Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Молекулярно-генетический анализ факторов риска коронаросклероза и ишемической болезни мозга

03.00.26 - Молекулярная генетика

кандидата биологических наук

Тупицына Татьяна Викторовна

Москва, 2007 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: д.б.н. Сломинский П.А.

Официальные оппоненты: д.б.н. Карпухин А.В.

д.м.н. Метельская В.А.

Ведущая организация:

ФГУ Российский НИИ геронтологии Федерального агентства

по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «___»____________ 2007 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.001.016.01 в ГУ Медико-генетический научный цент РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан «___»____________ 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета д.б.н. проф. Курило Л.Ф.

сосудистый ишемический инсульт инфаркт

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Достижения современной молекулярной генетики по расшифровке генома человека способствовали рождению новой науки - медицинской геномики, одно из центральных мест в которой занимают исследования по изучению влияния генетических факторов на формирование патологических состояний человека. Особое место в данных исследованиях занимают заболевания сердечно-сосудистой системы (ССЗ), так как они широко распространены, характеризуются тяжелым течением, приводящим к инвалидизации, и высоким уровнем смертности Оганов Р.Г., 2002. Большое внимание уделяют таким заболеваниям, как ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ишемическая болезнь мозга (ИБМ). В структуре смертности от ССЗ на долю этих заболеваний приходится около 85-90% Оганов Р.Г., 2002. Социальную значимость проблемы усиливает наблюдающаяся в последние годы тенденция к возникновению инсультов и инфарктов у лиц молодого возраста. В связи с этим исследования, посвященные изучению данных заболеваний, приобретают особую актуальность.

В основе развития ИБС и ИБМ лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды. Сложность патогенеза создает большие трудности при изучении природы этих заболеваний. В связи с этим проблема исследования генетических механизмов ССЗ является достаточно сложной и связана с разработкой адекватных подходов и методов анализа, что отмечается многими авторами Huang S.,2000; Todd J.A.,1999. Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития ССЗ связан с выделением группы генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания - это так называемые гены-кандидаты.

Одним из основных пусковых механизмов патогенеза ИБС и ИБМ является нарушение функциональных свойств эндотелия, что в дальнейшем приводит к изменению тонуса сосудистой стенки и дальнейшему развитию и прогрессированию патологического процесса. В связи с этим большой интерес представляют гены, продукты которых участвуют в регуляции сосудистого тонуса.

Другой хорошо известный механизм развития ССЗ связан с нарушением липидного обмена [Dawber T.R., 1980; Shaper A.G., 1985]. Недавно были найдены новые белки, участвующие в обмене липидов [Dean M. et al., 2001; Van der Vliet H.N. et al., 2001]. Изменение их структуры и функций может быть фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, в связи с чем, гены этих белков могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов ИБС и ИБМ.

В последние годы в качестве потенциального патогенетического фактора при различных ССЗ рассматривается также апоптоз [Isner J.M. et al., 1995]. Известно, что апоптоз является одним из механизмов ишемического повреждения клетки и, возможно, основным фактором увеличения зоны инфаркта мозга при инсульте. В связи с этим, особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение генов, продукты которых вовлечены в реализацию программы клеточной гибели, что позволит в дальнейшем раскрыть молекулярно-генетические основы ишемического повреждения мозга и выявить факторы индивидуальной чувствительности вещества мозга к ишемии.

Существует несколько подходов к изучению мультифакториальных заболеваний, в том числе ИБС и ИБМ. Наиболее широко используются методы ассоциативного анализа типа "случай-контроль". На современном этапе наиболее эффективным методом изучения ИБС и ИБМ является сибсовый анализ Spielman R.S., Ewens W.J., 1998. Сибсовый метод позволяет проводить анализ сцепления между геном и заболеванием, поиск ассоциаций для выявления возможных связей между анализируемым полиморфизмом гена и различными клиническими проявлениями заболевания, как в группе пробандов, так и в группе их сибсов, а также оценить риск развития того или иного заболевания у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

В связи с тем, что работы по изучению молекулярно-генетических основ наследственной предрасположенности к ИБС и ИБМ в России малочисленны, а с использованием сибсового метода не проводились вообще, особую значимость приобретает проведение подобного рода исследований среди населения России.

Цель исследования.

Целью настоящей работы является изучение вклада полиморфизма ряда генов-кандидатов в развитие ССЗ у больных с ангиографически подтвержденной ишемической болезнью сердца, у больных с хронической ишемической болезнью мозга и ишемическим инсультом, а также у их сибсов, с помощью сибсового и ассоциативного методов; изучение влияния полиморфных вариантов генов-регуляторов апоптоза на формирование инфаркта мозга и течение острого ишемического атеротромботического инсульта; выявление генетических маркеров данных заболеваний.

Задачи исследования.

1. Изучить частоты генотипов и аллелей по M235T полиморфизму гена ангиотензиногена (АТГ), инсерционно-делеционному полиморфизму гена ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), 4a/4b полиморфизму минисателлита гена эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS), R219K и R1587K полиморфизмам гена АТФ-связывающего кассетного транспортера типа А1 (АВСА1), S19W и -1131T>C полиморфизмам гена аполипопротеина А-V (APOA5), C311S полиморфизму гена параоксоназы 2 (PON2), R72P полиморфизму гена р53 и С/А полиморфизму 3-фланкирующей области гена белка эфрина В3 (EFNB3) (полиморфизм GDB:181497) у больных ИБС, ИБМ и их сибсов.

2. Проанализировать возможное сцепление полиморфных участков каждого изучаемого гена с ИБС и ее основными клиническими проявлениями - инфарктом миокарда (ИМ) и стенокардией, а также с хронической ишемической болезнью мозга и инсультом, используя сибсовый тест на неравновесность передачи.

3. Провести корреляционный анализ изучаемых ДНК-маркеров с ИБС, ИБМ и основными клиническими проявлениями этих заболеваний в группах пробандов и сибсов.

