Разработка и использование адъювантов на основе наночастиц в технологии вакцинных препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Разработка и использование адъювантов на основе наночастиц в технологии вакцинных препаратов

14.04.01 Технология получения лекарств

Иванов Александр Викторович

Пермь - 2013



Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук Николаева Алевтина Максимовна

Научный консультант: доктор биологических наук Красильников Игорь Викторович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Вдовина Галина Петровна ЗАО «Медисорб», г. Пермь

доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Ведущая организация: ГБОУ ВПО СанктПетербургская государственная химикофармацевтическая академия Минздрава России

Защита состоится « 19 » марта 2013 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «__» _____ 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http://www.pfa.ru «__» ______ 2013 г.

Автореферат разослан «___» февраля 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика рассматривается в современных условиях как одно из ведущих массовых эффективных средств борьбы с инфекциями [Бектимиров Т.А., 2001, Селезнева Т.С., 2010, Фельдблюм И.В., 2010]. Стремление создать вакцины из высокоочищенных антигенов, которые в большинстве случаев обладают слабой иммуногенностью, привело к необходимости применения адъювантов, усиливающих иммунный ответ [Медуницын Н.В., 2010, Дыкман Л.А. с соавт., 2010, Manmohan S., 2007].

Разработка эффективных адъювантов - носителей антигенов, обеспечивающих формирование выраженного и длительно сохраняющегося иммунитета, является одной из сложнейших задач в производстве вакцинных препаратов. На стадиях экспериментальных исследований и клинических испытаний находятся вакцины, направленные на профилактику более 60ти видов заболеваний. Поэтому разработка новых адъювантов приобретает особую актуальность в связи с постоянной необходимостью усиливать иммунный ответ на обширное количество новых антигенов, для большинства которых характерна слабая иммуногенность [Медуницын Н.В., 2010, Дыкман Л.А. с соавт., 2010]. Следует указать, что использование адъювантов имеет и экономическую целесообразность, так как вакцины с адъювантами требуют минимального расхода антигена [S.L. Plotkin, 2004].

В настоящее время как самые перспективные адъюванты в мировой и отечественной практике рассматриваются наночастицы: липосомы, виросомы, иммуностимулирующие комплексы, эмульсии (MF59, SAF, Montanide), полимерные наносферы, вирусоподобные частицы и др. [Краснопольский Ю.М. с соавт., 2008, D. Drane et al., 2006, J. Aucouturier et al., 2002]. адъювант липосомный антиген

Липосомы считаются нетоксичными, сами липиды не обладают иммуногенностью, включенные в липосомы вещества не вызывают пирогенные, токсические или аллергические реакции организма. Все эти особенности липосом могут быть весьма эффективно реализованы в вакцинных препаратах [Андреева И.Н., 2004, Швец В.И. с соавт., 2008, Борщевский Г.И. с соавт., 2009].

В МИТХТ им. М.В. Ломоносова профессором А.П. Каплуном с соавт. [2008] разработаны сферические аморфные наночастицы (САНЧ) из смеси тритерпеноидов бересты (СТБ). В модельных экспериментах, выполненных на базе филиала ФГУП "НПО "Микроген" МЗ РФ "Пермское НПО "Биомед" с использованием экспериментальных образцов САНЧ, нами была выявлена их адъювантирующая способность в отношении вакцины против гепатита В.

Учитывая перспективность применения САНЧ в качестве носителя антигенных препаратов, представлялось целесообразным для использования в вакцинных композициях разработать технологию, обеспечивающую получение адъюванта на основе САНЧ, соответствующего требованиям, предъявляемых к препаратам для парентерального введения.

Цель исследования - разработка и использование адъювантов на основе липосомальных структур и сферических аморфных наночастиц в технологии вакцинных препаратов.

Основные задачи исследования:

1. Разработать технологию получения липосомальных композиций с эффективным включением рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В, дифтерийного и столбнячного анатоксинов. Разработать методы контроля технологического процесса и стандартизации липосомальных композиций.

2. Оценить полученные липосомальные вакцинные композиции по физикохимическим и иммунобиологическим свойствам. Изучить адъювантные свойства липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В.

3. Отработать параметры технологического процесса получения адъюванта САНЧ. Разработать методы контроля технологического процесса и стандартизации готового адъюванта. Оценить физикохимические и биологические свойства САНЧ.

4. Получить вакцинные композиции на основе САНЧ и оценить их иммунобиологические свойства.

Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации данные были получены лично автором на базе ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России и в филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России "Пермское НПО "Биомед".

Научная новизна. Впервые по разработанной технологии получены липосомальные формы вакцинных препаратов: лиофилизированный дифтерийностолбнячный анатоксин и жидкая вакцина против гепатита В, отвечающие требованиям к препаратам, вводимым парентерально, по показателям безопасности и эффективности. Установлены критерии и параметры контроля технологического процесса и качества липосомальных форм вакцин: гомогенность липосомальной дисперсии, средний размер, дзетапотенциал, фотометрический показатель дисперсности (ФПД), эффективность включения антигенов в липосомы, стерильность, токсичность, иммуногенность. Получены гомогенные липосомальные дисперсии с эффективностью включения антигенов не менее 75%, со средними размерами частиц 120170 нм, дзетапотенциал которых составлял минус 1215 мВ.

Разработана технология получения САНЧ из СТБ, отвечающих требованиям к адъювантам, используемых при производстве вакцин для парентерального введения. Впервые создан стерильный апирогенный препарат САНЧ. При испытании его в опытах на лабораторных животных показано отсутствие токсических свойств и установлена высокая адъювантирующая способность на примере вакцинных препаратов против гриппа и гепатита В.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическая значимость результатов исследований состоит в расширении знаний об адъювантных свойствах липосомальных структур и САНЧ. Показана возможность получения вакцинных препаратов для парентерального введения с указанными адъювантами. Созданные вакцинные композиции обосновывают перспективность дальнейших исследований по углубленному изучению адъювантных свойств липосомальных структур и САНЧ в отношении различных групп антигенов.

