Иммунологические показатели больных единичным и множественным базально-клеточным раком кожи, ассоциированным с вирусом папилломы человека

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) - одна из самых многочисленных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Этиология и патогенез ЭОК изучены недостаточно [Малишевская Н.П., 2002; Молочков В.А., 2005]. В последние годы благодаря достижениям в области молекулярной биологии предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в возникновении и развитии отдельных вариантов ЭОК [Кладова А. Ю., 2007; Shamanin V.et al., 1996; Berkhout R. et al., 2000; Harwood A. et al., 2000; Weissenbom S. et al., 2005; de Villiers E., 2004]. В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папилломы, инфицирующих эпителий слизистых оболочек (род alpha) и кожи (род beta, gamma, mu и nu). Частота выявления ВПЧ рода beta в различных ЭОК существенно варьирует [Shamanin V. et al., 1996; Harwood C. et al., 2000; Forslund O. et al., 2003; Iftner A. et al., 2003]. Это обусловлено разнообразием используемых лабораторных методов: менее чувствительные методы способны обнаруживать вирус при его высокой концентрации, более чувствительные -- единичные копии вируса в пробе [Meyer T. et al., 2000]. Предполагается, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь у жителей Восточной Европы, Центральной Европы и Америки [zur Hausen P. et al., 2005]. Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют cчитать, что формирование кератоакантомы, себорейного кератоза, актинического кератоза, болезни Боуэна, базально-клеточного и плоскоклеточного рака кожи обусловлено кожными типами ВПЧ рода beta [Ключаева С. В., 2003].

Базально-клеточный рак кожи (синонимы: базалиома, базальноклеточная эпителиома, карциноид кожи, опухоль из базального слоя эпителия кожи) - опухоль, которая согласно МКБ-10, относится к злокачественным новообразованиям кожи и шифруется С44. Базально-клеточный рак кожи (БКРК) - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль кожи. Она обладает медленным деструирующим ростом, может рецидивировать и, как правило, не метастазирует. Встречается с одинаковой частотой у лиц обоего пола, преимущественно в пожилом возрасте. Локализуется на открытых участках кожи, чаще на лице, бывает множественной [Журавель В.Г., 1996; Курдина М.И., 1999; Дубенский В.В., Гармонов А.А., 2004; Молочков В.А. и соавт., 2004; Greinert R. et al., 2003; Zeitouni N.C. et al., 2003]. Несмотря на то, что базально-клеточный рак кожи в структуре онкологической смертности составляет менее процента, опухоль привлекает внимание медицинской общественности как высокой заболеваемостью, так и высокими темпами роста во всем мире, превышающими темпы роста других злокачественных новообразований [Кулагин В.И. и соавт., 2001; Сангинов Д.Р., 2002; Конопацкова О.М., Гречишникова Т.В., 2004; Писклакова Т.П., 2004]. По статистическим данным на 2010 год рак кожи занимает II место в структуре онкологической заболеваемости населения России и на его долю приходится 9,3 % у мужчин и 13,3 % у женщин [Васильев Ю.С., И.Р.Ахметов И.Р., 2010]. В Челябинской области заболеваемость раком кожи превышает общероссийские показатели: в 2000 году она составляла 49,1 на 100000 населения; в 2010 году достигла 56,5 на 100000 населения (мужчин 42,9 %; женщин - 68,12 %). Смертность от рака кожи составляет в России 0,7 на 100000 населения, в Челябинской области -- 0,36 на 100000 населения.

Число работ, характеризующих иммунологический статус больных с базалиомой, ограничено. Результаты исследований противоречивы, так как получены в разных странах и этнических группах [Горячкина Л.А., Кашкин К.П., 2009]. Вместе с тем, исследования в данном направлении представляют значительный интерес с точки зрения оптимизации профилактики, диспансеризации и лечения БКРК [Сергеев Ю.В. и соавт., 1999; Снарская Е.С., 2004; Галил-Оглы Г.А. и соавт., 2005; Молочков В.А. и соавт., 2006; Kaplan B. et al., 2000; Arlette J. et al., 2004].

Цель работы:

Изучение иммунного статуса больных с единичным и множественным базально-клеточным раком кожи, ассоциированным с папилломавирусной инфекцией.

Задачи исследования:

1. Выявить частоту встречаемости, спектр генотипов и вирусную нагрузку вируса папилломы человека рода beta у больных с единичным и множественным базально-клеточным раком кожи в очагах новообразований и в непораженной коже.

2. Изучить иммунологические показатели периферической крови у больных с единичным и множественным базально-клеточным раком кожи.

3. Сравнить иммунологические показатели периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных и неинфицированных вирусом папилломы человека.

4. Оценить взаимосвязи между иммунологическими показателями периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи в зависимости от характера течения заболевания и инфицированности вирусом папилломы человека.

Научная новизна.

Впервые методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real-Time) установлена высокая частота встречаемости вируса папилломы человека рода beta у больных с единичным базально-клеточным раком кожи (71,4% случаев) и больных с множественным базально-клеточным раком кожи (83,3% случаев).

Проведено сравнение частоты встречаемости вируса папилломы человека у больных базально-клеточным раком кожи как в очаге пролиферативного роста, так и в здоровой коже. С целью забора материала для выявления вируса с участков неизмененной кожи впервые использовался метод бритвенного соскоба со сгибательной поверхности правого плеча.