4. Изучить полиморфизмы rs3219023 и rs2048426 в гене полимеразы 1 поли(АДФ)-рибозы (PARP1), полиморфизм rs189994 в гене апоптоз-индуцирующего фактора (AIF), полиморфизм rs2906766 в гене каспазы 9 (CASP9), С/А полиморфизм в 3-фланкирующей области гена белка эфрина В3 (EFNB3), IVS9-675C>A полиморфизм в гене индуцируемого гипоксией фактора 1 (HIF-1A) у больных с острым ишемическим атеротромботическим инсультом и проанализировать влияние этих полиморфизмов на формирование инфаркта мозга и течение заболевания.

5. Выявить генетические маркеры ИБС и ИБМ и оценить их вклад в развитие данных ССЗ.

Научная новизна работы.

Впервые, используя сибсовый метод, проведен анализ вклада десяти диаллельных ДНК-маркеров в развитие ИБС и ИБМ у лиц, относящихся к русскому этносу. Показано, что ни один из изучаемых генов-кандидатов ССЗ не является главным геном ИБС и ИБМ, что подчеркивает многофакторный характер этих заболеваний.

При изучении пар сибсов обнаружено, что инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм гена АПФ ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у лиц с отягощенным по ИБС семейным анамнезом. Генетическим маркером заболевания является генотип DD. Впервые показано, что DD генотип также ассоциирован с развитием ИБС у сибсов с отягощенной по инсульту наследственностью.

Впервые установлено, что R219K полиморфизм гена АВСА1 ассоциирован с развитием ИБС. Аллель 219К и генотипы, его содержащие (К219К, R219K), являются фактором повышенного риска развития и вариантом более тяжелого течения данного заболевания.

Установлено, что R1587K полиморфизм гена АВСА1 ассоциирован с развитием ИБС, инфаркта миокарда и стенокардии. Аллель R1587 и генотип R1587R являются фактором повышенного риска развития этих заболеваний у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

Впервые обнаружена достоверная корреляция -1131Т/С полиморфизма гена АРОА5 с параметрами, характеризующими выраженность атеросклеротического процесса в коронарных артериях у больных ИБС. Показано, что генотипы -1131С/С и -1131Т/С ассоциированы с более высокой степенью поражения венечных артерий.

Впервые показана ассоциация R72P полиморфизма гена р53 с риском развития гипертрофии миокарда левого желудочка (ГЛЖ) у больных ИБС. Установлено, что аллель Р является протективным фактором и наличие в генотипе аллеля Р приводит к снижению риска развития ГЛЖ у этих больных.

Впервые установлено, что C311S полиморфизм гена PON2 ассоциирован с развитием инфаркта миокарда и гипертрофии миокарда левого желудочка у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью. Фактором повышенного риска развития данных заболеваний является аллель C311 и генотип C311C.

Впервые проведен анализ вклада полиморфных вариантов ряда генов-регуляторов апоптоза в патогенез ишемического инсульта. Показана корреляция AG полиморфизма в первом интроне гена PARP1 (rs3219023) и С/А полиморфизма в 3-фланкирующей области гена EFNB3 (GDB:181497) с объемом инфаркта мозга и тяжестью состояния больных. Установлено, что генотип А/А по гену PARP1 и генотипы А/А и С/А по гену EFNB3 ассоциированы с развитием и прогрессированием инсульта и являются вариантом тяжелого течения заболевания у больных из России.

Впервые обнаружено, что аллель С по IVS9-675CA полиморфизму гена HIF-1A и генотипы С/С и С/А являются факторами повышенного риска развития ишемического инсульта в русской популяции.

Практическая значимость.

Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии таких ССЗ, как ишемическая болезнь сердца и ишемическая болезнь мозга, и являются основанием для разработки методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития данных заболеваний. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов ССЗ могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления лиц с высоким риском развития заболевания и проведения донозологической профилактики. Учитывая результаты генотипирования больных ИБС и ИБМ, возможно выделение группы пациентов с более тяжелым течением заболевания, что поможет дифференцировать у них лечебно-профилактические мероприятия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм гена АПФ ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у лиц с отягощенной по ИБС и по инсульту наследственностью. Маркером повышенного риска развития заболевания являются аллель D и генотип DD.

2. Полиморфизмы R219K и R1587K гена АВСА1 ассоциированы с развитием ишемической болезни сердца и ее основных клинических проявлений. Аллель 219К является фактором повышенного риска развития ИБС, стенокардии, артериальной гипертонии и вариантом более тяжелого течения данных заболеваний у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью. Аллель R1587 ассоциирован с повышенным риском развития ИБС, инфаркта миокарда и стенокардии у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

3. Полиморфизм -1131Т/С гена АРОА5 у больных ИБС коррелирует с параметрами, характеризующими выраженность атеросклероза в коронарных артериях - индексом стеноза и окклюзией сосудов. Генотипы -1131С/С и -1131Т/С ассоциированы с более высокой степенью поражения венечных артерий.

4. R72P полиморфизм гена р53 ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда левого желудочка (ГЛЖ) у больных ИБС - аллель 72Р является протективным фактором и приводит к снижению риска развития ГЛЖ у больных ИБС. C311S полиморфизм гена PON2 ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда левого желудочка, а также инфаркта миокарда у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью - аллель C311 и генотип C311C являются фактором повышенного риска развития данных заболеваний.

5. Полиморфизм IVS9-675CA гена HIF-1A ассоциирован с развитием ишемического атеротромботического инсульта в русской популяции - фактором повышенного риска развития данного заболевания является аллель С и содержащие его генотипы С/С и С/А. Замена AG в первом интроне гена PARP1 (полиморфизм rs3219023) и С/А полиморфизм в 3-фланкирующей области гена EFNB3 (GDB:181497) коррелируют с объемом инфаркта мозга у больных с острым атеротромботическим инсультом и тяжестью их состояния. Генотип А/А по гену PARP1, генотипы А/А и С/А по гену EFNB3 являются вариантом более тяжелого течения инсульта и дальнейшего прогрессирования патологического процесса.