В ходе выполнения данных исследований разработаны:

технология получения липосомальной вакцины против гепатита В (ЛВГВ) и лиофилизированной комбинированной липосомальной дифтерийностолбнячной вакцины (ЛДСМ) для парентерального введения;

технология получения стерильного, апирогенного, нетоксичного лиофилизированного адъюванта на основе нанодисперсии из смеси тритерпеноидов бересты. Составлен проект ФСП «Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная». Установлен адъювантирующий эффект САНЧ на примере вакцин против гриппа и гепатита В. В Пермском и Иркутском филиалах НПО «Микроген» проведены испытания адъюванта САНЧ (акты испытания от 09.11.2012, 23.11.2012). Технология получения липосомальной формы анатоксинных композиций может быть перспективна в плане изучения возможностей ее использования в производстве гетерогенных антитоксических сывороток при подготовке антигенного материала для иммунизации животных.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе ГБОУ ВПО ПГФА на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) (сертификационный цикл «Фармацевтическая технология»). Подготовлен материал к лекционным и практическим занятиям для слушателей интернатуры и ФДПО (акт внедрения от 17.01.2012). Опубликовано учебнометодическое пособие для слушателей ФДПО «Биотехнологические аспекты производства лекарственных средств», Пермь, 2010 г.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2010; Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия», Курск, 2010; Научнопрактической конференции Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2011; Научнопрактической конференции с международным участием, посвященной 75летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации», Пермь, 2011; Х Съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», Москва, 2012; Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности», Казань, 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 стр. машинописного текста, содержит 43 таблицы и 22 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 170 источников, из них 79 отечественных и 91 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения липосомальных композиций с эффективным включением поверхностного антигена вируса гепатита В, дифтерийного и столбнячного анатоксинов.

2. Результаты контроля физикохимических и иммунобиологических свойств липосомальных вакцинных композиций.

3. Технология получения адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц из смеси тритерпеноидов бересты. Методы контроля технологического процесса и стандартизации готового адъювантного препарата САНЧ.

4. Характеристика иммунобиологических свойств вакцинных композиций с использованием в качестве адъюванта САНЧ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава посвящена анализу данных литературы, касающихся характеристики классических адъювантов на основе соединений алюминия и современных адъювантных препаратов, приготовленных с использованием бионанотехнологий. Приведены сведения, обосновывающие необходимость использования адъювантов для создания эффективных высокоиммуногенных вакцинных препаратов. Подробно изложен материал по липосомальным структурам с описанием технологических приемов их получения. Представлены сведения по уникальным наночастицам на основе тритерпеноидов бересты, обладающих высокой биологической активностью.

Во второй главе приведены основные материалы и методы, использованные при проведении экспериментальных исследований. Для получения вакцинных композиций применяли очищенные концентрированные анатоксины: столбнячный (ОКСА) и дифтерийный (ОКДА) (производство филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»), рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) очищенный концентрированный (производство HeberBiotech, Куба), лецитин (производство ЗАО «Биолек», Украина) и смесь тритерпеноидов бересты (производство ООО «Березовый мир», Россия).

В работе при выполнении экспериментов в качестве препаратов сравнения использовали следующие вакцины: АДСМанатоксин анатоксин дифтерийностолбнячный очищенный адсорбированный с уменьшенным содержанием антигенов жидкий (производство филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»); экспериментальная вакцина против гриппа инактивированная расщепленная (производство филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Уфа "НПО "Иммунопрепарат"); вакцина против гепатита В с содержанием геля гидроксида алюминия 0,5 мг/мл (производство филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»).

При разработке технологии получения липосомальных дисперсий использовали в качестве базовых два метода: обращение фаз и дегидратация/регидратация.

Определение степени включения антигенного материла в липосомы проводили с помощью гельхроматографии на ультрогеле АсА 34 (Pharmacia, Швеция) и сефарозе 6В (Pharmacia, Швеция), используя оборудование фирмы «LKB» (Швеция) и «Dоmbifrac» (Россия).

Газожидкостную хроматографию в металлической колонке с сорбентом ХроматонNAW для определения концентрации тетрагидрофурана (ТГФ) в пробах адъюванта на основе САНЧ выполняли на базе судебнохимического отделения Пермского Краевого Бюро судебномедицинской экспертизы. Обработка результатов проводилась с помощью программы «Хроматэк Аналитик» (СКБ Хроматэк, Россия).

Специфическую активность анатоксинов и их липосомальных дисперсий оценивали в реакции коагглютинации (РКОА) с диагностическими реагентами на основе аффинноочищенных антител (экспериментальные серии филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»). Для определения специфической активности HBsAg применяли реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным диагностикумом производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Определение специфической активности антигенов в иммуноферментном анализе проводили с помощью следующих тестсистем: иммуноферментной тестсистемы для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В «ИФАHВsAg» производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород); экспериментальной иммуноферментной тестсистемы для выявления дифтерийного и столбнячного антигенов на основе F(ab)2фрагментов дифтерийных и столбнячных антител, меченных пероксидазой хрена (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»).

Для анализа полученных наночастиц на основе липосомальных структур и САНЧ были использованы фотометрические и спектрофотометрические методы: определение ФПД, индекса окисления фосфолипидов.

