ мутации Arg200Trp. m/m: мутация в гомозиготном состоянии у больных АРЭ, m/N: гетерозиготный носитель мутации,

N/N: норма.

Данная система позволяет одновременно выявлять два фрагмента: содержащий мутацию Arg200Trp в гене VHL и экзон 6 гена ТВР в качестве референсного фрагмента. Разработанная диплексная система состоит из двух пар специфичных праймеров и двух флуоресцентно меченых зондов типа TaqMan. Для фрагмента с мутацией обратный праймер специфичен по отношению к мутации (рис. 2).

Рисунок 2. Система real-time PCR для выявления мутации Arg200Trp в гене VHL.

Система используется как качественный тест на наличие мутации и позволяет выявлять людей, имеющих в генотипе хотя бы один мутантный аллель (рис. 3). С помощью данной системы было проведено исследование частоты гетерозиготного носительства мутации Arg200Trp в популяции башкир Республики Башкортостан.

Рисунок 3. Результаты анализа мутации Arg200Trp с помощью real-time PCR: представлена зависимость интенсивности флуоресценции от количества циклов ПЦР фрагмента с мутацией Arg200Trp (слева) и фрагмента референсного гена (справа).

Популяционные исследования мутации Arg200Trp

Для определения частоты распространения мутации Arg200Trp в гене VHL нами были исследованы образцы ДНК 572 здоровых чувашей. Среди них выявлен 21 гетерозиготный носитель мутации, приводящей к АРЭ, а также одна гомозиготная бессимптомная носительница данной мутации. Исходя из полученных данных, аллельная частота мутации Arg200Trp составила 1.84% (95% ДИ 1.23ч2.63), а расчетная частота заболевания - 1:3 000 человек.

Также нами было проанализировано наличие мутации Arg200Trp в гене VHL в соседних с чувашами популяциях Волго-Уральского региона и у русских. Среди 344 обследованных марийцев выявлено 6 гетерозиготных носителей мутации: аллельная частота 0.87% (95% ДИ 0.38ч1.71), расчетная частота заболевания - 1:13 150 человек. Из 317 удмуртов гетерозиготными носителями являются 3 человека: аллельная частота 0.47% (95% ДИ 0.13ч1.23), расчетная частота заболевания - 1:44 600 человек. Среди 271 башкира, а также среди 271 русского не было выявлено носителей мутации Arg200Trp.

Неравновесие по сцеплению полиморфных маркеров, фланкирующих ген VHL, и АРЭ

Для выявления неравновесия по сцеплению АРЭ с полиморфными маркерами в локусе 3р25 в чувашских семьях нами было проведено исследование 10 микросателлитных маркеров в районе гена VHL. Кроме того, был проведен анализ некоторых полиморфных маркеров в популяционной выборке, которою составили хромосомы 72 здоровых чувашей, не являющихся родственниками больных АРЭ и не несущих мутацию Arg200Trp в гене VHL. В число хромосом без мутации также вошли хромосомы родителей больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом, которые не были им переданы. Неравновесие выявлено для 9 из исследованных маркеров. Для маркера D3S3611, находящегося на расстоянии 0.38 сМ, выявлено два аллеля 2 и 7, для которых обнаружено неравновесие по сцеплению, т.е., вероятно, произошла ранняя рекомбинация или мутация в предковом гаплотипе.

В таблице 2 представлены аллельные частоты исследованных маркеров.

Для всех аллелей исследованных микросателлитных маркеров были определены значения параметра неравновесия по сцеплению с 95% ДИ. Для сравнения частот аллелей полиморфных маркеров, расположенных на хромосомах, несущих мутацию, и на хромосомах без мутации, был использован критерий 2 или точный критерий Фишера (табл. 3). Как видно из таблицы, параметр д наибольший для маркеров, расположенных проксимально и дистально от гена VHL, и уменьшается для аллелей маркеров, удаленных от гена. Это характерно для мутаций, распространившихся в результате эффекта основателя. Исходя из значений 2 и параметра неравновесия по сцеплению д, гаплотип основателя представляется состоящим из аллелей 4-4-3-Т-7-5-4-4-3-5-2 (для полиморфных маркеров D3S1537-D3S3691-D3S1597-мутация-D3S3611-D3S3594-D3S3601-D3S3589-D3S1263-D3S1259-D3S3610). Этот гаплотип выявлен в 5 хромосомах, несущих мутацию Arg200Trp в гене VHL, среди хромосом без мутации данный гаплотип не встретился.