Установлены изменения в иммунологических показателях больных с единичным базально-клеточным раком кожи: снижение относительного количества лимфоцитов в периферической крови при повышении относительного количества клеток, несущих рецепторы CD3-CD16+CD56+(%), увеличение в сыворотке содержания Ig А, ИФН-г и снижение уровня ИФН-б по сравнению с условно-здоровыми лицами.

При множественном базально-клеточном раке кожи зарегистрировано увеличение процентного содержания эозинофилов в периферической крови, увеличение CD3-CD16+CD56+(%), снижение уровня CD3-CD19+(%); увеличение в сыворотке содержания ИФН-г и снижение ИФН-б по сравнению с условно-здоровыми лицами.

Однотипными изменениями показателей иммунитета у больных базалиомой являются снижение относительного количества лимфоцитов при повышении числа клеток, несущих рецепторы CD3-CD16+CD56+; увеличение уровня ИФН-г; снижение концентрации ИФН-б и отсутствие изменений показателей функциональной активности нейтрофилов.

При корреляционном анализе показателей иммунитета в группе больных множественным базально-клеточным раком кожи установлены взаимосвязи: прямые - между ИФН-б и Ig A, ИФН-б и Ig G, ИФН-г и Т-лимфоцитами, ИФН-г и субпопуляцией T-лимфоцитов с киллерной активностью, ИФН-г и Ig G; обратные - между ИФН-г и спонтанным НСТ-тестом, ИФН-г и натуральными киллерами.

При опухолевом процессе, ассоциированном с ВПЧ-инфекцией, определены изменения в показателях иммунитета, связанные с повышением количества эозинофилов, уровней ИФН-б и ИФН-г и числа нейтрофилов с одновременным нарушением их функции, а так же со снижением количества лимфоцитов, без изменения субпопуляционного состава этих клеток, уменьшением уровня Ig G.

При корреляционном анализе показателей иммунитета в группе больных БКРК, инфицированных вирусом папилломы человека, установлены положительные взаимосвязи между ИФН-б и CD3+CD19-(%), CD3+CD19-(Ч109/л), активностью фагоцитоза нейтрофилов (%) и отрицательная взаимосвязь с CD3+CD4+(Ч109/л). Установлены взаимосвязи между ИФН-г и CD3+CD19-(%), CD3+CD19-(Ч109/л), CD3+CD16+CD56+(%), и CD3+CD16+CD56+(Ч109/л), имеющие положительную направленность, с СН50, имеющую обратную направленность.

Установлена прямая взаимосвязь между вирусной нагрузкой ВПЧ-инфекции и количеством Т-лимфоцитов. Обратные взаимосвязи определены между вирусной нагрузкой ВПЧ-инфекции и числом В-лимфоцитов и нейтрофилов.

Теоретическое и практическое и значение.

Теоретическая значимость работы заключается в расширении представлений о роли вируса папилломы человека рода beta и факторов иммунной системы в развитии и течении базально-клеточного рака кожи.

В практическом плане значимость работы состоит в оптимизации диспансерного наблюдения больных базально-клеточным раком кожи. Полученные данные позволяют на основании иммунологических показателей, при выявлении ВПЧ рода beta 3 у пациентов с eдиничным БКРК перевести их в группу больных множественным БКРК с пожизненными регулярными осмотрами с целью выявления очагов пролиферативного роста на ранних стадиях.

Реализация результатов исследования.

Результаты работы используются в учебном процессе на кафедрах дерматовенерологии, онкологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, а также в практической деятельности Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Областного кожно-венерологического диспанцера №3 г. Челябинска и Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Челябинского Областного клинического терапевтического госпиталя для ветеранов войн.

1. Материалы и методы исследования

Для осуществления поставленной цели в НИИ иммунологии и на кафедре дерматовенерологии Челябинской государственной медицинской академии за период 2008- 2010гг. проведено клинико-иммунологическое одномоментное продольное исследование больных с различными клиническими проявлениями базально-клеточного рака кожи, ассоциированного с папилломовирусной инфекцией. Обследовано 50 пациентов с базально-клеточным раком кожи в возрасте от 52 до 80 лет и 30 условно-здоровых лиц в возрасте от 58 до 70 лет. Диагноз БКРК был подтвержден в Государственном лечебно-профилактическом учреждении Челябинского окружного клинического онкологического диспансера на основании клинических и цитологических методов исследования, а также врачами-патологоанатомами в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения Челябинской областной клинической больницы на основании гистологических методов исследования.

Критерии включения в исследование: проживание на территории Челябинской области; подтверждение диагноза базально-клеточного рака кожи цитологическим и/или гистологическим методом; возраст больных старше 50 лет (для исключения синдрома Горлина-Гольтца); согласие больного на участие в исследовании.

Критерии исключения: наличие других онкологических заболеваний; наличие тяжелых соматических болезней: ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, бронхиальная астма, хронический обструктивный бронхит в фазе декомпенсации, перенесенный инфаркт миокард, инсульт, сахарный диабет; перенесенные острые инфекционные и вирусные заболевания в течение последних шести недель до проведения исследования; острые и обострение неинфекционных хронических заболеваний в течение последних четырех недель.