Определение средних размеров фосфолипидных частиц методом лазерного корреляционного светорассеяния и определение дзетапотенциала с помощью электрофоретического рассеяния проводили на приборе Zetasizer Nano ZS фирмы Malvern.

Точку эвтектики для липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка (ЛДСМ) и САНЧ при отработке режима лиофилизации определяли методом анализа зависимости электрического сопротивления от температуры.

Лиофилизацию полученных образцов проводили с помощью аппарата для сублимирования ТГ50 (Германия) на базе филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермский НПО «Биомед».

Оценку полученных экспериментальных образцов проводили в соответствии с Европейской Фармакопеей и отечественными нормативными документами по следующим показателям: стерильность, пирогенность, токсичность, иммуногенность. Стерильность и пирогенность определяли по ГФ ХII издания. Токсические свойства ЛДСМ и САНЧ оценивали в экспериментах по изучению острой и хронической токсичности согласно основным положениям РД 4228889 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов». Иммуногенную активность компонентов ЛДСМ вакцины по показателю выживаемости устанавливали по резистентности иммунизированных морских свинок (масса 300±50 г) к дифтерийному тесттоксину и по резистентности иммунизированных белых мышей (масса 17±1 г) к столбнячному тесттоксину. Иммуногенную активность липосомальных вакцин и вакцин на основе САНЧ по индуцированию специфических антител определяли в опытах на морских свинках и белых мышах. Уровень антител в сыворотках иммунизированных животных оценивали с помощью иммуноферментного метода, используя экспериментальные тестсистемы для определения дифтерийных, столбнячных и гриппозных антител, разработанные в филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и коммерческие тестсистемы для определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В производства фирмы «BIORAD» и НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Третья глава посвящена разработке технологии получения липосомальных композиций, отвечающих требованиям к вакцинным препаратам по показателям стерильности, пирогенности, токсичности на модели дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В.

Дизайн проведенных исследований по разработке технологии получения липосомальных вакцинных композиций представлен в таблице 1.

Первоначально в исследованиях при оценке качества лецитина исходного сырья для конструирования липосомальных вакцин, по показателю пирогенности и индекса окисления, который характеризует стабильность липидных мембран, нами было показано, что липидная субстанция по показателю пирогенности соответствует фармакопейным требованиям к парентеральным препаратам и по индексу окисления (0,160±0,003) соответствует нормам, предъявляемым к фосфолипидам при получении липосомальных лекарственных форм.

Таблица 1. Дизайн исследования по разработке технологии получения липосомальных вакцинных композиций

Этапы исследования	Исследуемый показатель
1. Оценка качества исходного сырья	Пирогенность; индекс окисления фосфолипидов
2. Выбор метода получения липосомальной вакцины	Термостабильность антигенов; влияние органических растворителей на антигены; специфическая активность антигенов
3. Отработка режимов ультразвуковой обработки	Специфическая активность антигенов; средний размер липосом; фотометрический показатель дисперсности
4. Характеристика липосомальных дисперсий	Степень включения антигенов; дзета-потенциал; средний размер; гомогенность системы; стерильность; специфическая активность
5. Стабилизация липосомального дифтерийно-столбнячного анатоксина	Эвтектическая точка; подбор концентрации криопротектора; специфическая активность антигенов
6. Изучение иммунобиологических свойств	Пирогенность; токсичность; иммуногенность

При создании липосомальных вакцин следует учитывать физико-химические свойства каждого отдельного антигена, чтобы избежать снижения эффективности препарата. Различия в термостабильности антигенов определяют особенности конструирования липосомальных вакцин. Для обоснования выбора метода получения липосомальной композиции мы проводили исследования по определению устойчивости к повышенной температуре антигенного материала. В модельных опытах антигены прогревали при различных температурах в течение 2 часов в соответствии с длительностью термообработки при использовании метода обращения фаз (табл. 2).



Таблица 2. Оценка сохранения специфической активности в образцах исследуемых антигенов после термообработки методом ИФА

Температура, 0С	Специфическая активность после термообработки,% сохранения активности
	дифтерийный компонент	столбнячный компонент	гепатитный компонент
45	100	60	100
65	50	0	100
80	0	0	30

Из представленных данных видно, что наиболее стабильным оказался гепатитный антиген, анатоксинные компоненты менее устойчивы к воздействию повышенных температур. Столбнячный анатоксин в течение 2-х часовой обработки при 450С терял 40 % своей активности. Поэтому при отработке способа получения ЛДС-М вакцины за основу был выбран метод дегидратации/регидратации. В свою очередь, HBsAg вплоть до температуры 80 0С сохранял свою активность.

На основании результатов этих опытов для изготовления липосомальной вакцины против гепатита В нами испытаны 2 метода получения: дегидратации/регидратации и метод обращения фаз (табл. 3).

Таблица 3. Результаты ИФА по определению специфической активности липосомальной вакцины против гепатита В

№ опыта	Метод получения
	дегидратации/регидратация	обращения фаз
	HBsAg, мкг/мл	HBsAg, мкг/мл
1	19,50	-
2	19,60	-
3	21,00	-
M±m	20,03±0,48	-

Несмотря на высокую термоустойчивость гепатитного компонента, его исходная специфическая активность не сохранялась при использовании метода выпаривания с обращением фаз за счет денатурирующего действия органических растворителей на антигенный белок. В связи с этим для получения липосомальной вакцины против гепатита В был выбран метод дегидратации/регидратации.

Отрабатывая начальные технологические стадии получения липосомальных композиций, мы выбрали оптимальное соотношение лецитина и антигенных компонентов (дифтерийно-столбнячный анатоксин / лецитин - 1:1, поверхностный антиген вируса гепатита В / лецитин 1:1), и в качестве раствора для регидратации липидной пленки - 0,01 М трис-HCl буфер, рН 7,0-7,2.