6. M235T полиморфизм гена АТГ, 4a/4b полиморфизм гена eNOS, S19W полиморфизм гена АРОА5, полиморфизм rs189994 гена AIF и полиморфизм rs2906766 гена CASP9 не ассоциированы с развитием ИБС и ИБМ в русской популяции и не оказывают влияния на течение этих сердечно-сосудистых заболеваний у больных из России.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Апробация диссертации.

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Американского Общества Генетики Человека (ASHG) 2003-2004 г.г., Европейского Общества Генетики человека (ESHG) 2003-2006 г.г., съездах Российского общества медицинских генетиков 2001 и 2005 г.г., изложены на конкурсах работ на стипендию фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, ИМГ РАН, 2004 и 2006 г.г.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научном семинаре Медико-генетического научного центра РАМН 22 июня 2006 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения; 3-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводов; библиографического указателя. Список литературы состоит из 411 источников, среди которых 36 источников отечественной и 375 источников зарубежной литературы.

Текст диссертации изложен на 196-ти страницах машинописного текста, иллюстрирован 31 таблицей и 20 рисунками.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены пациенты, относящиеся к русскому этносу, после подписания ими или их ближайшими родственниками информированного согласия об участии в исследовании.

В первую группу были включены 85 пациентов с ишемической болезнью сердца, составляющих выборку пробандов, и 100 их родных братьев и сестер, составляющих выборку сибсов. Выборка сибсов является независимой выборкой неродственных друг другу индивидуумов, но представляет собой смещенную выборку, так как она сформирована на основании родства каждого сибса с соответствующим пробандом. Наличие родства между сибсом и больным ИБС в каждой отдельной паре пробанд-сибс позволяет охарактеризовать сибсов как выборку лиц с семейной предрасположенностью к развитию ишемической болезни сердца.

Всем лицам, включенным в исследование, проводилось комплексное клинико-инструментальное обследование. Диагноз ИБС был поставлен на основании анализа совокупности данных анамнеза, физикального обследования, биохимических показателей крови и клинико-инструментальной диагностики и затем был верифицирован с помощью коронароангиографии (КАГ). КАГ проводилась всем пробандам, а также сибсам, у которых на основании всего комплекса диагностических исследований была выявлена ИБС.

Во вторую группу было включено 85 больных с ишемическим атеротромботическим инсультом и 93 их сибса, 48 больных с хронической ИБМ и 53 их сибса; а также 60 больных с острым ишемическим атеротромботическим инсультом, поступивших в неврологическое отделение ГКБ №20 и ГКБ №31 г. Москвы в первые 12 часов с момента развития заболевания. Диагноз каротидного ишемического атеротромботического инсульта основывался на сборе данных анамнеза развития заболевания; исследовании соматического и неврологического статусов; данных клинико-инструментальных методов исследования.

Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов ССЗ были использованы препараты ДНК, полученные из 5 мл венозной крови пробандов и их сибсов. Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови человека проводилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции [Sambrook et al., 1989]. Определение полиморфизма проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей рестрикцией амплифицированного фрагмента ДНК соответствующими рестриктазами.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica for Windows 6.0”, программного обеспечения MS Excel 2000 (Microsoft), компьютерной программы RxC (Rows and Columns) [Roff D.A., Bentzen P., 1989] и программы для оценки неравновесия по сцеплению в парах сибсов (sibs transmission/disequilibrium test- S-TDT) [Spielman R.S., Ewens W.J., 1998]. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя относительного риска (ОР) по формуле:

ОР = [A/(A+B)] / [C/(C+D)], где A - число лиц с наличием, B - с отсутствием маркера среди больных; C и D - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение вклада полиморфизма генов АТГ, АПФ, eNOS, ABCA1, APOA5, PON2, р53, EFNB3 в развитие ИБС и ИБМ проводилось в несколько этапов с помощью ассоциативного метода в выборках различных типов.

Ассоциативный анализ ДНК маркеров с использованием теста неравновесности передачи в парах сибсов.

На первом этапе для оценки возможной ассоциации между данными генами и заболеванием был использован непараметрический S-TDT. Этот метод основан на совместном анализе распределения в парах сибсов аллельных вариантов исследуемого гена и клинических фенотипов. Он позволяет выявить высоко значимые ассоциации (сильное сцепление) между геном и заболеванием. С этой целью использовалась величина z-балла. Достоверными считали значения р менее 0.05, чему для диаллельных ДНК-маркеров соответствует значение z-балла более 2,47 Spielman R.S., Ewens W.J., 1998.

В результате проведенного анализа не было установлено сцепления между исследуемыми полиморфизмами генов АТГ, АПФ, eNOS, ABCA1, APOA5, PON2, р53, EFNB3 и ишемической болезнью сердца, а также ее основными клиническими проявлениями - инфарктом миокарда и стенокардией. z-балл не достигает значения 2,47 (p0,05). Не было выявлено сцепления между изучаемыми генами и ишемическим инсультом, а также хронической ишемической болезнью мозга.

Таким образом, анализ ассоциации с использованием S-TDT показал, что ни один из исследуемых генов не является главным геном, отвечающим за развитие таких заболеваний, как ИБС и ИБМ. Патогенез этих ССЗ обусловлен сложным взаимодействием различных генетических факторов друг с другом, а также с факторами внешней среды.

Корреляционный анализ в группах пробандов с ИБС и их сибсов.