Анализ распределения больных базально-клеточным раком кожи по характеру течения заболевания, возраста появления опухоли кожи, распределения по системе ТNМ, характеристики типов кожи по T. Fitzpatrik, гистологическое строение опухолей показал следующее:

1. Необходимость формирования двух групп больных: I группа - 30 человек с единичным БКРК; II группа - 20 человек с множественным БКРК. У больных с единичным БКРК были обнаружены следующие клинические разновидности базалиом: язвенная форма - 13 больных; нодулярная форма - 9 больных; саморубцующаяся - 4 больных; пигментная форма - 4 больных. У 20 больных с множественным БКРК были обнаружены 54 базалиомы: язвенная форма - 27 БКРК; нодулярная форма - 18 БКРК; пигментная форма - 9 БКРК;

2. Возраст появления базалиом - от 29 до 79 лет. После 50 лет базалиомы возникли у 72,3 % больных;

3. При сравнении распределения базалиом по системе ТNМ наиболее часто встречались базалиомы размером до 2 см (Т1N0М0) - 76,2 % случаев. В стадии Т2N0М0 зарегистрировано 23,8 % случаев. Причем в стадиях Т3N0М0 и Т4N0М0 не зарегистрировано ни одного больного;

4. Среди обследованных больных базально-клеточным раком кожи встречались только пациенты, у которых выявлены I, II, III типы кожи по T. Fitzpatrik (тип кожи I - у 2,5 %; тип кожи II - у 74 %; тип кожи III - у 23,5 %). Лица, обладающие IV, V и VI типом кожи, в группе обследованных больных не зарегистрированы;

5. При гистологическом исследовании базалиом в 90,3 % определялись опухоли солидного типа, а в 9,7% - опухоли солидно-аденоидного типа.

Определение ДНК ВПЧ молекулярно-биологическим методом (ПЦР). С целью выявления ВПЧ рода beta в группе обследуемых больных были проведены молекулярно-биологические исследования (ПЦР) у 39 пациентов БКРК. В первой подгруппе больных единичным БКРК обследован 21 больной, во второй подгруппе пациентов с множественным БКРК -- 18. При проведении данной методики и статистической обработке полученных результатов группу контроля условно-здоровых лиц составили 10 человек. Материалом для молекулярно-биологического исследования послужили биоптаты кожи размером 0,2Ч0,2см, полученные с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или суспензия клеток, полученная методом соскоба. Соскоб использовался для взятия материала из зон новообразований, где имелись нарушения сцепления между клетками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы, а так же с участков здоровой кожи (правое плечо), как у больных с базалиомой, так и у лиц, контрольной группы.

Определение ВПЧ в соскобах проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real-Time). Метод ПЦР в «режиме реального времени», позволил определить абсолютное количество геномов ВПЧ рода beta и ДНК человека в пробе. Амплификация и детекция проводилась на приборе «Rotor-Gene» 3000 («Corbett Research», Австралия). Для выявления ДНК ВПЧ рода beta (3 вида) были использованы три системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов), предоставленные Федеральным государственным учреждением науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора (г. Москва):

1-ая - для выявления вида beta 1 (5,8,12,14,19,21,25,47,36 типы);

2-ая - для выявления вида beta 2 (9,15,17,22,23,38,37,80 тип);

3-ая - для выявления вида beta 3 (49,75,76 тип);

Во все три системы введены олигонуклеотиды для выявления и количественного определения ДНК человека (по Я-глобиновому гену человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля).

С учетом того, что при взятии клинического материала из пораженных раком очагов и нормальной кожи количество эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, мы использовали методику нормирования количества вируса на количество клеток человека, предложенную Кладовой А.Ю. (2007г.), что позволило получить надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке ВПЧ в клетках кожи.

Расчет нормализованной вирусной нагрузки (ВН) производился по формуле:

ВН = lg ((кол-во ДНК ВПЧ / кол-во ДНК чел.) Ч 105).

Иммунологические методы исследования. Для оценки иммунологических показателей у больных базально-клеточным раком кожи и у лиц условно-здоровой группы исследовалась периферическая кровь. В периферической крови было определено: абсолютное число лейкоцитов; абсолютное и относительное число нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и их субпопуляций; оценена функциональная активность нейтрофилов и концентрация иммуноглобулинов. Также определялись концентрация интерферонов: ИФН-б, ИФН-г.

Было проведено:

- определение популяционного состава лимфоцитов крови методом проточной цитометрии, уникальность которого заключается в возможности исследовать целевую клеточную популяцию в среде гетерогенного образца (Луговская С.А. и др. 2005; Зурочка А.В., 2007; Luider J. et al., 2005). Непосредственно для окрашивания нами были использованы двухпараметрические реагенты линии IOTest: CD3-FITC/CD19-PE, CD3-FITC/CD4-PE, CD3-FITC/CD8-PE, CD3-FITC/CD(16+56)-PE, CD3-FITC/CD25-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE фирмы Beckman Coulter, США. Наличие пан-Т-лимфоцитарного маркера CD3+ при отсутствии CD 19+ характерно для Т-лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD4+ - для Т-хелперно/индукторных лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD8 + - для Т-цитоксических лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD 16+56 - для TNК лимфоцитов; экспрессия CD19+ при отсутствии CD3+ - для В-лимфоцитов; CD 16+56 при отсутствии CD3+ для NК лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD25+ - маркер ранней активации Т-клеток; CD3+HLA DR+ - маркер поздней активации Т-лимфоцитов;

- для изучения функциональной активности нейтрофилов периферической крови определяли: лизосомальную акивность [Фрейдлин И.С., 1984], фагоцитарную активность на модели поглощения частиц полистерольного латекса [Фрейдлин И.С., 1976], кислородзависимый метаболизм с помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста [Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979]. Определение ЦИК было проведено по методу Гашковой В. (1978г.). Концентрации иммуноглобулинов класса А, М, G в сыворотке крови методом ИФА, с использованием иммуноферментных тест-систем ООО «Хема» (г. Москва);