Таблица 2. Аллельные частоты полиморфных маркеров из области гена VHL. N-количество исследованных хромосом, подчеркнуты значения частот аллелей, характеризующихся наибольшим неравновесием по сцеплению

Полные гаплотипы хромосом больных АРЭ, несущих мутацию Arg200Trp в гене VHL, представлены в таблице 4.

Таблица 3. Неравновесие по сцеплению аллелей микросателлитных маркеров с локусом АРЭ

звездочкой отмечены значения р для одностороннего варианта точного критерия Фишера

Таблица 4. Гаплотипы хромосом с мутацией Arg200Trp в гене VHL.

Жирным шрифтом выделена сохранная область гаплотипа основателя. сМ-генетические координаты по карте Marshfield, т.п.н.-физические координаты на хромосоме

Возраст мутации. При расчете возраста мутации Arg200Trp в гене VHL в чувашской популяции использовали значения параметра неравновесия по сцеплению для полиморфных маркеров, представленных в таблице 3. Для расчета поправки g0 для растущей популяции необходимо знать скорость d роста популяции. Эта скорость была вычислена Близнец (2007) при оценке возраста мутации с.807+5G>A в гене TCIRG1, приводящей к развитию злокачественного аутосомно-рецессивного остеопетроза в чувашской популяции. Скорость роста чувашской популяции составила d = 0.2272 [ln(чел.)/поколение]. Полученные значения числа поколений представлены в таблице 5. При расчете числа поколений для маркера D3S3611 мы объединили аллели №№ 2 и 7 и при анализе считали их за один аллель. Маркер D3S1537 мы не включили в расчет числа поколений, т.к. полученные данные при сравнении частот аллеля №4 в выборке хромосом с мутацией и нормальных хромосом не являются достоверными (р=0.244).

Таблица 5. Число поколений, прошедших с момента распространения мутации Arg200Trp в чувашской популяции

Среднее значение числа поколений, прошедших после начала распространения мутации Arg200Trp в чувашской популяции после прохождения популяции через «бутылочное горлышко», составило 45.65 со стандартным отклонением 26.77 поколений. В качестве средней продолжительности одного поколения у чувашей брали значение, характерное для сельского населения республики в настоящее время, равное 27.4 годам (Гинтер, Зинченко, 2006). Учитывая продолжительность одного поколения, время, за которое произошло распространение мутации Arg200Trp, составляет около 1250±733 лет. Исходя из того, что средний год рождения больных АРЭ - 1972, период начала распространения мутации соответствует первой половине VIII века (722 год ± 733 лет).

В это время на территории современной Чувашии жили предки марийцев. При популяционных исследованиях мутация Arg200Trp была найдена и у них. Кроме того, при обследовании марийской семьи с больным АРЭ нами показано наличие гаплотипа общего с гаплотипами чувашских больных. Т.о., показано общее происхождение мутации в этих популяциях. Возможно, что мутация появилась среди древних марийцев, а потом распространилась и среди чувашей.

Анализ рекомбинаций в локусе 11q23 у больных АРЭ

Для определения минимальной области, содержащей локус эритроцитоза, был проведен рекомбинационный анализ, для чего были построены гаплотипы хромосом, сегрегирующих и не сегрегирующих с заболеванием.

Нами были обнаружены 23 рекомбинации между хромосомами, сегрегирующими и не сегрегирующими с АРЭ, в районе 21.9 сМ внутри картированного локуса (рис. 4). Анализ рекомбинаций позволил установить, что маркер D11S4111 является проксимальным маркером, фланкирующим локус АРЭ, а маркер D11S1356 - дистальным. Т.о. определен интервал, содержащий локус АРЭ, с генетическим размером 4.8 сМ, физический размер которого равен 2.07 млн.п.н. между маркерами D11S4111 и D11S1356.