На следующем этапе для изучения возможного вклада каждого из генов-кандидатов ИБС в развитие патологического процесса проводился поиск ассоциаций для выявления возможных связей между анализируемым полиморфизмом гена и заболеванием в группе пробандов и в группе их сибсов. Для этого был выполнен непараметрический корреляционный анализ (метод ), позволивший проанализировать корреляции между десятью ДНК-маркерами и клиническими признаками, описывающими состояние сердечно-сосудистой системы у больных ИБС и их сибсов. Выявленные статистически достоверные корреляции были затем проанализированы с использованием других более жестких методов статистического анализа (точный двусторонний критерий Фишера, критерий Ньюмана-Кеулса).

Анализ вклада R219К полиморфизма гена АТФ-связывающего кассетного транспортера типа А1 в развитие ИБС.

В результате корреляционного анализа в группе пробандов нами были выявлены статистически достоверные корреляции R219К полиморфизма гена АВСА1 с параметрами, характеризующими выраженность атеросклеротического поражения коронарных артерий - сосудистым индексом ( = -0.318, р = 0.006), индексом стеноза ( = -0.328, р = 0.001), окклюзией ( = -0.326, р = 0.027); стенокардией по функциональному классу (ФК) ( = -0.295, р = 0.011); хронической сердечной недостаточностью (ХСН) ( = -0.297, р = 0.039). В группе сибсов данный полиморфизм достоверно коррелирует с ИБС ( = -0.325, р = 0.012); стенокардией ( = -0.378, р = 0.007); артериальной гипертонией (АГ) ( = -0.325, р = 0.008); гипертрофией ЛЖ ( = -0.397, р = 0.011); уровнем ХС ЛПОНП ( = -0.229, р = 0.01) и ТГ ( = -0.259, р = 0.003).

На следующем этапе каждая достоверная корреляция анализировалась путем сравнения частоты аллельных вариантов данного полиморфного локуса у лиц с разными фенотипами. В связи с низкой численностью гомозигот по редкому аллелю 219К гена АВСА1 пациенты с генотипами К219К и R219К были объединены в одну группу.

В группе пробандов оценивалась степень атеросклеротического поражения коронарных артерий у пациентов с разными генотипами по результатам КАГ с помощью трех параметров: сосудистого индекса, индекса стеноза и наличия окклюзии крупных сосудов.

При изучении распределения средних значений индекса стеноза у пробандов с разными генотипами по гену АВСА1 было выявлено, что средние значения этого индекса достоверно выше в объединенной группе больных с генотипами К219К и R219К (10,07±4,15) при сравнении с гомозиготами по R219 аллелю (7,29±4,57), р = 0,004.

Обнаружено, что у пациентов с К219К и R219К генотипами достоверно чаще наблюдается 2-х и 3-х сосудистое поражение коронарных артерий, а у лиц с R219R генотипом - 1-о сосудистое поражение (² = 7.44, р = 0.001, таблица 1). Таким образом, К219К и R219К генотипы гена АВСА1 ассоциированы с более тяжелым атеросклеротическим поражением коронарных артерий.

Таблица 1. Сосудистый индекс, характеризующий степень атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ИБС с разными генотипами по R219К полиморфизму гена АВСА1.

Параметры	Генотипы KK и RK	Генотип RR	р
Сосудистый индекс	1	11%	41%	0,001
	2	48%	27%
	3	41%	32%

В группе сибсов исследуемый полиморфизм гена АВСА1 статистически достоверно коррелирует с ИБС, стенокардией и АГ. Анализ распределения частот генотипов показал, что у сибсов с вышеперечисленными заболеваниями достоверно повышена частота генотипов К219К, R219К и аллеля 219К и достоверно понижена частота генотипа R219R и аллеля R219 (таблица 2).

Таблица 2. Развитие ИБС, стенокардии и АГ у сибсов с К219К и R219К генотипами.

Параметры	ИБС	Стенокардия	АГ
	есть	нет	есть	нет	есть	нет
Генотипы КК и RК	67%	46%	74%	46%	63%	35%
Генотип RR	33%	54%	26%	54%	37%	65%
р	0,044*	0,027*	0,023*
OР	2,38	3,3	2,87
ДИ	1,02-5,80	1,08-10,23	1,26-6,56
Аллель К	43%	27%	47%	28%	39%	24%
Аллель R	57%	73%	53%	72%	61%	76%
р	0,019*	0,007*	0,019*

Таким образом, генотипы К219К и R219К ассоциированы с повышенным риском развития ИБС, стенокардии и АГ у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

Из полученных данных видно, что средние уровни ХС ЛПОНП и ТГ достоверно выше в объединенной группе сибсов с генотипами К219К и R219К по сравнению с гомозиготами по R219 аллелю (р = 0.038; 0.023) (диаграмма 1).



А Б

Диаграмма 1. А. Средний уровень ХС ЛПОНП у сибсов с разными генотипами по гену АВСА1. Средний уровень ХС ЛПОНП у сибсов с генотипами К219К и R219К равен 30,49±12,63 мг/дл; у сибсов с генотипом R219R - 25,25±12,15 мг/дл (р = 0,038). Б. Средний уровень ТГ у сибсов с разными генотипами по гену АВСА1. Средний уровень ТГ у сибсов с генотипами К219К и R219К равен 157,25±72,86 мг/дл; у сибсов с генотипом R219R - 126,21±60,79мг/дл (р = 0,023).

Таким образом, все данные, полученные при анализе ассоциации между R219К полиморфизмом гена АВСА1 и ИБС как в группе пробандов, так и в группе сибсов, указывают на то, что аллель 219К является фактором повышенного риска развития ИБС и более тяжелого варианта течения данного заболевания.

Анализ вклада R1587К полиморфизма гена ABCA1 в развитие ИБС.

При изучении влияния R1587К полиморфизма гена АВСА1 на клинические параметры ИБС и биохимические показатели в группе больных не было выявлено статистически достоверных корреляций исследуемого полиморфизма с основными клиническими проявлениями заболевания - ИМ и стенокардией, а также со степенью атеросклеротического повреждения коронарных артерий; R1587К полиморфизм не ассоциирован и с уровнем фракций липопротеидов крови.