- определение общей активности комплемента по 50% гемолизу (Резникова Л.С., 1967);

- для определения уровня интерферонов были использованы соответствующие тест-системы ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета прикладных программ “Statistica for Windows 6.0” с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± m). Различия между сравниваемыми группами считали достоверными при p ? 0,05, по непараметрическим критериям Mann-Whitney, Wald-Wolfowitz (Гублер Е.В., 1973; Гланц С., 1999; Боровиков В.И., 2001). Представленные цифровые данные были округлены до 2-го десятичного знака. Для оценки достоверности частоты встречаемости признака использовалось значения хи-кватрат (чІ) по методу Пирсона. Определение взаимосвязей между показателями иммунитета проводили с помощью корреляционного анализа по Spearmаn.

2. Результаты исследования и их обсуждение

Первой задачей нашего исследования стало выявление частоты встречаемости, спектра генотипов и вирусной нагрузки вируса папилломы человека рода beta у больных с единичным и множественным базально-клеточным раком кожи в очагах новообразований и в непораженной коже.

Вирус папилломы человека рода beta среди больных с единичным БКРК обнаруживался у 15 человек (71,4%). Тогда как среди больных с множественным БКРК вирус папилломы человека рода beta определялся у 15 человек (83,3%). У условно-здоровых лиц вирус папилломы человека рода beta выявлен у 2 человек (20%) (табл. 1).

Таблица 1. Частота инфицирования вирусом папилломы человека рода beta у больных базально-клеточным раком кожи

Примечание: р* - при сравнении в группе с единичным БКРК между пораженной и здоровой кожей; р** - при сравнении в группе с множественным БКРК между пораженной и здоровой кожей.

Изучение частоты инфицирования вирусом папилломы человека рода beta у больных базально-клеточным раком кожи показало, что значительно чаще вирус папилломы человека обнаруживается в группе с единичным БКРК в очагах, пораженной опухолью кожей, чем у этих же лиц в участке правого плеча здоровой кожи, непораженном опухолью. Так же надо отметить, что чаще вирус папилломы человека обнаруживается в группе с множественным БКРК в очагах, пораженных опухолью, чем у этих же лиц в участке здоровой кожи. В группе условно-здоровых лиц вирус папилломы человека рода beta был зарегистрирован у 2 человек.

В пораженной коже у больных с единичной базалиомой статистически значимо чаще встречаются вирус папилломы человека рода beta 1 и 2. А в пораженной коже у больных множественной базалиомой разница в частоте встречаемости вируса папилломы человека рода beta 1, 2 и 3 не обнаружилась. При сравнении частоты встречаемости различных генотипов вируса папилломы человека рода beta в пораженной коже больных базалиомой было установлено: с единичной базалиомой чаще встречаются вирус папилломы человека рода beta 1 (р < 0,05), при множественной - чаще вирус папилломы человека рода beta 3 (р < 0,05). Данные приведены в таблице 2.

Таблица 2. Распределение генотипов вируса папилломы человека рода beta в пораженной коже у больных базально-клеточным раком кожи

Примечания для таблицы 2: р1-2 статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ beta 1 - по сравнению с группой ВПЧ beta 2; р1-3 статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ beta 1 - по сравнению с группой ВПЧ beta 3; р2-3 статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ beta 2 - по сравнению с группой ВПЧ beta 3. р 4 - статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с единичным БКРК - по сравнению с группой с множественным БКРК.

При обследовании биоптатов здоровой кожи было установлено, что у больных множественной базалиомой вирус папилломы человека рода beta 1 и 2 встречается достоверно чаще, чем вирус папилломы человека рода beta 3. Из-за малого числа наблюдений мы не смогли обнаружить разницу в распределении вируса папилломы человека рода beta у больных с единичной базалиомой и контрольной группы. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3. Распределение генотипов вируса папилломы человека рода beta в здоровой коже у больных базально-клеточным раком кожи

Примечания для таблицы 3: р1-2 статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ beta 1 - по сравнению с группой ВПЧ beta 2; р1-3 статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ beta 1 - по сравнению с группой ВПЧ beta 3; р2-3 статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ beta 2 - по сравнению с группой ВПЧ beta 3.

Анализ частоты встречаемости моно- и микст-ВПЧ-инфекции у исследуемых групп показал, что на долю моноинфекции (инфицирование одним видом ВПЧ) у больных БКРК в пораженной коже приходилось от 40 % до 46,67 %, в здоровой коже - от 0% до 42,9 %, а на долю микст-ВПЧ-инфекции (инфицирование двумя и более видами ВПЧ) у больных БКРК в пораженной коже приходилось от 53,3 % до 60 %, в здоровой коже от 57,14 % до 100 %. В группе условно-здоровых лиц на долю моноинфекции и микстинфекции приходилось по 50 % случаев.

Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов. В связи с этим, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки - количество геномов ВПЧ в эпителиальных клетках [Snijders P., 2003; Stoler M., 2006]. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа вирусных геномов в коже. Это позволит более объективно судить о ВПЧ-инфекции в опухолях кожи, а, следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК и ВПЧ [Snijders P., 2003; Harwood C. Et al., 2004; zur Hausen P. et al., 2005; Weissenborn S. et al., 2005].

Таблица 4. Средняя вирусная нагрузка вируса папилломы человека рода beta у больных базально-клеточным раком кожи, M ± m

Примечания для таблицы 4 - статистически значимых различий нет.