Исследование неравновесия по сцеплению маркеров на хромосоме 11q23 и АРЭ

Подходом для более точной локализации гена является анализ неравновесия по сцеплению. Мы провели анализ 29 маркеров из области локализации гена на наличие неравновесия по сцеплению. Неравновесие по сцеплению для большинства маркеров не обнаружено. Однако, для маркеров D11S4127 (аллель №6), D11S1998 (аллель №3), AP757/98 (аллель №3) имеется неравновесие по сцеплению с р<0.05 (2=5.50, 4.85 и 6.18, соответственно).

Рисунок 4. Рекомбинации в семьях с АРЭ.

участки: хромосомы, сегрегирующей с заболеванием, хромосомы, не сегрегирующей с заболеванием, неинформативные участки.

Данное значение вероятности указывает на достоверность различий выборок хромосом, сегрегирующих и не сегрегирующих с заболеванием. Исходя из предположения, что все сегрегирующие хромосомы произошли от одной хромосомы основателя, мы могли ожидать, что в выборке таких хромосом мы обнаружим преимущественно один аллель. Такой маркер найден не был. Мы можем предположить следующие основные причины отсутствия гаплотипа основателя:

-Ложно-положительный результат сцепления с регионом 11q23. Однако получено значение LOD-балла больше 3 для нескольких маркеров.

-Диагностика людей с критической рекомбинацией не верна, и ген локализован вне картированного района, который мы сейчас считаем областью локализации гена. Однако, некоторые маркеры, расположенные вне минимального региона были проанализированы, и с ними также не было обнаружено неравновесия по сцеплению.

-Сохраненный район гаплотипа основателя имеет малый размер из-за высокой частоты рекомбинаций на данном участке и большого возраста мутации в популяции.

-В картированном районе расположен ген-модификатор, влияющий на разные проявления мутации в гене, лежащем в другой области. Изменения в этом гене-модификаторе могут присутствовать не только у чувашей, и хромосомы больных с модифицирующим аллелем не произошли от одного основателя, либо данные аллели привнесены в популяцию чувашей очень давно.

Анализ генов-кандидатов в области локализации гена-модификатора

В области локализации гена, ответственного за возникновение АРЭ, из 21 гена мы выбрали два гена, которые могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль интересующего нас гена. Это ген FXY D2, кодирующий г-субъединицу Na+-K+-ATФазы, и ген FXY D6. Ген FXY D6 имеет гомологию с геном FXY D2, однако его функция на сегодняшний день не известна.

Na+-K+-ATФаза - мембраносвязанный фермент, поддерживающий градиент Na+ и K+ на плазматической мембране клеток. Na+ играет важную роль в регуляции объема клетки, цитплазматического рН и концентрации Са++ при работе Na+/Са++ ионообменников, а также в различных транспортных процессах. Согласно предложенной Фишером модели путей сигнальной трансдукции для регуляции мРНК эритропоэтина кальций участвует в этой регуляции. Т.о., Na+-K+-ATФаза опосредованно через регуляцию концентрации Са++, может быть, влияет на продукцию эритропоэтина.

Никаких изменений в гене FXY D2 в результате секвенирования ДНК больного найдено не было. При анализе семей с помощью SSCP-метода были обнаружены четыре полиморфизма. Один из них выявлен нами впервые.

Также мы исследовали внутригенные полиморфные маркеры (FXY A, D11S1998) и SNPs и гаплотипы по данным маркерам на наличие неравновесия по сцеплению с АРЭ. Неравновесие по сцеплению обнаружено с маркером D11S1998 (ч2=4.85 р=0.028 для аллеля №3). Однако, при анализе полиморфных внутригенных маркеров и SNPs, локализованных в гене FXY D2, гаплотипы, ассоциированные с заболеванием, обнаружены не были.

В гене FXY D6 ни мутация, ни SNPs найдены не были.

Совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных АРЭ

Выявление нами гетерозиготного носителя мутации Arg200Trp в гене VHL с клиническими признаками эритроцитоза, а также бессимптомной гомозиготной носительницы данной мутации может указывать на ее неполную пенетрантность. Кроме того, мутации в гене VHL описаны при синдроме VHL и при спорадических опухолях. Однако, у больных АРЭ и их родственников, являющихся носителями мутации в гетерозиготном состоянии, никаких опухолей выявлено не было. Вместе с тем, полицитемия, наблюдающаяся у больных АРЭ, не является обязательным симптомом при синдроме VHL.

