Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.01.07 - глазные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела

Норман Кирилл Сергеевич

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Едокимова на базе ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Тахчиди Христо Периклович

Официальные оппоненты:

Захаров Валерий Дмитриевич доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом витрео-ретинальной хирургии и диабета глаза ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Казарян Арминэ Амасимовна доктор медицинских наук, профессор кафедры глазных болезней института усовершенствования врачей Национального медико-хирургического Центра имени Н.И. Пирогова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ глазных болезней РАМН

Защита состоится " 3 " декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.014.01 при ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России.

Автореферат разослан " 2 " ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.В. Агафонова

Список сокращений

ВПМ - внутренняя пограничная мембрана

ЗКС СТ - задние кортикальные слои стекловидного тела

ЗОСТ - задняя отслойка стекловидного тела

ОКТ - оптическая когерентная томография

СМ - световая микроскопия

СТ - стекловидное тело

СЭМ - сканирующая электронная микроскопиия

ЭРГ - электроретинография

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Последние годы развития витреоретинальной хирургии ознаменовались рядом новых позиций, позволивших достигнуть качественно нового уровня в лечении больных. В первую очередь, это касается применения микроинвазивной трехпортовой техники витрэктомии, использования одноразового режущего инструмента диаметром 25 G, 27 G, нового поколения световодов и эндовитреальных инструментов. Все, вместе взятое, позволило резко уменьшить травматичность операций, снизить сроки реабилитации пациентов и добиться улучшения функциональных результатов оперативного лечения (Захаров В.Д., 2009; Тахчиди Х.П., 2010; Sebag J., 2010; Pravin U., 2012).

Основную группу заболеваний заднего отрезка глаза, нуждающихся в витреоретинальном вмешательстве, составляют диабетический макулярный отек, идиопатический макулярный разрыв, витреомакулярный тракционный синдром (Столяренко Г.Е., 1988; Глинчук Я.И., 1994; Кисилев А.В., 2001; Federman J.L., 1994). В последнее время наибольший интерес исследователей привлекает изучение задних кортикальных слоев стекловидного тела (ЗКС СТ), так как общепризнано, что основным анатомическим объектом, на который направлено витреоретинальное воздействие при лечении перечисленных заболеваний, являются именно они (Махачева З.А., 1994; Лыскин П.В., 2007; Алпатов С.А., 2010; Michels R.G., 1945; Sebag J., 1992; Worst J. G., 1992).

Стандартом современной витрэктомии является выполнение полноценного трехпортального доступа, через который происходит удаление стекловидного тела (СТ), в том числе интактных его слоев вплоть до субтотальной витрэктомии, при этом наибольшую трудность представляет выделение и удаление ЗКС СТ от внутренней пограничной мембраны (ВПМ) сетчатки (Шишкин М.М., 2011; Pendergast S. D., 1999; Yuson R. M., 2009).

Методы отделения ЗКС СТ от ВПМ сетчатки можно разделить на два направления - механические и "фармакологический витреолизис" (Тахчиди Х.П., 2010; Gandorfer А., 2004; Sebag J., 2005, 2009).

При применении механических способов отделения ЗКС СТ частота ятрогенных осложнений колеблется в пределах от 12 до 69 % (Сдобникова С.В., 1997; Алпатов С.А., 2002; Тахчиди Х.П., 2002; Zinn K.M., 1982; Paques M., 1997; Park D., 1999).

Идеологией "фармакологического витреолизиса" является безоперационное ферментативное воздействие на область витреоретинального соединения (Шарафетдинов И.Х., 2002; Лыскин П.В., 2009; Quiroz H., 1984; Trese M., 2000;Tanaka M., 2006;Sebag J., 2009). Выполненные экспериментальные исследования по изучению возможности применения ряда ферментов (хондроитиназы, гиалуронидазы, диспазы и других) продемонстрировали перспективность этого направления, как наиболее безопасного с точки зрения достижения индукции задней отслойки стекловидного тела (ЗОСТ). Однако, невысокая эффективность результатов выдвигает задачи поиска новых, более адаптированных для данной цели, ферментативных препаратов (Yao X.Y., 1992; Kuppermann B.D., 2001; Jorge R., 2003). стекловидный витрэктомия ферментативный

Последние годы внимание зарубежных исследователей привлечено к плазмину, а точнее - к его модифицированной форме под названием микроплазмин (Hehkin J., 1992; Verstraeten T. C., 1993; Unal M., 2000). По ряду сообщений интравитреальное введение микроплазмина и его воздействие на содержащиеся в витреоретинальном соединении гликопротеиды, фибронектин и ламинин приводят к ослаблению адгезии ЗКС СТ и ВПМ сетчатки, возникновению ЗОСТ в условиях эксперимента в 100% случаев (Gandorfer А., 2004; Toshiro Sakuma, 2005; Benz M.S., 2010).