Нам известно, что инфицирование ВПЧ кожных покровов происходит при наличии микротравм (повышенная солнечная инсоляция, повышенная фоточувствительность, рентгеновское и другие виды ионизирующего облучения, воздействие на кожу минеральных масел, смол, мышьяка, инсектицидов, нефтепродуктов и других химических веществ, механические и термические травмы кожи, приводящие к образованию рубцов и т.д.), когда глубина их достигает базального слоя эпидермиса. Достаточно единичных вирусных частиц, чтобы вызвать инфекционный процесс. Показано, что определенные характерные фрагменты ВПЧ, связываясь с геном р53 кератиноцитов и воздействуя на его опухольсупрессирующую функцию, приводят к неконтролируемой пролиферации кератиноцитов [Прилепская В.Н. и др., 2000; Коломиец Л.А., Уразова Л.Н., 2002; Молочков А. В. и др., 2004]. У лиц, инфицированных ВПЧ, по мере размножения трансформированных клеток и прогрессирования неоплазии возрастает интеграция ДНК ВПЧ в клеточный геном, снижается экспрессия протеинов репликации (Е1-Е5). Далее ген Е2 становится функционально неактивным, и экспрессия Е6 и Е7 возрастает, пролиферация клонов трансформированных клеток усиливается, и процесс вступает на этапы канцерогенеза с максимальной экспрессией протеина Е7 [Мынбаев О.А. и др., 2009; Климов Е.А., 2010].

Результаты полученных концентраций ДНК ВПЧ выражались в lg (ВПЧ на 105 клеток человека), данные приведены в таблице 4, и трактовались по аналогии с результатами инфицирования ВПЧ клеток базального слоя эпителия шейки матки (наиболее уязвимым участком считается зона перехода многослойного плоского эпителия в цилиндрический эпителий), следующим образом: менее 3 lg - малозначимая, от 3 до 5 lg - значимая и более 5 lg - повышенная вирусная нагрузка [Прилепская В.Н. и др., 2002; Киселев В.И., Киселев О.И., 2003; Рудакова Е.Б. и др., 2004; Русакевич П.С., Фокина Н.П., 2006; Климов Е.А., 2010; Зотова М.А., 2011].

Значения вирусной нагрузки составляло от 3,84 lg/105 до 4,61 lg/105 в пораженной коже больных, и от 2,4 lg/105 до 4,4 lg/105 в здоровой коже больных. Мы сравнили наши данные с данными Кладовой А. Ю. (2007г.). Автором было установлено, что из 82 больных БКРК обнаружение ВПЧ рода beta составило 81,7 % случаев, а вирусная нагрузка составила 2,08 ± 1,4 lg/105 в пораженной коже, биоптаты здоровой кожи этих же больных не исследовались.

При сравнении между показателями средней вирусной нагрузки вируса папилломы человека рода beta у больных базально-клеточным раком кожи с единичной и множественной базалиомой, а так же при оценке пораженной и здоровой кожи мы не нашли статистически значимых отличий.

Анализ полученных данных показал, что, во-первых, вирус папилломы человека рода beta чаще встречается в биоптатах, пораженных базально-клеточным раком кожи, чем в здоровых тканях; во-вторых, у больных с единичным базально-клеточным раком кожи чаще встречается вирус папилломы человека рода beta 1, у больных с множественным базально-клеточным раком кожи - чаще вирус папилломы человека рода beta 3; в-третьих, моно- и микст-ВПЧ-инфекция одинаково часто встречается как в здоровой, так и в пораженной коже; в-четвертых, показатели вирусной нагрузки вируса папилломы человека рода beta здоровой и пораженной кожи как при единичном БКРК, так и при множественном БКРК не имели достоверных различий, при этом вирусная нагрузка оценивалась как значимая.

Следующим этапом нашего исследования стало изучение иммунологических показателей периферической крови у больных с единичным и множественным базально-клеточным раком кожи. В таблице 5 представлены данные о содержании лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов в периферической крови у обследованных.

Таблица 5. Содержание лейкоцитов в периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, M ± m

Примечания для таблиц 5?6: р1?3 - статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с единичным базально-клеточным раком кожи - по сравнению с группой практически здоровых лиц; р2?3 - статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с множественным базально-клеточным раком кожи -по сравнению с группой практически здоровых лиц; р1?2 - статистическая значимость различия средних исследуемых показателей между группами с единичным и множественным базально-клеточным раком кожи.

Клеточный состав периферической крови у больных с множественным базально-клеточным раком кожи характеризовался увеличением числа эозинофилов - по сравнению с группой больных с единичным базально-клеточным раком кожи и группой условно-здоровых лиц. При анализе данных, приведенных в таблице 5, можно отметить, что у группы с единичным базально-клеточным раком кожи наблюдается достоверное снижение относительного количества лимфоцитов по отношению к группе условно-здоровых лиц, так же наблюдается достоверное снижение относительного количества лимфоцитов больных с множественным базально-клеточным раком кожи по сравнению с группой условно-здоровых лиц. Других достоверных отличий между показателями в группах больных не выявлено.

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных с базально-клеточным раком кожи представлен в таблице 6.