В технологии получения липосомальных препаратов ультразвуковая обработка является одним из основных приемов для гомогенизации дисперсий.

В связи с этим в следующей серии экспериментов для гомогенизации полученных мультиламеллярных липосомальных дисперсий дифтерийно-столбнячной вакцины отрабатывали оптимальный режим ультразвуковой обработки (УЗ) (табл.4).

Из приведенных в таблице данных видно, что при увеличении длительности УЗ обработки показатели оптической плотности снижались, значения ФПД увеличивались, что соответствовало уменьшению размера частиц. Оптимальная продолжительность УЗ обработки составила 25-30 минут. После 25 минутной обработки дисперсии обладали хорошей смачивающей способностью, имели голубоватый оттенок.

Таблица 4. Отработка режимов ультразвуковой обработки липосомальных дисперсий дифтерийно-столбнячной вакцины

Характеристика	Время обработки (мин)
	0*	5	10	15	20	25	30
Оптическая плотность при 400 нм	?	1,200	0,375	0,160	0,080	0,050	0,045
Оптическая плотность при 540 нм	1,750	0,800	0,220	0,082	0,042	0,025	0,020
ФПД	-	1,354	1,777	1,992	2,147	2,310	2,702
Средний размер частиц, нм	1442,0	241,4	167,8	160,2	133,6	125,6	118,9



Отработанные условия УЗ обработки позволили получить липосомальные вакцинные композиции, визуально отвечающие критериям истинных липосомальных дисперсий.

В результате действия ультразвука в процессе приготовления липосомальных дисперсий возможно снижение активности инкапсулируемого материала. Поэтому далее определяли уровень специфической активности липосомальной комбинированной вакцины ЛДС-М и моновакцины против гепатита В в тесте ИФА. В качестве контрольных препаратов использованы исходные очищенные дифтерийный и столбнячный анатоксины, а также HBsAg. Полученные результаты иммуноферментного анализа представлены в таблице 5.

Таблица 5. Оценка специфической активности липосомальных вакцин после УЗ обработки

№ Опыта	ЛДС-М	ЛВГВ	Контрольные препараты
	столбнячный компонент, Lf/мл	дифтерийный компонент, Lf/мл	HBsAg, мкг/мл	ОКСА, Lf/мл	ОКДА, Lf/мл	HBsAg, мкг/мл
1	9,03	10,30	19,70	10,80	8,95	18,64
2	10,67	9,10	20,04	10,70	10,90	19,85
3	9,63	10,10	19,95	11,05	10,50	20,65
4	8,77	10,60	20,11	9,15	9,34	19,60
M±m	9,53±0,42*	10,03±0,37*	19,95±0,09*	10,43±0,42	9,92±0,46	19,69±0,41

Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контрольным препаратом

Таким образом, проведенные исследования показали, что ультразвуковая обработка не снижает специфическую активность испытуемых липосомальных вакцин и, следовательно, может быть включена в технологию получения липосомальных препаратов на основе дифтерийно-столбнячного анатоксинов и HBsAg. При выбранном режиме ультразвукой обработки в течение 25-30 минут образовывались липосомальные дисперсии, способные проходить через стерилизующие мембраны, что позволило проводить стерилизацию на конечном этапе производства, используя мембранную технологию.

Доказательством включения смеси анатоксинов и HBsAg в липосомы явились результаты гельхроматографии липосомальных дисперсий. Было установлено, что эффективность включения для дифтерийного анатоксина - 94,43 %, столбнячного - 96.98 %, гепатитного компонента - 76,90 %.

Важное значение для характеристики липосомальных вакцин имеют следующие показатели: средний размер, индекс полидисперсности и дзета-потенциал. Индекс полидисперсности характеризует гетерогенность системы, которая может колебаться от 0 (100% гомогенность) до 1,0 (100% гетерогенность). Дзета-потенциал - величина, отражающая взаимное влияние друг на друга дисперсной среды и диспергированной частицы, является важным индикатором поверхностного заряда частиц. Этот показатель может быть использован для прогнозирования и контроля устойчивости коллоидных суспензий или эмульсий (табл. 6).

Таблица 6 Характеристика липосомальных вакцинных препаратов

Образец	Средний размер, нм	Дзета-потенциал, мВ	Индекс полидисперсности
ЛДС-М	142,1	-3,90	0,277
ЛВГВ	125,8	-14,60	0,243

Из приведенных данных видно, что средние размеры липидных частиц и их способность включать антигены позволяют охарактеризовать полученные нами структуры как липосомы. Дзета-потенциал липосомальной вакцины против гепатита В имеет высокое значение, что свидетельствует о стабильности этой композиции. Вместе с тем дзета-потенциал ЛДС-М вакцины составил минус 3,90 мВ. По данным литературы [Heurtault B., 2003], такое значение дзета-потенциала свидетельствует о недостаточной стабильности полученной липосомальной дисперсии. В связи с этим были проведены эксперименты по стабилизации липосомальных дисперсий с помощью лиофилизации. Отработку процесса высушивания проводили с учетом его влияния на физические свойства и специфическую активность липосомальной вакцины. В результате был отработан следующий режим лиофилизации: замораживание препарата ниже температуры (-35 0С) и выдерживание при этой температуре не менее 4 часов; проведение стадии лиофилизации при температуре препарата (-35 0С) в течение 15 часов; досушивание препарата при плюсовых температурах продолжительностью 15 часов.