Некоторые мутации, найденные у больных АРЭ (наиболее частая мутация Arg200Trp, Val130Leu и Leu188Val), также описаны у больных с синдромом VHL, в спорадических опухолях. Мутация Arg200Trp приводит к развитию эритроцитоза обычно в гомозиготном состоянии, гетерозиготные носители имеют нормальный уровень гемоглобина, гематокрита и Еро. Однако описаны больные с тяжелым эритроцитозом, являющиеся гетерозиготными носителями данной мутации. Т.о., исходя из наличия гетерозиготных больных эритроцитозом без признаков опухолей, а, также учитывая, что некоторые мутации, приводящие к развитию эритроцитоза, характерны для больных с синдромом VHL, можно предположить, что дополнительные изменения в других генах могут вносить вклад в развитие эритроцитоза.

Синдром VHL - аутосомно-доминантное заболевание. Однако в опухолях происходит инактивация нормального аллеля путем делеции короткого плеча или всей хромосомы 3, соматической мутации или гиперметилирования. Было показано, что помимо потери части или всей хромосомы 3 в некоторых опухолях происходит потеря значительного участка или всей хромосомы 11, что способствует усиленному росту опухоли. Этот факт можно рассматривать как подтверждение того, что участие хромосомы 11 в развитии синдрома VHL может быть значительным.

Исходя из изложенного выше можно предположить наличие гена, модифицирующего действие мутации Arg200Trp в гене VHL, у больных АРЭ. Поскольку участие хромосомы 11 в развитии опухолей, развивающихся у больных с мутациями в гене VHL, показано по различным литературным данным, а также нами было выявлено сцепление фенотипа заболевания с локусом 11q23, мы проанализировали совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных АРЭ. Для этого были использованы полиморфные маркеры D11S4111, D11S4127 и D11S1356 для хромосомы 11q23 и D3S1597 и D3S1263 для хромосомы 3р25. Анализ проведен для 32 больных и 39 их клинически здоровых родственников из 13 семей. Контрольную группу составили 35 российских семей, не имеющих больных АРЭ, с двумя и более детьми (всего 149 человек). В качестве референсной пары хромосом 3 и 11, полученной от каждого из родителей, выбиралась та, которую получил первый больной ребенок в семье, отягощенной АРЭ, или первый по родословной ребенок в контрольных семьях. Для остальных детей определялось совпадение (или отличие) передачи той же хромосомы 11 при условии передачи той же хромосомы 3 только от матери или только от отца.

Всего мы смогли проанализировать 40 случаев передачи таких пар из хромосомы 11 с хромосомой 3, несущей мутацию Arg200Trp в гене VHL, и 23 случая передачи хромосомы 11 с хромосомой 3, не несущей мутацию Arg200Trp, у больных и здоровых сибсов в семьях с АРЭ из Чувашии. Так же была проанализирована 81 передача данной пары хромосом в контрольной группе. Все передачи, при которых регистрировались рекомбинации по хромосоме 3 или 11, из рассмотрения были исключены. В 30 случаях из 40 при передаче хромосомы 3 с мутацией родители передавали детям ту же хромосому 11, которую получил в данной семье первый больной ребенок, т.е. совместная передача хромосом 3 и 11 осуществилась в 75% случаев. Исходя из предположения, что при АРЭ существует зависимость расхождения хромосом в гаметогенезе, мы проанализировали, как с хромосомой 3 без мутации передается хромосома 11, отличная от той, которую каждый из родителей передал первому больному ребенку в семье. В этой паре совместная передача произошла только в 10 случаях из 23, что составило 43%. Теоретическая вероятность совместного наследования двух независимых хромосом в одном наборе, переданном ребенку от родителя, составляет 50%. В группе семей, не отягощенных по АРЭ, наследование от каждого из родителей набора хромосом 3 и 11, аналогичного полученному первым ребенком в семье, наблюдалось в 34 случаях из 81 (42%). Суммарные данные, полученные в результате исследования, представлены в таблице 6.