В группе сибсов были установлены статистически достоверные корреляции между R1587К полиморфизмом гена АВСА1 и ИБС ( = -0.671, р 0.001), ИМ ( = -0.951, р = 0.0006), стенокардией ( = -0.493, р = 0.011).

На следующем этапе сравнивали частоты распределения аллельных вариантов данного полиморфного локуса у сибсов с разными фенотипами. В связи с низкой численностью гомозигот по редкому аллелю 1587К гена АВСА1 сибсы с генотипами К1587К и R1587К были объединены в одну группу.

Проведенный анализ показал, что у сибсов с ИБС, ИМ и стенокардией достоверно повышена частота генотипа R1587R и аллеля R1587 и достоверно понижена частота генотипов К1587К, R1587К и аллеля 1587К (таблица 3).

Таблица 3. Развитие ИБС, ИМ и стенокардии у сибсов с R1587R генотипом.

Параметры	ИБС	ИМ	Стенокардия
	есть	нет	есть	нет	есть	нет
Генотипы КК и RК	13%	43%	9%	36%	15%	39%
Генотип RR	87%	57%	91%	64%	85%	61%
р	0,043*	0,050*	0,045*
OР	4,88	6,18	3,59
ДИ	4,14-7,62	2,26-10,1	2,00-5,18
Аллель К	7%	24%	5%	21%	8%	21%
Аллель R	93%	76%	95%	79%	92%	79%
р	0,005*	0,025*	0,047*

Таким образом, из полученных данных можно сделать вывод о том, что R1587К полиморфизм гена АВСА1 не влияет на степень тяжести заболевания у больных ИБС, однако аллель R1587 является фактором повышенного риска развития таких ССЗ, как ИБС, ИМ и стенокардия (ОР = 4.88, 6.18, 3.59 соответственно).

Анализ вклада -1131TC полиморфизма гена аполипопротеина А-V в развитие ИБС.

Для выявления возможных связей между анализируемым полиморфизмом гена APOA5 и развитием заболевания в группе сибсов, а также тяжестью его течения (степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий, уровнем липидного спектра и др. характеристиками) в группе пробандов был проведен непараметрический корреляционный анализ. В связи с низкой частотой встречаемости аллеля -1131C сибсы с генотипами -1131T/C и -1131C/C были объединены в одну группу (в выборке больных частота генотипа -1131С/С равна 0).

В группе пробандов исследуемый полиморфизм статистически достоверно коррелирует со стенокардией по ФК ( = 0.403, р = 0.041), уровнем ТГ в плазме крови ( = 0.373, р = 0.021) и параметрами, характеризующими выраженность атеросклероза в коронарных артериях - индексом стеноза ( = 0.365, р = 0.026) и окклюзией ( = 0.612, р = 0.002).

При изучении распределения среднего значения индекса стеноза у пробандов с разными генотипами по гену АРОА5 было установлено, что среднее значение этого индекса достоверно выше в группе больных с генотипом ТС (11,505,72) по сравнению с больными, имеющими генотип ТТ (8,364,29), р = 0,039.

В результате проведенного анализа были установлены также статистически достоверные различия в распределении частот генотипов у пробандов с окклюзией коронарных артерий и без нее. Как видно из данных, представленных в таблице 4, у больных, имеющих окклюзию крупных коронарных артерий, статистически достоверно повышена частота генотипа ТС и понижена частота генотипа ТТ (р = 0,039) (таблица 4).

Таблица 4. Развитие окклюзии у больных ИБС с генотипом ТС по -1131TC полиморфизму гена АРОА5.

Параметры	Генотип ТС	Генотип ТТ	р
Окклюзия	есть	20,5%	79,5%	0,039
	нет	6%	94%

В группе сибсов были выявлены статистически достоверные корреляции -1131TC полиморфизма гена АРОА5 с ИБС ( = -0.627, р = 0.03) и с развитием гипертрофии миокарда ЛЖ ( = -0.997, р = 0.032). Однако, при попарном сравнении частот генотипов и аллелей у сибсов с наличием заболевания и без него не было выявлено статистически достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей как между сибсами с ИБС и без ИБС, так и между сибсами с ГЛЖ и без ГЛЖ

В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что -1131ТС полиморфизм гена АРОА5 не влияет на риск развития ИБС и ее основных клинических проявлений, но может оказывать влияние на степень тяжести заболевания - у больных ИБС с генотипом ТС наблюдается более тяжелое атеросклеротическое поражение венечных артерий.

Анализ вклада C311S полиморфизма гена параоксоназы 2 в развитие ИБС.

Как показали результаты корреляционного анализа, в группе сибсов была выявлена статистически достоверная корреляция C311S полиморфизма гена PON2 с ИМ ( = 0.523, р = 0.007 ) и с ГЛЖ ( = 0.351, р = 0.028 ). При изучении распределения частоты встречаемости генотипов и аллелей у сибсов, перенесших ИМ и без него, были установлены статистически достоверные различия в распределении частоты генотипов и аллелей между двумя группами сибсов. У сибсов, перенесших ИМ, наблюдается достоверное повышение частоты генотипа СС и аллеля С (² = 7.25, 5.59; р = 0.007, 0.018). СС генотип ассоциирован с повышенным риском развития данного заболевания (ОР = 5.3, ДИ 1.52; 18.71). У сибсов с гипертрофией миокарда ЛЖ также достоверно повышена частота генотипа СС (² = 4.76, р = 0.029) и наблюдается тенденция к повышению частоты аллеля С (² = 3.32; р = 0.068) по сравнению с сибсами без ГЛЖ. Относительный риск развития ГЛЖ у сибсов с СС генотипом повышен в 3 раза (таблица 5).

Таблица 5. Распределение частот генотипов и аллелей по C311S полиморфизму гена PON2 у сибсов с ИМ и с гипертрофией ЛЖ.