Таблица 6. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, M ± m

При анализе показателей лимфоцитарного звена у пациентов с единичным и множественным БКРК нами установлено, что у больных при сравнении с группой контроля наблюдается достоверное повышение относительного количества CD3-CD16+CD56+. При этом у больных с множественным БКРК показатель CD3-CD16+CD56+ достоверно выше, чем у больных с единичным БКРК. У больных с единичным БКРК отмечается достоверное повышение относительного количества CD3?CD19+ при сравнении с группой больных множественным БКРК. У больных с множественным БКРК достоверно снижено относительное количество CD3?CD19+, чем у группы условно-здоровых лиц.

Для изучения функциональной активности нейтрофилов были проанализированы следующие показатели: лизосомальная активность, спонтанный и индуцированный НСТ-тест, активность и интенсивность фагоцитоза нейтрофилов. При проведении сравнительного анализа функциональной активности нейтрофилов периферической крови отличий от показателей контроля и между показателями в группах больных выявлено не было.

С целью изучения гуморального звена нами были определены следующие показатели в сыворотке крови: уровень иммуноглобулинов A, М, G, ЦИК, СН50 и показатели интерферонов б и г. Изучение показателей гуморального иммунитета характеризовалось достоверным увеличением Ig А у больных с единичным базально-клеточным раком кожи - по сравнению с группой практически здоровых лиц (рис. 1). Изучение показателей интерферонов б и г выявило достоверное увеличение ИФН-г и снижение уровня содержания ИФН-б у больных с базалиомой по сравнению с группой практически здоровых лиц.

Рисунок 1. Показатели гуморального иммунитета в крови у больных базально-клеточным раком кожи и показатели интерферонов б и г

Таким образом, сравнительный анализ показателей иммунитета больных базалиомой, как единичной, так и множественной, по сравнению с показателями группы контроля позволил установить, что однотипными изменениями у больных базалиомой являются: снижение относительного количества лимфоцитов, что характерно для данного заболевания; увеличение показателя CD3-CD16+CD56+ (%), который отвечает за функцию врожденного иммунитета; отсутствие изменений показателей функциональной активности нейтрофилов, что свидетельствует о недостаточном участии этих клеток в противоопухолевой защите при базалиоме; увеличение показателя интерферона-г, что характеризует эффективную противоопухолевую защиту и, возможно, определяет медленный рост новообразований и отсутствие метастазирования; снижение показателя интерферона-б, что, вероятно, свидетельствует о снижении противовирусной защиты.

Сравнительный анализ показателей иммунитета больных множественной базалиомой показал, увеличение процентного содержания эозинофилов в периферической крови, что подтверждает данные других исследований при онкологических заболеваниях, и снижение уровня CD3-CD19+%, что свидетельствует о некотором подавлении гуморального иммунитета.

Сравнение иммунологических показателей периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных и неинфицированных вирусом папилломы человека показало, что клеточный состав периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных ВПЧ, характеризовался увеличением числа нейтрофилов, за счет сегментоядерных форм, увеличением числа эозинофилов и снижением уровня лимфоцитов по сравнению с группой больных базально-клеточным раком кожи, неинфицированных ВПЧ (табл. 7).

Таблица 7. Содержание лейкоцитов в периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных ВПЧ и неинфицированных ВПЧ, M ± m

Примечания для таблиц 7?8: статистическая значимость различия средних исследуемых показателей группы с ВПЧ+ базально-клеточным раком кожи по сравнению с группой с ВПЧ- базально-клеточным раком кожи.

При анализе показателей лимфоцитарного звена у пациентов БКРК, инфицированных и неинициированных вирусом папилломы человека, различий установлено не было.

При изучении функциональной активности нейтрофилов периферической крови было выявлено, что у больных БКРК, инфицированных ВПЧ, снижены: интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, фагоцитарное число и активность индуцированного НСТ-теста полиморфно-ядерных нейтрофилов (табл. 8).

Таблица 8. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных ВПЧ и неинфицированных ВПЧ, M ± m

Изучение уровней интерферонов показало достоверное увеличение содержания ИФН-б и ИФН-г у больных БКРК, инфицированных ВПЧ, по сравнению с группой неинфицированных ВПЧ. Изучение показателей гуморального звена иммунитета характеризовалось снижением Ig G у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных ВПЧ, по сравнению с группой неинфицированных ВПЧ (рис. 2).

Рисунок 2. Показатели гуморального иммунитета и интерферонов б и г у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных ВПЧ и неинфицированных ВПЧ

Таким образом, анализ показал, что у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных вирусом папилломы человека, был снижен уровень лимфоцитов, без изменения субпопуляционного состава; повышен уровень нейтрофилов, но функция этих клеток была нарушена, так как снижены интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, фагоцитарное число и НСТ-тест индуцированный; увеличен уровень эозинофилов; имелось увеличение уровней ИФН-б и ИФН-г, при снижении Ig G, по сравнению с показателями больных, неинфицированных ВПЧ.

Для выявления структуры и характера взаимосвязей между иммунологическими показателями был применен метод корреляционного анализа. Взаимосвязи определялись между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека, иммунологическими показателями и уровнями интерферонов, так как именно интерфероны осуществляют реализацию механизмов врожденного и регуляцию системы адаптивного иммунитета, составляющих основу контроля над процессами, вызванными ВПЧ [Stern P.L., Kitchener H.C., 2009]. При анализе взаимосвязей в группе больных единичным БКРК выявлено 4 корреляционных связей, из них 3 положительных и 1 отрицательная. Между ИФН-б определялись положительные взаимосвязи с активностью спонтанного НСТ-теста и CD3+CD16+CD56+(%). Отрицательная взаимосвязь определилась между ИФН-б и СН 50. Между ИФН-г была установлена положительная взаимосвязь с активностью фагоцитоза нейтрофилов. Выявленные взаимосвязи свидетельствуют о том, что снижение ИФН-б, которое характерно для этих пациентов, может сопровождается снижением внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и количеством субпопуляции Т-лимфоцитов с киллерной активностью, но повышением гемолитической активности комплемента. Увеличение ИФН-г сопровождается увеличением активности фагоцитоза нейтрофилов. Эти данные можно оценивать, как усиление роли врожденного иммунитета при единичном базально-клеточном раке кожи.