В качестве защитной среды использовали наиболее доступный углевод - сахарозу, которую добавляли в различных концентрациях (2, 4, 6, 8 %). Было установлено, что при использовании концентраций сахарозы от 2 до 6 % препарат обладал высокой гигроскопичностью, что приводило к плавлению массы и снижению активности дифтерийного и столбнячного компонентов. Использование сахарозы в концентрации 8 % обеспечивало образование плотной пористой массы и сохранение специфической активности антигенов на исходном уровне. При этом были получены липосомы стандартного состава, основная масса которых состояла из частиц размером 150-170 нм. Установлено, что разработанный режим сублимации и выбранная концентрация криопротектора (8 %) обеспечивают остаточную влажность основной массы ЛДС-М вакцины в диапазоне (3,5±0,5) % и её стабильность в течение 12 месяцев (максимальный срок наблюдения).

Таблица 7. Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины

Срок хранения	pH	Характеристика ЛДС-М вакцины
		Средний размер липосом, нм	Специфическая активность, Lf/мл
			дифтерийный компонент	столбнячный компонент
1 мес.	6,95	152,0	10	10
6 мес.	7,05	158,2	10	10
12 мес.	7,00	166,7	10	10



После определения основных технологических параметров получения лиофилизированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины и липосомальной вакцины против гепатита В представлялось целесообразным изучить качественные характеристики полученных препаратов, из которых основной является иммуногенность. Результаты испытания иммуногенных свойств по протективной активности ЛДС-М вакцины представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты изучения протективной активности ЛДС-М вакцины в опытах на животных

Столбнячный компонент	Препарат	Доза введенного токсина	Количество животных	Выживаемость, %
			иммунизированных	выживших
	ЛДС-М вакцина	50 DLM	11	11	100
	АДС-М анатоксин*	50 DLM	11	11	100
	Контроль столбнячного токсина	1 DLM	4	0	0
Дифтерийный компонент	ЛДС-М вакцина	100 DLM	4	4	100
	АДС-М анатоксин*	100 DLM	4	4	100
	Контроль дифтерийного токсина	1 DLM	3	0	0

Примечание: *- препарат сравнения

Из данных таблицы видно, что разработанный липосомальный препарат обеспечивает резистентность иммунизированных морских свинок и белых мышей к дифтерийному и столбнячному токсину. Показатель выживаемости в обеих группах животных составил 100 % при регламентированных требованиях к АДС-М вакцине: 100 % для дифтерийного компонента и не менее 70 % для столбнячного компонента.

Дополнительные испытания липосомального препарата в опытах на морских свинках показали, что группы животных, в которых использовался ЛДС-М, имели уровень антител, сопоставимый с уровнем индуцируемым АДС-М анатоксином, адсорбированном на геле гидроксида алюминия (табл. 9).

Таблица 9 Результаты изучения иммуногенных свойств липосомальной ЛДС-М вакцины в опытах на морских свинках

Препарат	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
	дифтерийный компонент	столбнячный компонент
ЛДС-М вакцина	3213,33** [881,97-8090,22]	3341,93** [316,48-6569,70]
АДС-М анатоксин, адсорбированный на геле гидроксида алюминия*	3302,72 [746,92-14604,05]	3441,33 [1164,04-10173,86]

Примечание: * - контроль; ** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Результаты испытания иммуногенных свойств ЛВГВ вакцины приведены в таблице 10.

Таблица 10. Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины против гепатита В с адъювантами различной природы

Препарат	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
	I иммунизация	II иммунизация
ЛВГВ	15,04** [9,70-23,31]	5571,42**[3681,34-8431,89]
Вакцина против гепатита В с гелем гидроксида алюминия*	15,88* [12,12-20,81]	6345,05* [3581,92-11239,70]

Примечание: *- контроль; ** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Из представленных данных видно, что после первой и второй иммунизации средняя геометрическая титра анти-HBs в опытной и контрольной группе животных не отличались. Полученные результаты демонстрируют высокие иммуногенные свойства ЛВГВ, сопоставимые с вакциной против гепатита В, адсорбированной на геле гидроксида алюминия.

Разработанные формы липосомальных вакцин не обладали пирогенными свойствами и по показателям стерильности, токсичности, иммуногенности полностью соответствовали требованиям, предъявляемым к коммерческим вакцинным препаратам. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность липосомальных вакцинных препаратов. На основании полученных данных можно сделать вывод о перспективности использования липосом в качестве адъювантов вакцин.

По результатам проведенных исследований были разработаны технологии получения липосомальных форм вакцинных препаратов, схемы которых представлены на рисунках 1, 2.

Рис. 1. Схема технологии получения лиофилизированной ЛДС-М вакцины



Рис. 2. Схема технологии получения жидкой ЛВГВ вакцины

На начальных технологических стадиях производства липосомальных вакцин проводят упаривание спиртового раствора липидов на роторном испарителе до полного удаления спирта и образования тонкой липидной пленки на стенках колбы при давлении -90 Па в течение 1,5-2 часов. Далее липидную пленку гидратируют в трис-буфере, содержащем антиген, при температуре 41-43 0С. Таким образом получают дисперсию мультиламеллярных везикул с включенным антигеном. На следующей технологической стадии проводят гомогенизацию ультразвуком в течение 30 минут при 35 kHz и температуре 41-43 0С. Для стандартизации технологического процесса получения липосом на данной стадии необходимо контролировать оптическую плотность полуфабриката при двух длинах волн 540 нм и 400 нм, средний размер частиц, ФПД, а также специфическую активность. Оптическая плотность и размер липосом после ультразвуковой обработки должны уменьшаться, а специфическая активность антигенов должна оставаться на исходном уровне. На последующих стадиях проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и контролируют стерильность. Для стабилизации липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка предусмотрена стадия лиофилизации. ЛВГВ стабильна в жидком виде, ее лиофилизации не подвергают. В течение срока наблюдения (12 месяцев) вакцина оставалась гомогенной, не имела признаков расслоения. Соблюдение всех отработанных параметров технологического процесса гарантирует получение стандартного препарата.