Параметры	ИМ	ГЛЖ
	есть	нет	есть	нет
Частота генотипа CC	37,5%	7%	25%	7%
Частота генотипов SS и CS	62,5%	93%	75%	93%
р	0,007*	0,029*
OР	5,33	2,96
ДИ	1,52-18,71	1,21-7,27
Аллель C	56%	28%	44%	27%
Аллель S	44%	72%	56%	73%
р	0,018*	0,068

Таким образом, C311S полиморфизм гена PON2 не ассоциирован с параметрами, определяющими степень тяжести ИБС у больных. Однако данный полиморфизм ассоциирован с риском развития гипертрофии миокарда ЛЖ и ИМ и может, таким образом, оказывать влияние на формирование этих заболеваний у лиц с отягощенным по ИБС семейным анамнезом.

Анализ вклада инсерционно-делеционного полиморфизма гена АПФ в развитие ИБС.

В результате проведенного корреляционного анализа было установлено, что в группе сибсов I/D полиморфизм гена АПФ достоверно коррелирует с ИБС ( = 0.354, р = 0.004), ИМ ( = 0.453, р = 0.016), стенокардией ( = 0.374, р = 0.011) и атеросклеротическим поражением клапанов сердца ( = 0.275, р = 0.019).

В группе сибсов с ИБС достоверно повышена частота генотипа DD по сравнению с сибсами без ИБС (р = 0.025) и отмечается тенденция к повышению частоты аллеля D (р = 0.082). Таким образом, DD генотип ассоциирован с повышенным риском развития ИБС у лиц, брат или сестра которых уже болеют ИБС (ОР = 2.8, ДИ 1.12; 7.04) Наиболее сильная корреляция исследуемого полиморфизма в группе сибсов выявлена с ИМ ( = 0.453, р = 0.016). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей у сибсов, перенесших документированный ИМ, обнаружено достоверное повышение частоты генотипа DD (р = 0.018), и аллеля D (р = 0.015) и, соответственно, достоверное понижение частоты генотипа II и аллеля I по сравнению с сибсами без заболевания. Относительный риск развития инфаркта миокарда у сибсов с DD генотипом повышен (ОР = 5.5, ДИ 1.37; 22.04) Аналогичные данные получены и при изучении распределения частот генотипов у сибсов со стенокардией и без нее. Установлено, что у сибсов со стенокардией достоверно повышена частота генотипа DD (р = 0.028). Таким образом, DD генотип ассоциирован с повышенным риском развития стенокардии у сибсов (ОР = 3.3, ДИ 1.14; 9.59) (таблица 6).

Таблица 6. Развитие ИБС и ее основных клинических проявлений у сибсов с DD генотипом.

Параметры	ИБС	Стенокардия	ИМ	Поражение клапанов
	есть	нет	есть	нет	есть	нет	есть	нет
Частота генотипа D/D	43%	21%	48%	21%	60%	21%	33%	22%
Частота генотипа I/I	57%	79%	52%	79%	40%	79%	67%	78%
р	0,025*	0,028*	0,018*	0,174
OР	2,8	3,3	5,5	1,34
ДИ	1,12-7,04	1,14-9,59	1,37-22,04	0,55-5,78
Аллель D	58%	46%	60%	46%	75%	46%	51%	49%
Аллель I	42%	54%	40%	54%	25%	54%	49%	51%
р	0,082	0,087	0,015*	0,444

Таким образом, в нашей выборке больных DD генотип является фактором повышенного риска развития ишемической болезни сердца и ее основных клинических проявлений (ИМ и стенокардии).

Анализ вклада R72P полиморфизма гена белка р53 в развитие ИБС.

Нами был проведен анализ возможной связи R72P полиморфизма гена белка р53 с клинической картиной ИБС и характером развития патологического процесса. В результате проведенного анализа в группе пробандов нами была выявлена статистически достоверная корреляция между R72P полиморфизмом гена р53 и наличием гипертрофии миокарда левого желудочка у больных ИБС ( = 0.373, р = 0.010).

При попарном сравнении частот аллелей у пробандов с наличием ГЛЖ и без нее было установлено, что у пробандов без гипертрофии ЛЖ достоверно повышена частота аллеля P и соответственно достоверно понижена частота аллеля R по сравнению с пробандами с наличием гипертрофии ЛЖ (² = 5.22; р = 0.03). При сравнении частоты генотипов между двумя группами больных было выявлено, что у пробандов без ГЛЖ наблюдается тенденция к повышению частоты генотипов P/P и R/P по сравнению с больными, имеющими гипертрофию ЛЖ (² = 4.24; р = 0.07). Таким образом, можно сделать вывод о том, что аллель Р, вероятно, является протективным фактором и наличие в генотипе больных ИБС аллеля P (у гомозигот P/P и гетерозигот R/P) приводит к снижению риска развития гипертрофии миокарда левого желудочка у этих больных (ОР = 0.8, ДИ 0.79; 0.81) (таблица 7).

Таким образом, R72P полиморфизм в 4 экзоне гена р53 не влияет на развитие ИБС, ИМ у лиц с отягощенной наследственностью, не оказывает влияния также и на развитие атеросклеротического процесса в коронарных артериях у больных ИБС. Однако он ассоциирован с риском развития гипертрофии миокарда левого желудочка у больных ИБС и может, таким образом, способствовать развитию структурных и функциональных изменений миокарда, получивших название ремоделирования.

Таблица 7. Развитие гипертрофии миокарда левого желудочка у больных с R/R генотипом.

Параметры	ГЛЖ
	наличие	отсутствие
Генотипы P/P и R/P	73%	90,5%
Генотип R/R	27%	9,5%
р	0,07
OР	0,8
ДИ	0,79-0,81
Аллель Р	59%	77%
Аллель R	41%	23%
р	0,034*

Анализ вклада полиморфизма генов-кандидатов ССЗ в развитие ишемической болезни мозга.