При анализе взаимосвязей в группе больных множественным БКРК выявлено 7 корреляционных связей, из них 5 положительных и 2 отрицательных. Между ИФН-б определялись положительные взаимосвязи с Ig A и Ig G. Между ИФН-г были установлены положительные взаимосвязи с CD3+CD19-(%), CD3+CD16+CD56+(%), Ig G. Между ИФН-г были установлены отрицательные взаимосвязи с активностью спонтанного НСТ-теста и CD3-CD16+CD56+(%).

Выявленные взаимосвязи свидетельствуют о том, что снижение ИФН-б, характерное для этих пациентов, может сопровождаться уменьшением уровня коннцентраций Ig A и Ig G. Увеличение ИФН-г сопровождается увеличением Т-лимфоцитов, субпопуляции Т-лимфоцитов с киллерной активностью и Ig G, но уменьшением натуральных киллеров и активностью спонтанного НСТ-теста. Полученные данные могут оцениваться, как некоторое усиление адаптивного иммунитета при множественном базально-клеточном раке кожи.

Для установления возможного влияния инфицирования вирусом папилломы человека на иммунную систему больных базалиомой, нами был проведен корреляционный анализ показателей иммунитета инфицированных и неинфицированных ВПЧ.

При анализе взаимосвязей в группе больных БКРК, неинфицированных ВПЧ, выявлено 7 корреляционных связей, из них 5 положительных и 2 отрицательные. Положительных взаимосвязей между ИФН-б и иммунологическими показателями периферической крови больных не было установлено. Между ИФН-б определялась отрицательная взаимосвязь с циркулирующими иммунными комплексами. Положительные взаимосвязи были выявлены между ИФН-г и CD3+CD19- (%), CD3+CD19- (Ч109/л), активностью фагоцитоза нейтрофилов, эозинофилами (%) и нейтрофилами (%). Отрицательная корреляционная связь была установлена между ИФН-г и фагоцитарным числом нейтрофилов.

Выявленные взаимосвязи свидетельствуют о том, что увеличение ИФН-г, характерное для базально-клеточного рака кожи и единичного и множественного, сопровождается увеличением Т-лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, активности фагоцитоза нейтрофилов, но некоторым уменьшением способности фагоцитов к захвату частиц латекса. Эти данные можно оценивать как усиление роли иммунной системы в патогенезе опухолевого заболевания.

При анализе взаимосвязей в группе больных БКРК, инфицированных вирусом папилломы человека, выявлено 14 корреляционных связей, из них 8 положительных и 6 отрицательных. Положительные взаимосвязи определены между ИФН-б и CD3+CD19- (%), CD3+CD19- (Ч109), активностью фагоцитоза нейтрофилов (%); отрицательные взаимосвязи - между ИФН-б и CD3+CD4+ (Ч109). Положительные взаимосвязи установлены между ИФН-г и CD3+CD19-(%), CD3+CD19-(Ч109), CD3+CD16+CD56+(%), и CD3+CD16+CD56+(Ч109). Обратная взаимосвязь установлена между ИФН-г и СН50.

При анализе взаимосвязей вирусной нагрузки вируса папилломы человека и показателей иммунитета были установлены: одна прямая связь между вирусной нагрузкой и CD3+CD19-(Ч109) и обратные корреляционные связи между вирусной нагрузкой и палочкоядерными нейтрофилами, нейтрофилами (%), CD3-CD19+(%) и CD3-CD19+(Ч109).

Можно предположить, что при опухолевом процессе, ассоциированном с ВПЧ-инфекцией, увеличение ИФН-б способствует увеличению активности фагоцитоза нейтрофилов, Т-лимфоцитов, со снижением Т-хелперов, увеличение ИФН-г приводит к увеличению Т-лимфоцитов, TNK-клеток, со снижением активности комплемента. При возрастании вирусной нагрузки увеличивается количество Т-лимфоцитов, но падает число нейтрофилов и В-лимфоцитов.

Таким образом, корреляционный анализ показал, во-первых, взаимосвязь различных компонентов иммунной системы, во-вторых, при опухолевом процессе роль ИФН-г заключается в индукции увеличения количества Т-лимфоцитов, эозинофилов и нейтрофилов. На наш взгляд, так реализуется противоопухолевый иммунитет при данном заболевании, для которого характерно отсутствие метастазирования. В-третьих, при опухолевом процессе, ассоциированном с вирусом папилломы человека, одновременное увеличение ИФН-г и ИФН-б способствует повышению количества Т-лимфоцитов, TNK-клеток и фагоцитарной функции нейтрофилов, рост вирусной нагрузки приводит к увеличению Т-лимфоцитов. По нашему мнению, сочетанное действие этих факторов реализует одновременно и противоопухолевую и противовирусную защиту при изучаемом заболевании.