В четвертой главе изложены результаты по разработке технологического процесса получения адъюванта САНЧ из СТБ, соответствующего требованиям к вакцинным препаратам для парентерального введения, по отработке методов контроля технологического процесса и стандартизации готового адъювантного препарата САНЧ, а также представлены данные по изучению иммунобиологических свойств САНЧ.

Дизайн проведенных исследований по разработке технологии получения САНЧ представлен в таблице 11.

Таблица 11. Дизайн исследования по разработке технологии получения САНЧ

Этап исследования	Исследуемый показатель
1. Отработка метода стерилизации	Гомогенность дисперсий; оценка сорбционной способности мембран
2. Отработка метода очистки дисперсий САНЧ	Фотометрический показатель дисперсности; концентрация СТБ и ТГФ; стерильность
3. Отработка метода лиофилизации	Эвтектическая точка; концентрация СТБ и ТГФ; стерильность; фотометрический показатель дисперсности
4. Контроль готового препарата	Дзета-потенциал; средний размер частиц; содержание основного вещества; остаточное количество ТГФ; рН; стерильность; пирогенность; токсичность; сорбционные свойства САНЧ; потеря в массе при высушивании

При разработке новых адъювантов и при внедрении их в медицинскую практику следует тщательно изучить все стороны их действия, учитывая требования по стерильности, пирогенности, токсичности. Выполняя этот раздел исследований, первоначально мы считали необходимым выбрать оптимальный метод стерилизации САНЧ, который можно было бы применить на заключительной технологической стадии производства. Для получения стерильного адъюванта оценивалась возможность использования термических и мембранных методов стерилизации. При отработке методов мембранной технологии для стерилизации было установлено, что на поверхности фильтров из нейлона, полиэфирсульфона, ацетатацеллюлозы происходит сорбция САНЧ. Термическая обработка, нарушая структуру аморфных наночастиц, вызывала их агрегацию. Таким образом, стерилизация САНЧ мембранными и термическими методами на конечных этапах производства невозможна. С целью получения адъюванта, отвечающего требованиям к препаратам для парентерального введения, мы отработали технологию, в которой все исходные растворы должны стерилизоваться на начальных этапах производства САНЧ, и весь дальнейший технологический процесс должен проходить в стерильных условиях.

Поэтому мы предложили мембранную технологию стерилизации исходной смеси СТБ/ТГФ с помощью фильтроэлемента с модифицированным поверхностным зарядом, который обладал низкой сорбционной способностью в отношении СТБ и устойчивостью к ТГФ.

Основной стадией получения САНЧ является осаждение частиц при смешивании со стерильным буферным раствором. В результате последующей обработки ультразвуком в течение 5 минут образовывались гомогенные дисперсии САНЧ.

На следующем этапе наших исследований отрабатывали метод очистки дисперсии САНЧ. С целью удаления токсичного ТГФ применяли ультрафильтрацию на полых волокнах с номинальной отсекающей молекулярной массой 300 кДа в режиме ультрадиафильтрации. Для определения оптимальных условий ультрафильтрации была отработана система контроля процесса по следующим параметрам: ФПД, концентрации смеси тритерпеноидов бересты и ТГФ.

Лиофилизацию САНЧ проводили с учетом значения зоны эвтектической температуры по режиму сублимации, отработанному для липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка. В результате проведенных исследований была разработана технология получения САНЧ, схема которой представлена на рисунке 3.

Контроль готового препарата осуществляли по следующим показателям: описание, подлинность, количественное определение СТБ, остаточное количество ТГФ, pH, показатель дисперсности, потеря в массе при высушивании, стерильность, токсичность, пирогенность.

Рис. 3. Схема технологии получения САНЧ

Важными характеристиками наночастиц при отработке технологии получения САНЧ являются их средний размер и дзета-потенциал. В следующей серии экспериментов нами были определены данные показатели: дзета-потенциал составил минус 44,3 мВ, средний размер частиц - 160-180 нм. Остаточное количество ТГФ в готовом препарате определяли методом ГЖХ. Анализ полученных результатов показал, что отработанный метод ультрафильтрации обеспечивает эффективное удаление ТГФ, его концентрация в препарате составила 0,176±0,009 мг/мл. Последующая стадия лиофилизации способствовала снижению остаточной концентрации ТГФ до 0,122±0,004 мг/мл, т.е. почти на 30 %. Следует отметить, что по данным ГФ XII издания, предельно допустимое количество тетрагидрофурана, принимаемое в составе суточной дозы в лекарственных средствах, не должно превышать 7,2 мг/мл, что в 2360 раз меньше, чем при введении 25 мкг САНЧ (предполагаемое содержание в одной дозе вакцинного препарата).

Токсические свойства препарата оценивали в опытах по определению острой и хронической токсичности. Для изучения острой токсичности белым мышам вводили препарат внутрибрюшинно однократно в дозе 0,5 мл (25 мкг САНЧ) на мышь (что соответствует 2994 человеческим дозам), морским свинкам (массой 300-350 г) - подкожно в дозе 5,0 мл (250 мкг САНЧ) на морскую свинку (что соответствует 1851 человеческой дозе). При изучении хронической токсичности белым мышам вводили САНЧ в концентрации 50 мкг/мл в дозе по 0,5 мл (25 мкг САНЧ) внутрибрюшинно трехкратно (1, 4, 9 сутки) в суммарной дозе 1,5 мл на мышь (что соответствует 8982 человеческим дозам). Животным группы сравнения водили 0,9 % раствор натрия хлорида по аналогичным схемам.