Российскими учеными в ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России была получена новая оригинальная рекомбинатная форма модифицированного плазмина (патент на изобретение № 2432396 от 27.10.2011), которая была названа миниплазмином.

Цель настоящего исследования - экспериментально-морфологическое обоснование применения ферментативной индукции задней отслойки стекловидного тела с помощью миниплазмина.

Задачи исследования:

1. Определить возможность использования миниплазмина для индукции задней отслойки стекловидного тела.

2. Теоретически обосновать, рассчитать и лабораторно подтвердить время максимальной амидолитической активности дозы миниплазмина, вызывающей индукцию задней отслойки стекловидного тела в глазах экспериментальных животных in vivo.

3. Выявить влияние рассчитанной для индукции задней отслойки стекловидного тела дозы миниплазмина на витреоретинальное соединение в эксперименте ex vivo.

4. Определить оптимальную эффективную дозу миниплазмина для индукции задней отслойки стекловидного тела и время его экспозиции в эксперименте in vivo.

Научная новизна результатов исследования

1. Впервые установлено, что отечественный препарат миниплазмин в дозе 180 мкг при экспозиции 60 минут вызывает индукцию задней отслойки стекловидного тела в глазах экспериментальных животных ex vivo и in vivo и не оказывает токсического влияния на структуры глазного яблока.

2. Впервые доказано, что при интраокулярном введении миниплазмина сохраняется его максимальная амидолитическая активность в течение 60 минут.

3. Впервые доказано, что двукратное превышение установленной эффективной дозы миниплазмина вызывает развитие выраженных экссудативных явлений в глазах экспериментальных животных in vivo.

4. Впервые доказано, что ЗОСТ может индуцироваться при использовании миниплазмина в дозах 180 и 240 мкг, при этом на фоне идентичных морфо-структурных изменений витреоретинального интерфейса, функциональная активность сетчатки восстанавливается в 7 раз быстрее при использовании меньшей дозы.

Практическая значимость результатов работы

1. Доказано, что миниплазмин может быть использован в качестве индуктора задней отслойки стекловидного тела.

2. Проведенные исследования по использованию миниплазмина для ферментативного витреолизиса позволяют рекомендовать его к клинической апробации с целью уменьшения травматичности витреоретинальных вмешательств.

Основные положения, выносимые на защиту

Миниплазмин в дозе 180 мкг при времени экспозиции 60 минут вызывает заднюю отслойку стекловидного тела в глазах экспериментальных животных ex vivo и in vivo, при этом сохраняется его максимальная амидолитическая активность и не оказывается токсическое воздействие на структуры глазного яблока.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов "Актуальные проблемы офтальмологии" (Москва, 2011), IX Научно-практической конференции "Современные технологии лечения витреоретинальной патологии-2011" (Москва, 2011), научно-клинической конференции ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России, совместно с кафедрой глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Едокимова (Москва, 2012), X научно-практической конференции с международным участием "Современные технологии лечения витреоретинальной патологии-2012" (Москва, 2012), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Федоровские чтения-2012" (Москва, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 4 - в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Подана заявка на патент РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 100-а листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы излагающей материалы и методы исследования, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 39-ью рисунками, содержит одну таблицу. Указатель литературы включает 175 источников, из них 41- отечественный и 134 - зарубежных.

Работа выполнена на кафедре глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Едокимова, на базе ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России (генеральный директор - д.м.н., проф. Чухраёв А.М.) при участии к.м.н. Шкворченко Д.О. и к.м.н. Шарафетдинова И.Х.

Препарат миниплазмин для индукции задней отслойки стекловидного тела предоставлен ФГБУ "РКНПК" Минздрава России (руководитель лаборатории генной инженерии Бибилашвили Р.Ш. и ст.н.с. Скрыпина Н.А.).

Морфологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза (зав. лабораторией - к.м.н. Шацких А.В.) и глазного тканевого банка (заведующая - Тонаева Х.Д.) Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России (заведующий - д.м.н. Борзенок С.А.), на базе лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России (зав. лабораторией - д.м.н. Диденко Л.В.).

Экспериментальные исследования на кроликах породы шиншилла выполнены на базе Калужского филиала ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России (директор к.м.н. - Терещенко А.В.) при поддержке д.м.н., проф. Белого Ю.А.

Содержание работы

Диссертация носит экспериментальный характер, представляет собой доклинические испытания отечественного препарата миниплазмин.