Заключение

эпителиальный опухоль клеточный

Выводы:

1. Методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени установлена высокая частота встречаемости вируса папилломы человека рода beta у больных единичным (71,4% случаев) и множественным (83,3% случаев) базально-клеточным раком кожи.

2. Частота обнаружения вируса папилломы человека рода beta у больных базально-клеточным раком кожи выше в пораженной коже (единичный - 71,4 %, множественный - 83,3 %), чем в здоровой коже (единичный - 14,3 %, множественный - 38,9 %). При этом у больных с единичным базально-клеточным раком кожи чаще встречается вирус папилломы человека рода beta 1 (80 %), у больных с множественным базально-клеточным раком кожи чаще - вирус папилломы человека рода beta 3 (60 %).

3. Инфицирование одним или несколькими типами ВПЧ и показатели вирусной нагрузки одинаково часто встречаются при единичном и множественном базально-клеточном раке кожи, как в пораженной, так и здоровой коже.

4. Иммунологические показатели больных базально-клеточным раком кожи характеризуются однотипными изменениями независимо от характера течения заболевания: снижением относительного количества лимфоцитов и уровня ИФН-б, увеличением CD3-CD16+CD56+ (%) и концентрации ИФН-г и отсутствием изменений функциональной активности нейтрофилов.

5. При множественном базально-клеточном раке кожи в отличии от единичного наблюдается увеличение относительного содержания эозинофилов и снижение количества CD3-CD19+ (%) в периферической крови больных.

6. При множественной базалиоме установлены взаимосвязи между иммунологическими показателями больных: прямые - между ИФН-б и Ig A, ИФН-б и Ig G, ИФН-г и Т-лимфоцитами, ИФН-г и субпопуляцией TNK-клеток, ИФН-г и Ig G; обратные - между ИФН-г и спонтанным НСТ-тестом, ИФН-г и натуральными киллерами.

7. У больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных вирусом папилломы человека, были установлены изменения в показателях иммунитета, связанные с повышением количества эозинофилов и числа нейтрофилов с одновременным нарушением функции этих клеток, со снижением количества лимфоцитов, без изменения их субпопуляционного состава, с уменьшением уровня Ig G, с повышением концентрации ИФН-б и ИФН-г.

8. У больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных вирусом папилломы человека, выявлены взаимосвязи между иммунологическими показателями: прямые - между ИФН-б и Т-лимфоцитами, активностью фагоцитоза нейтрофилов, между ИФН-г и Т-лимфоцитами, TNK-клетками, между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека и Т-лимфоцитами; обратные - между ИФН-б и CD3+CD4+(Ч109/л), между ИФН-г и активностью комплемента, между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека и количеством В-лимфоцитов и нейтрофилов.

Практические рекомендации:

1. С целью оптимизации диспансерного наблюдения больных следует выделять единичный и множественный базально-клеточный рак кожи.

2. При обнаружении у больного с единичным базально-клеточным раком кожи вируса папилломы человека рода beta 3, увеличении процентного содержания эозинофилов и снижении уровня В-лимфоцитов в периферической крови рекомендуется включать пациента в группу диспансерного наблюдения больных множественным базально-клеточным раком кожи.

3. В группе больных множественным базально-клеточным раком кожи диспансеризация должна проводиться пожизненно с частотой осмотра один раз в 6 - 12 месяцев.

Литература

1. Русских, О.О. Эпидермальные новообразования кожи у больных базально-клеточным раком кожи / О.О. Русских, Т.П. Писклакова, Е.И. Костенко // Национальный альянс дерматологов и косметологов: материалы науч. тр. I междунар. форума медицины и красоты. - М., 2008. - С.227-228.

2. Писклакова, Т.П. Базально-клеточный рак кожи и солнечный эластоз как грани единой проблемы старения кожи / Т.П. Писклакова, Е.И. Костенко, О.О. Русских, О.И. Екимова // Научно-практическая конференция национального альянса дерматологов и косметологов «Инновации в дерматологии, косметологии и эстетической медицине». - Уфа, 2009 - С.62.

3. Русских, О.О. Показатели системного иммунитета у больных базально-клеточным раком кожи / О.О. Русских, Е.И. Костенко // Вест. Юж.-Урал. Гос. Ун-та. - 2010. -№37(213). - С. 89-94. - (Сер. «Образование, здравоохранение, физическая культура»; Вып. 25).

4. Русских, О.О. Сравнительная характеристика показателей системного иммунитета у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями кожи / О.О. Русских, Е.И. Костенко, Л.Ф. Телешева // Вест. Урал. Мед. Академической Науки. Тематический вып. по аллергологии и иммунологии. - 2011.-Т. 2/1. (35) - С.197-198.

5. Русских, О.О. Показатели системного иммунитета и интерферонового статуса у больных базально-клеточным раком кожи / О.О. Русских, К.В. Никушкина // Вест. Урал. Мед. Академической Науки. Тематический вып. по аллергологии и иммунологии . - 2011.-Т. 2/1. (35) - С.198-199.

6. Русских, О.О. Показатели системного иммунитета у больных базально-клеточным раком кожи, инфицированных вирусом папилломы человека / О.О. Русских // Известия высших учебных заведений. Уральский регион. - 2011. - № 3. - С. 112 - 117.

7. Костенко, Е.И. Изменения иммунологических показателей у больных себорейным кератозом / Е.И. Костенко, О.О. Русских // Вест. Юж.-Урал. Гос. Ун. - 2011. - №39 - С. 89-94. ( Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура»; Вып. 29).

Размещено на Allbest.ru