Полученные результаты были оценены с использованием стандартного критерия 2. При сравнении частоты совместного наследования областей хромосом 3р25 и 11q23 в наборе с хромосомой 3 с мутацией с частотой их совместного наследования в наборе с хромосомой 3, не несущей мутацию, получено значение 2 =16.14 (р<0.001), что указывает на достоверность различий в наследовании данной пары хромосом в зависимости от наличия мутации Arg200Trp в гене VHL. Также достоверное различие между группами было получено при сравнении частоты совместного наследования участков 3р25 и 11q23 в случае хромосомы 3 с мутацией в семьях с АРЭ с частотой их совместного наследования в контрольных семьях, не отягощенных АРЭ (2 =17.91, р<0.001). При сравнении данных, полученных для пары хромосомы 3, не несущей мутацию, и хромосомы 11, не сегрегирующей с заболеванием, в семьях с АРЭ и в контрольной группе семей, получено значение 2 =0.07 (р>0.7), т.е. различий между группами нет.

Таблица 6. Наследование хромосом 3р25 и 11q23 у больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом и в контрольной группе. (n - количество передач).

Таким образом, по результатам микросателлитного анализа полиморфных маркеров хромосом 3 (3р25) и 11 (11q23) показано совместное наследование двух локусов у больных АРЭ. Этот факт, в сочетании с уже описанными случаями совместной делеции хромосом 3 и 11 в различных опухолях, а также отсутствие у больных эритроцитозом и их родственников-гетерозиготных носителей мутации опухолей, характерных для синдрома VHL, позволяет предположить наличие на хромосоме 11q23 гена-модификатора, влияющего на развитие заболевания. Кроме того, выделяют две формы заболевания у чувашей. Одна из них протекает более доброкачественно и поддается коррекции. Возможно, присутствие или отсутствие изменения в гене-модификаторе приводит к возникновению той или иной формы эритроцитоза.

ВЫВОДЫ

1. В выборке чувашских семей, отягощенных аутосомно-рецессивным эритроцитозом, обнаружено сцепление заболевания с локусами 11q23 и 3р25. Для локуса 3р25 максимальный Lod=12.4 при =0 для маркера D3S1263. Локус, возможно содержащий модифицирующий фактор, картирован в области 4,8 сМ между маркерами D11S4111 и D11S1356, максимальный Lod=4,23 при =0,05 для маркера АР757/98.

2. Определена популяционная частота носительства мутации Arg200Trp в гене VHL среди чувашей. Аллельная частота мутации равна 1.84%, расчетная частота эритроцитоза - 1:3000 человек, что выше распространенности заболевания, определенной в ходе клинико-эпидемиологических исследований (1:4450 человек). Выявлен бессимптомный носитель двух мутантных аллелей. Полученные данные указывают на возможную неполную пенетрантность мутации Arg200Trp при эритроцитозе в Чувашии.

3. Разработана система молекулярно-генетических методов для простой и быстрой идентификации мутации Arg200Trp в гене VHL в целях диагностики заболевания, а также скрининговая тест-система на основе метода real-time PCR для выявления гетерозиготного носительства мутации.

4. Определены популяционные частоты мутации Arg200Trp среди соседних с чувашами народностей Волго-Уральского региона. Для марийцев аллельная частота составила 0.87%, расчетная частота заболевания - 1:13 150 человек, для удмуртов аллельная частота - 0.47%, расчетная частота заболевания - 1:44 600 человек. Среди башкир и русских мутация Arg200Trp не выявлена.

5. В группе больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом из Чувашии выявлено неравновесие по сцеплению с полиморфными маркерами, тесно сцепленными с геном VHL. Эти данные подтверждают влияние эффекта основателя на накопление эритроцитоза в Чувашии. Время распространения мутации Arg200Trp среди чувашей составляет 1250±733 лет.