Результаты наблюдения показали, что однократное и многократное введение препарата не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела (табл. 12, 13), изменениям волосяного покрова, некробиотическим изменениям на месте введения.

Таблица 12. Динамика изменения массы животных после однократного введения препарата

Исследуемый препарат	Вид животных	Исходная масса животных, г	Массы животных на 1 сут, г	Массы животных на 8 сут, г*
САНЧ	Белые мыши	18,24±0,14	18,58±0,184	21,48±1,24
	Морские свинки	317,50±2,10	320,50±1,90	367,00±3,50
NaCl 0,9% (контроль)	Белые мыши	18,09±0,16	18,30±0,14	22,20±0,98
	Морские свинки	324,10±2,39	327,50±2,03	372,10±4,15



Таблица 13. Динамика изменения массы белых мышей после многократного введения препарата

Исследуемый Препарат	Исходная масса животных, г	Массы животных на 1 сут, г	Массы животных на 22 сут, г*
САНЧ	18,46±0,18	18,78±0,60	27,80±2,89
NaCl 0,9% (контроль)	18,60±0,46	18,68±0,62	27,63±2,80

Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контролем

Через 24 ч и 13 суток после последней инъекции при оценке хронической токсичности в группе сравнения и опытной группе внутренние органы животных имели все характерные признаки, расположение и строение. Оболочки, выстилающие внутренние полости влажные, серовато-розового цвета, без признаков воспаления.

Таким образом, при изучении острой и хронической токсичности было установлено, что адъювант САНЧ не вызывает симптомов интоксикации, не обладает токсическим действием на системы и органы лабораторных животных, не способствует развитию патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических изменений.

При отработке технологии получения САНЧ определяли их сорбционную способность. В результате было установлено, что САНЧ в концентрации 50 мкг/мл эффективно связывает поверхностный антиген вируса гепатита В (табл. 14).

Таблица 14. Определение сорбционной способности САНЧ

Концентрация САНЧ, мкг/мл	Эффективность включения антигенов, %
	дифтерийный анатоксин	столбнячный анатоксин	HBsAg
50	3,59	5,84	96,56
100	1,24	1,34	97,85
200	9,91	3,11	98,92
400	13,56	14,73	99,47
500	29,35	20,98	99,39



В тоже время, как видно из данных таблицы 14, даже при концентрации САНЧ 500 мкг/мл эффективность связывания по отношению к дифтерийному и столбнячному анатоксину составляет менее 30 %. Поэтому в последующих сериях экспериментов по конструированию вакцинных композиций с использованием адъюванта САНЧ мы применяли поверхностный антиген вируса гепатита В и экспериментальную Split-вакцину против вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2).

Результаты по оценке иммуногенных свойств приготовленных вакцинных композиций с использованием HBsAg представлены в таблице 15.

Таблица 15. Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины против гепатита В с адъювантами различной природы в опытах на морских свинках

Вакцинные композиции (суммарная доза на одно животное)	Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
	I иммунизация	II иммунизация
20 мкг HBsAg+50 мкг САНЧ	40,02* [17,53-91,35]	1276,63** [830,24-1963,03]
20 мкг HBsAg+500 мкг САНЧ	44,92* [15,40-130,96]	1192,26** [681,91-2084,57]
Контроль коммерческая вакцина против гепатита В (20 мкг HBsAg+500 мкг Al(OH)3)	22,81 [10,94-47,52]	586,69 [401,97-856,30]

Примечание: * - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем; ** - различия средних величин существенны по сравнению с контролем

Из приведенных данных видно, что после первой иммунизации средняя геометрическая титра специфических антител в исследуемых группах животных практически не отличались. После второй иммунизации в группах животных, в которых использовался адъювант САНЧ, наблюдался достоверно более высокий уровень анти-НВs, чем в группе животных, иммунизированных коммерческой вакциной. При этом следует отметить, что снижение концентрации САНЧ в 10 раз не оказывало влияния на иммуногенные свойства вакцины против гепатита В. Различия величин СГТ сравниваемых групп не существенны. Таким образом, было показано, что адъювантирующие свойства САНЧ проявляются в концентрациях значительно меньших, чем широко используемый в качестве адъюванта гель гидроксида алюминия, обеспечивая высокую иммуногенность вакцины против гепатита В.

Данные по изучению иммуногенности вакцинных композиций с САНЧ против вируса гриппа приведены в таблице 16.

Таблица 16. Иммуногенные свойства вакцины против гриппа с адъювантом САНЧ

Вакцинные композиции	Количество гемагглютинина (ГА) на одно животное, мкг	Среднее геометрическое значение оптической плотности
1,5 мкг ГА + 25 мкг САНЧ	1,5	1,015[0,877-1,173]**
1,5 мкг ГА + 250 мкг САНЧ	1,5	0,791[0,596-1,051]**
1,5 мкг ГА + 500 мкг САНЧ	1,5	0,676[0,546-0,836]***
1.5 мкг ГА*	1,5	0,551[0,429-0,708]

Примечание: *- контроль (несорбированный гемагглютинин); ** - различия средних величин существенны по сравнению с контролем; *** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Представленные результаты ИФА показали, что САНЧ проявлял выраженные адъювантирующие свойства. Из препаратов с адъювантами максимальный уровень антител у животных обеспечила вакцинная композиция с низкой дозой САНЧ.

Таким образом, разработанная нами технология позволяет получать адъювант САНЧ стерильным и апирогенным с высокими адъювантирующими свойствами, которые могут быть использованы для конструирования высокоиммуногенных вакцинных препаратов.