В результате проведенного корреляционного анализа в группах пробандов с ишемическим инсультом и их сибсов была выявлена статистически достоверная корреляция между I/D полиморфизмом гена АПФ и развитием ИБС у сибсов ( = -0.299, р = 0.018). При попарном сравнении частот генотипов было выявлено, что у сибсов с ИБС статистически достоверно повышена частота генотипа DD по сравнению с сибсами без заболевания (р = 0,01) (диаграмма 2).

Относительный риск развития ишемической болезни сердца у сибсов с DD генотипом повышен в 12 раз. Таким образом, у лиц с отягощенным по инсульту семейным анамнезом I/D полиморфизм гена АПФ ассоциирован с повышенным риском развития другого ССЗ - ишемической болезни сердца (ОР = 11.98, ДИ 11.03; 12.69).



Диаграмма 2. I/D полиморфизм гена АПФ и развитие ИБС в группе сибсов с отягощенной по инсульту наследственностью.

Изучение влияния генов-регуляторов апоптоза на развитие инфаркта мозга и на тяжесть заболевания у больных с ишемическим атеротромботическим инсультом.

Ассоциация полиморфизма IVS9-675CA в гене HIF-1 с развитием ишемического атеротромботического инсульта.

В результате проведенного сравнительного анализа частоты генотипов и аллелей между группой больных и контрольной группой были установлены статистически достоверные различия в распределении частот генотипов и аллелей по гену HIF-1.

Таблица 8. Сравнительный анализ генотипов и аллелей по IVS9-675CA полиморфизму гена HIF-1 у больных с ишемическим атеротромботическим инсультом и в контрольной выборке.

Варианты генотипов и аллелей	Частота, %	р
	Инсульт	Контроль
HIF-1A (A/A) HIF-1A (C/A) HIF-1A (C/C) HIF-1A (A) HIF-1A (C)	62 38 0 81 19	81 15 4 88,5 11,5	0,0016 0,0016 0,0016 0,043 0,043

Как видно из данных таблицы 8, как в группе больных, так и в контрольной группе с наибольшей частотой встречается генотип A/A, причем в контрольной выборке наблюдается повышение частоты этого генотипа (на 19,1%) по сравнению с больными. Частота аллеля А также больше в контрольной выборке, в то время как частота аллеля С повышена в группе больных. Выявленные различия в распределении частот генотипов и аллелей в обеих группах являются статистически достоверными (р = 0.0016, 0.043). На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что аллель С и генотипы, его содержащие, связаны с повышенным риском развития инсульта в русской популяции. Относительный риск развития инсульта у лиц с генотипами С/C и C/A повышен в 2 раза (ОР = 1.99; ДИ 1.92; 2.03).

Ассоциация полиморфизма в гене PARP1 с клиническим течением ишемического атеротромботического инсульта.

Нами был проведен анализ AG полиморфизма в первом интроне гена PARP1 (полиморфизм rs3219023). В связи с низкой численностью гомозигот по редкому аллелю G гена PARP1 пациенты с генотипами G/G и A/G были объединены в одну группу.

В результате проведенного корреляционного анализа между полиморфизмом rs3219023 и сопутствующими заболеваниями (ИБС и ИМ), а также клиническими характеристиками инсульта нами были выявлены статистически достоверные корреляции анализируемого полиморфизма гена PARP1 с объемом очага ишемического повреждения и с тяжестью состояния больных на разных сроках обследования.

Распределение средних величин объема ишемического очага в зависимости от полиморфных вариантов гена PARP1 на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки от развития инсульта представлено на рис. 1A,B,C,D.

Как видно из представленных данных, у пациентов с генотипом A/A на всех сроках обследования достоверно чаще встречались очаги инфаркта большого объема по сравнению с носителями G/G и A/G генотипов.

На рис. 2A,B,C,D показано распределение средних значений степени тяжести больных с разными генотипами по гену PARP1 на разных сроках обследования. Тяжесть состояния пациентов и степень выраженности у них неврологического дефицита оценивали по шкале Оргогозо: оценка 0 баллов соответствует смерти пациента, 100 баллов - отсутствию неврологического дефекта. Было выявлено, что среди носителей A/A генотипа преобладали пациенты с тяжелым течением инсульта, а у больных с генотипами G/G и A/G наблюдалось заболевание средней степени тяжести.

Таким образом, rs3219023 полиморфизм гена PARP1 ассоциирован с развитием и прогрессированием инсульта у больных - G/G и A/G генотипы являются вариантом более легкого течения заболевания, а A/A генотип связан с развитием тяжелого инсульта.

Ассоциация С/А полиморфизма в 3-фланкирующей области гена белка эфрина В3 с развитием ишемического атеротромботического инсульта.

В результате проведенного корреляционного анализа были выявлены статистически достоверные корреляции С/А полиморфизма гена EFNB3 с объемом очага ишемического повреждения на 1-е и 3-и сутки от начала заболевания и со степенью тяжести инсульта на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки от момента его наступления.

При изучении распределения средних значений объема инфаркта мозга было установлено, что на 3-и сутки от развития заболевания у больных с генотипом С/С достоверно чаще встречались очаги малого объема по сравнению с носителями А/А и С/А генотипов, имеющими очаги большого объема (р = 0,015) (рисунок 3).

Рисунок 1. Зависимость объема инфаркта мозга от rs3219023 полиморфизма гена PARP1 на 1-е (А), 3-и (В), 7-е (С) и 21-е сутки (D) от развития заболевания. 1 - генотип А/А, 2 - генотипы G/G и A/G.

Рисунок 2. Зависимость тяжести состояния пациентов по шкале Оргогозо от rs3219023 полиморфизма гена PARP1 на 1-е (А), 3-и (В), 7-е (С) и 21-е сутки (D) от развития заболевания. 1 - генотип А/А, 2 - генотипы G/G и A/G.

Рисунок 3. Зависимость объема инфаркта мозга от полиморфизма гена EFNB3 на 3-и сутки от развития заболевания.