6. Показана зависимая сегрегация хромосомных локусов 3р25 и 11q23 в семьях со случаями аутосомно-рецессивного эритроцитоза (ч2=16.14 р<0.001 при сравнении наследования этих локусов у больных с их здоровыми сибсами и ч2=17.91 p<0.001 при сравнении с контрольной выборкой семей). В локусе 11q23 среди чувашей вероятно наличие модифицирующего фактора, ответственного за неполную пенетрантность эритроцитоза и отсутствие опухолевых процессов у носителей мутации Arg200Trp.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. N.Vasserman, S.Tverskaya, L.Karzakova, O.Evgrafov. “Exclusion of linkage between autosomal recessieve erythrocytosis and erythropoietin receptor gene.” // Medizinische Genetik.-1997- v.9-№2-P4-166.

2. Vasserman N., Tverskaya S., Karzakova L., Evgrafov O. “Locus for autosomal recessive benign erythrocytosis maps to chromosome 11q.” // Europ. J. Hum. Genet.-1998-v.6-suppl. 1- C.207.

3. Вассерман Н.Н., Карзакова Л.М., Поляков А.В., Тверская С.М., Евграфов О.В. “Картирование гена рецессивного эритроцитоза в семьях Чувашской популяции.” // “Геном человека - 99.”-1999-с.133.

4. N.Vasserman, L.Karzakova, S.Tverskaya, V.Saperov, O.Muchukova, G.Pavlova, N.Efimova, N.Vankina, O.Evgrafov. “Localization of the gene responsible for familial benign polycythemia to chromosome 11q23.” // Human heredity.-1999-v.49-pp.129-132.

5. Vasserman N., Tverskaya S., Shagina I., Polyakov A., Karzakova L., Evgrafov O. “Refined mapping of 2cM candidate region for autosomal recessive benign erythrocytosis.” // Europ. J. Hum. Genet.-2000-v.8-suppl 1-P584.

6. Tverskaya S., Vasserman N., Polyakov A., Evgrafov O. “The investigation of candidate genes for autosomal recessive benign erythrocytosis.” // Human Genome Meeting.-2002- Shanghai, China-№364.

7. N. Vasserman, S. Tverskaya, R. Zinchenko, A. Polyakov. “Frequencies of the C598T mutation in VHL associated with autosomal recessive erythrocytosis.” // Europ. J. Hum. Genet.-2005-v.13-suppl 1-P1256.

8. S. Tverskaya, N. Vasserman, A. Polyakov. “Associated transmission chromosomes 3+11 in patients with autosomal recessive benign erythrocytosis from Chuvashia.” // Europ. J. Hum. Genet.-2005-v.13-suppl 1-P1132.

9. Вассерман Н.Н., Тверская С.М., Зинченко Р.А., Поляков А.В. “Популяционная частота мутации С598Т в гене VHL, приводящей к развитию аутосомно-рецессивного эритроцитоза.” // Медицинская генетика.-2005.-т.4-№4-с. 165. (тезисы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа).

10. Н.Н. Вассерман, С.М. Тверская, А.В. Поляков. “Совместное наследование хромосом 3 и 11 у больных аутосомно-рецессивным эритроцитозом из Чувашии.” // Генетика.- 2005-т. 41.-№9-стр. 1259-1264.

11. N.N.Vasserman, S.M. Tverskaya , A.V. Polyakov “Coinheritance of chromosomes 3 and 11 in the patients with autosomal recessive polycythemia from Chuvachia.” // Russian Journal of Genetics.-2005-v.41-№9-pp.1035-1039.

12. Близнец Е.А., Вассерман Н.Н., Поляков А.В. “Молекулярные методы диагностики распространенных наследственных «чувашских» болезней.” // Медицинская генетика.- 2006-т.5-прилож.1-стр. 10-13.

13. Павлова Г.П., Ефимова Н.К., Сметанина Н.С., Тверская С.М., Вассерман Н.Н., Поляков А.В. “Наследственный эритроцитоз.” // глава в монографии “Генетическая структура и наследственные болезни чувашской популяции” (под ред. Гинтера Е.К., Зинченко Р.А.), ИД “Пегас”, Чебоксары.-2006-стр. 202-212.

СОКРАЩЕНИЯ

АРЭ - аутосомно-рецессивный эритроцитоз

ДИ - доверительный интервал

ПДАФ - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

SNPs - single nucleotide polymorphisms

SSCP - single-strand conformation polymorphism

VHL - von Hippel-Lindau syndrom

Размещено на Allbest.ru