По результатам проведенных исследований составлен проект Фармакопейной статьи предприятия на адъювант «Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная» в соответствии с требованиями ОСТа 91400.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения". Проект ФСП предусматривает контроль препарата по следующим показателям: описание, подлинность по кофеату бетулина, количественное определение, фотометрический показатель дисперсности, pH, потеря в массе при высушивании, остаточное количество тетрагидрофурана, пирогенность, токсичность, стерильность. Срок годности исследуется (табл. 17).

Таблица 17. Спецификация. Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная

Показатели	Методы	Нормы
Описание	Визуальный	Плотная пористая масса белого или желтовато-белого цвета. При добавлении к содержимому флакона 25 мл раствора воды для инъекций и интенсивном встряхивании в течение 1 мин должна образовываться дисперсия белого или желтовато-белого цвета.
Подлинность	Спектрофотометриче-ский	Ультрафиолетовый спектр поглощения раствора субстанции (по кофеату бетулина) в области от 220 до 350 нм должен иметь максимум при 320 ±2 нм.
Содержание тритерпеноидов бересты	Спектрофотометрический	0,95 - 1,05 мг/мл
Фотометрический показатель дисперсности	Фотоэлектроколориметрический	От 2,0 до 2,6
рН	ГФ ХII, Т.1, С.89, потенциометрически	От 8,5 до 9,3
Остаточное количество тетрагидрофурана	ГЖХ	Не более 0,2 мг/мл
Потеря в массе при высушивании	ГФ ХI, Т. 1, С.176	Не более 5,0 %
Стерильность	Метод прямого посева, ГФ ХII, Т. 1, С.150	Дисперсия должна быть стерильна
Токсичность	Биологический, ГФ ХII, Т. 1, С.124	Дисперсия должна быть нетоксична
Пирогенность	Биологический, ГФ ХII, Т. 1, С.125	Дисперсия должна быть апирогенна
Упаковка		Во флаконы вместимостью 100 мл, укупоренные пробками из резины и завальцованные колпачками алюминиевыми.
Хранение		В соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 0С.
Срок годности		Срок наблюдения 12 месяцев

В экспериментально-производственных условиях была приготовлена серия адъюванта САНЧ, которая прошла испытания с положительными результатами в филиалах ФГУП НПО «Микроген» в г. Пермь и в г. Иркутск.



ВЫВОДЫ

1. С использованием метода дегидратации/регидратации и последующей ультразвуковой обработки разработана технология получения лиофилизированной комбинированной липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка и жидкой липосомальной моновакцины против гепатита В со средним размером частиц 120170 нм и эффективностью включения антигенов не менее 75 %. Отработана система контроля технологического процесса и готового препарата.

2. Липосомальные вакцины, полученные по разработанной технологии, по показателям специфической активности, пирогенности, стерильности, токсичности полностью отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам. В опытах in vivo установлен выраженный адъювантирующий эффект липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В. Липосомальная дифтерийностолбнячная вакцина и липосомальная вакцина против гепатита В в опытах на животных проявили иммуногенные свойства, сопоставимые с аналогичными адсорбированными на геле гидроксида алюминия коммерческими вакцинами.

3. Разработана технология получения адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц из смеси тритерпеноидов бересты. Отработаны методы контроля технологического процесса получения САНЧ и готового адъювантного препарата. Разработанная технология обеспечивает получение стерильного, апирогенного, нетоксичного адъюванта со средним размером частиц 160180 нм, дзетапотенциалом минус 44,3 мВ. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на САНЧ.

4. Получены вакцины на основе расщепленного вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2) и рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В с использованием в качестве адъюванта САНЧ. В опытах на животных установлено, что экспериментальные вакцинные препараты по иммуногенности превосходили базовые вакцины и по показателям стерильности, пирогенности, токсичности полностью отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов, А. В. Экспериментальные подходы к получению липосомальной формы коклюшной вакцины // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство : сб. материалов конгр. : тез. докл., Москва, 12-16 апр. 2010 г. - Москва, 2010. - С. 623-624.

2. Иванов, А. В. Технологические подходы к созданию липосомальных форм вакцинных препаратов // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. тр. III Всерос. науч.практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75летию Курского гос. мед. унта. - Курск. 2010. - С. 63-65.

3. Изучение возможности использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта вакцинных препаратов / И. В. Красильников, А. В. Иванов, А. М. Николаева, В. В. Машин // Сиб. мед. журн. - 2011. - Т. 26, № 2. - С. 65-67.

4. Вахтин, Р. А. Выбор оптимального режима ультразвуковой обработки липосомальной дисперсии АДС анатоксина / Р. А. Вахтин, А. В. Иванов // Вестн. Перм. гос. фармац. акад. - 2011 - № 8 - С. 204 - 206.

5. Иванов, А. В. Опыт использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта // Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации : материалы науч.практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75летию ПГФА, Пермь, 7-9 дек. 2011 г. - Пермь, 2011. - С. 77-80.

6. Иванов, А. В. Получение липосомальной вакцины против гепатита В / А. В. Иванов, А. М. Николаева // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2, № 1-2. - С. 443.

7. Иванов, А. В. Разработка технологии получения адъюванта для парентерального введения на основе экстракта бересты // Биоматериалы и нанобиоматериалы : актуальные проблемы и вопросы безопасности : тез. докл. Всерос. молодежной науч. школы, Казань, 18-22 июня 2012 г. - Казань, 2012. - С. 54.

8. Иванов, А. В. Липосомы как адъюванты комбинированных вакцин / А. В. Иванов, А. М. Николаева, И. В. Красильников // Перм. мед. журн. - 2012. - Т. 29, № 4. - С. 110-115.

Размещено на Allbest.ru