Миниплазмин - рекомбинантный полипептид со свойствами плазминогена человека, способный превращаться при активации в миниплазмин (Белогуров А.А, Бибилашвили Р.Ш. Гурский Я.Г., Минашкин М.М., Скамров А.В. Скрыпина Н.А., 2011).

От имеющегося зарубежного аналога микроплазмина (Sebag J., 2005), миниплазмин отличается строением молекулы и молекулярной массой. Миниплазмин имеет активный центр и крингл-домен с молекулярной массой 38800 Да, а микроплазмин только активный центр с молекулярной массой 27300Да. Миниплазмин, как и микроплазмин, гидролизирует гликопротеиды, фибронектин и ламинин, которые определяют прочность витреоретинального соединения, выполняя роль "цемента" (Kohno T., 1987; Scheiffarth O. F., 1988).

Материал и методы исследования

Работа базируется на анализе морфоструктурных особенностей 10-ти свежих изолированных свиных глаз и 28-ми глаз опытных животных (кролики породы Шиншилла весом от 2,0 до 3,5 кг в возрасте 4 - 6 месяцев), в которые вводились различные дозы миниплазмина. Парные глаза служили контролем с введением в них физиологического раствора. Амидолитическую активность препарата миниплазмин изучали на 8-ми глазах 4-х кроликов.

Глаза животных выведенных из эксперимента на разных сроках, подвергались морфологическим методам исследования, включающим световую микроскопию (СМ) и сканирующую электронную микроскопию (СЭМ).

Рассчет эффективной дозы миниплазмина

По данным зарубежных исследований эффективная доза микроплазмина рассчитана, подтверждена и составляет 125 мкг при экспозиции 60 мин (Marc D. de Smet, 2009). Различия в строении препаратов не позволяют использовать дозу и время экспозиции, рассчитанные для микроплазмина. В проводимом нами исследовании экспериментальная доза миниплазмина рассчитывалась по формуле:

С 1- искомая доза миниплазмина

С 2- эффективная доза микроплазмина (125 мкг)

М 1- молекулярная масса миниплазмина (38800 Да)

М 2- молекулярная масса микроплазмина (27300 Да)

С 2- эффективная доза микроплазмина, равная 125 мкг.

Согласно проведенным расчетам эффективная доза миниплазмина составила:

Определение амидолитической активности препарата миниплазмина в полости стекловидного тела кролика in vivo

Для определения активности миниплазмина использовали амидолитический метод. Эксперимент проводили на лабораторных животных in vivo (4 кролика - 8 глаз). В опытные глаза (OD) вводили миниплазмин в количестве 180 мкг (100 мкл раствора с концентрацией 1,8 мг/мл), в два контрольных глаза (OS) вводили физиологический раствор, из двух других контрольных глаз (OS) однократно были взяты фрагменты интактного СТ в качестве нулевого контроля. Далее через 15, 30, 45, 60, 120 мин, 24 часа, брали фрагменты стекловидного тела с помощью инсулинового шприца с инсулиновой иглой 27 G. Пробы (50 мкл жидкости) немедленно замораживали в жидком азоте и хранили до исследования, которое выполнялось на приборе UV-1601PC, SHIMADZU (Япония) при t = - 200С.

Структура эксперимента

Первая серия экспериментов ex vivo была выполнена на 5-ти парах свежих изолированных свиных глаз. Время от момента забоя до энуклеации составило 3010 мин, время от момента смерти до эксперимента - 6010 мин. Глаза были распределены в две группы (по одному из каждой пары). В опытные, правые, глаза интравитреально в 3 мм от лимба в срединные отделы СТ вводили миниплазмин в дозе 180 мкг в объеме 0,1 мл, в контрольные, левые - физиологический раствор. Затем глаза инкубировали в термостате при температуре 370С в течение 60 мин. По завершению эксперимента глаза погружали в жидкий азот на 10 мин, далее производили раскол глазных яблок с дальнейшим высушиванием в критической точке и выполняли сканирующую электронную микроскопию поверхности сетчатки (СЭМ), предварительно делая макроснимки полученных образцов.

Вторая серия экспериментов in vivo по определению оптимальной эффективной дозы и времени экспозиции миниплазмина для индукции ЗОСТ, была выполнена на 56-ти глазах 28-ми кроликов (табл. 1). Контролем служили парные глаза (OS), в которые интравитреально вводили аналогичное количество физиологического раствора.