Нами была проведена оценка тяжести состояния пациентов с разными генотипами по С/А полиморфизму гена EFNB3 по шкале Оргогозо на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки от возникновения инсульта. В результате проведенного анализа было выявлено, что среди носителей гомозиготного генотипа С/С преобладают пациенты средней тяжести, а у больных с А/А и С/А генотипами наблюдается тяжелое течение заболевания (менее 50 баллов по шкале Оргогозо).

Таким образом, С/А полиморфизм 3-фланкирующей области гена EFNB3 ассоциирован с формированием очага ишемического повреждения при инсульте и тяжестью заболевания. А/А и С/А генотипы являются неблагоприятными факторами, так как их носительство способствует развитию обширного очага повреждения при ишемическом инсульте и тяжелой формы заболевания.

Выводы

1. Инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм гена АПФ ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у лиц с отягощенной по ИБС и по инсульту наследственностью. Маркером повышенного риска развития заболевания являются аллель D и генотип DD.

2. Полиморфизмы R219K и R1587K гена АВСА1 ассоциированы с развитием ишемической болезни сердца и ее основных клинических проявлений у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью. Аллель 219К является фактором повышенного риска развития ИБС, стенокардии, артериальной гипертонии и вариантом более тяжелого течения данных заболеваний. Аллель R1587 ассоциирован с повышенным риском развития ИБС, инфаркта миокарда и стенокардии у лиц с отягощенным семейным анамнезом.

3. Полиморфизм -1131Т/С гена АРОА5 у больных ИБС коррелирует с параметрами, характеризующими выраженность атеросклероза в коронарных артериях - индексом стеноза и окклюзией сосудов. Генотипы -1131С/С и -1131Т/С ассоциированы с более высокой степенью поражения венечных артерий.

4. R72P полиморфизм гена р53 ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда левого желудочка (ГЛЖ) у больных ИБС - аллель 72Р является протективным фактором и приводит к снижению риска развития ГЛЖ у больных ИБС. C311S полиморфизм гена PON2 ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда левого желудочка, а также инфаркта миокарда у лиц с отягощенной по ИБС наследственностью - аллель C311 и генотип C311C являются фактором повышенного риска развития данных заболеваний.

5. Полиморфизм IVS9-675CA гена HIF-1A ассоциирован с развитием ишемического атеротромботического инсульта в русской популяции - фактором повышенного риска развития данного заболевания является аллель С и содержащие его генотипы С/С и С/А. Замена AG в первом интроне гена PARP1 (полиморфизм rs3219023) и С/А полиморфизм в 3-фланкирующей области гена EFNB3 (GDB:181497) коррелируют с объемом инфаркта мозга у больных с острым атеротромботическим инсультом и тяжестью их состояния. Генотип А/А по гену PARP1, генотипы А/А и С/А по гену EFNB3 являются вариантом более тяжелого течения инсульта и дальнейшего прогрессирования патологического процесса.

6. M235T полиморфизм гена АТГ, 4a/4b полиморфизм гена eNOS, S19W полиморфизм гена АРОА5, полиморфизм rs189994 гена AIF и полиморфизм rs2906766 гена CASP9 не ассоциированы с развитием ИБС и ИБМ в русской популяции и не оказывают влияния на течение этих сердечно-сосудистых заболеваний у больных из России.

Список опубликованных работ

1. Slominsky P.A., Shadrina M.I., Kondratyeva E.A., Tupitsina T.V., Levitsky G.N., Skvortsova V.I., Limborska S.A. CuZn-superoxide dismutase gene in sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients from Russia: Asp90Ala (D90A) mutation and novel rare рolymorphism IVS3+35 A->C. Hum. Mutat. 2000 Sep;16(3):277-278.

2. V.I. Skvortsova, P.А. Slominsky, L.V. Gubsky, Е.А. Коltsova, I.M. Shetova, I.A. Platonova, Т.V. Тupitsina, A.V. Khrunin, S.А. Limborska. The association of р53 gene BamHI RFLP polymorphism with the volume of brain infarction in patients with carotid atherothrombotic ischemic stroke. Restorative Neurology and Neuroscience. 2004, №2. V.22. P.81-85.

3. Скворцова В.И., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., Тупицына Т.В., Милосердова О.В., Боцина А.Ю., Лимборская С.А. Изучение роли миссенс-мутации (М235Т) в гене ангиотензиногена в развитии ишемической болезни мозга. Мол. Генетика, микробиология и вирусология. 2003. №1. с.52-54.

4. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А., Губский Л.В., Кольцова Е.А., Шетова И.М., Шамалов Н.А., Тупицына Т.В., Платонова И.А. Ассоциация между BamHI RFLP в гене р53 и размер области инфаркта у больных с атеротромботическим ишемическим инсультом. Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2003. Доп. №8. с.24-29.

5. Аронов Д.М., Лимборская С.А., Юферева Ю.М., Сломинский П.А., Тупицына Т.В., Жидко Н.И., Мазаев В.П., Перова Н.И., Жаворонкова Е.А. Анализ вклада инсерционно-делеционного полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента в развитие коронарной болезни сердца. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2004. №5. с.38-44.

6. Аронов Д.М., Лимборская С.А., Юферева Ю.М., Сломинский П.А., Тупицына Т.В., Жидко Н.И., Мазаев В.П., Перова Н.И., Жаворонкова Е.А. Анализ вклада R219K полиморфизма гена АТФ-связывающего кассетного транспортера типа А1 в развитие коронарной болезни сердца. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2004. №5. с.22-26.

7. Т.В. Тупицына, П.А. Сломинский, М.И. Шадрина, И.М. Шетова, В.И. Скворцова, С.А. Лимборская. Ассоциация полиморфизма IVS9-675C>A в гене HIF-1 с развитием острого атеротромботического инсульта в московской популяции. Генетика. 2006. №5, Т.42. С.703-705.

Размещено на Allbest.ru