Для оценки структур глаза в динамике, до и после интравитреального введения миниплазмина, всем кроликам через 15, 30, 60, 120 мин и одни сутки после начала эксперимента выполняли биомикроскопию с помощью щелевой лампы фирмы "Opton" (ФРГ), осмотр глазного дна методом бесконтактной офтальмоскопии с помощью асферических линз "Ocular MaxField" (США) силой 78 и 90 диоптрий, фотографирование глаз, ультразвуковое офтальмосканирование (В-сканирование) с помощью аппарата "Humphrey" (США), оптическую когерентную томографию (ОКТ) с помощью прибора "Stratus OCT 3000" (Carl Zeiss Meditech Inc., Германия) с программным обеспечением версия 4.0.4. Электроретинографические исследования проводились на системе "Tomey" (Япония).

Таблица 1

Распределение материала по группам исследования

№ группы	Вводимая доза миниплазмина	Количество кроликов (глаз)	Сроки выведения из эксперимента
1	OD - 65 мкг	3(6)	7 суток
	OS - физ. р-р
2	OD - 100 мкг	3(6)	7 суток
	OS - физ. р-р
3	OD - 125 мкг	3(6)	7 суток
	OS - физ. р-р
4	OD - 180 мкг	11(22)	1, 7 суток, 6 месяцев
	OS - физ. р-р
5	OD - 240 мкг	5(10)	7 суток
	OS - физ. р-р
6	OD - 360 мкг	3(6)	1 сутки
	OS - физ. р-р

Одним из методов оценки возникновения ЗОСТ являлось интраоперационное субъективное определение легкости отделения ЗКС СТ от ВПМ через 12 часов после введения препарата.

Для СМ глаза животных, выведенных из эксперимента, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Далее выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином и по методике Ван Гизона. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DMLВ 2 (Германия) при х 50, х 100, х 200, х 400-кратном увеличении с последующим фотографированием.

Для СЭМ глазные яблоки экспериментальных животных фиксировали 24 часа при температуре 40С. В состав фиксатора входили 2% парафармальдегид и 2,5% глютаральдегид на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4. Предварительно выполняли надрезы склеры острым лезвием до сосудистой оболочки в 3 мм от лимба с сохранением всех структур глазного яблока. После фиксатора глазные яблоки разрезали на две одинаковые половины через диск зрительного нерва острым лезвием. Далее препараты обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, напыляли золотом толщиной 6 нм и изучали полученные образцы при помощи СЭМ Quanta 200 3D.

Результаты лабораторных исследований

Динамика зависимости активности миниплазмина от времени его нахождения в глазу отображена в двух графиках: от начала эксперимента до 120 мин (рис. 1) и от начала эксперимента до 1 суток (рис. 2).

Рис. 1. Показатель активности миниплазмина после введения в СТ кролика в сроки от начала эксперимента до 120 мин



Рис. 2. Показатель активности миниплазмина после введения в СТ кролика в течение первых суток эксперимента

Методом амидолитической активности миниплазмина в динамике было установлено, что доза миниплазмина 180 мкг, введенная в стекловидное тело опытных глаз лабораторных животных, проявляет свою максимальную активность в промежутке от 15 до 60 мин.

В течение первых 60 мин миниплазмин теряет активность на 80%, с 0,28 до 0,05 усл ед акт. Далее, при динамическом наблюдении, в течение первых суток, активность миниплазмина падает практически до нуля. В контрольных глазах пробы были абсолютно неактивны на протяжении всего эксперимента.

Таким образом, основное действие фермент способен оказывать в течение первого часа действия.

Результаты экспериментальных исследований на свиных глазах ex vivo

После интравитреального введения миниплазмина в 10 изолированных свиных глаз при макропрепарировании стали видны внешние отличия в опытных образцах: просматривалось отстояние СТ от поверхности сетчатки и его деструктуризация. Волокна СТ были расположены рыхло, с увеличенными промежутками между ними. В контрольных, парных, глазах, отмечалось полное прилежание задних кортикальных слоев стекловидного тела к сетчатке с сохранением витреоретинального соединения.

По структуре стекловидное тело после интравитреального введения миниплазмина, по сравнению с контрольной группой, имело разряженную структуру.

По данным СЭМ определялось, что опытная группа отличается от контрольной сглаженностью рельефа поверхности сетчатки и отсутствием на ней волокон стекловидного тела, что свидетельствовало о полном отслоении ЗКС СТ.

Результаты эксперимента in vivo

Результаты объективных методов исследований. При осмотре опытных глаз с введенной дозой миниплазмина в 1 - 5 группах (от 65 до 240 мкг) и парных контрольных глаз, в первые сутки наблюдали незначительную смешанную инъекцию сосудов глазного яблока в месте склерального прокола, полностью проходившую на 3-ьи сутки. Роговица оставалась прозрачной на протяжении всего исследования. В течение всего периода наблюдения во всех глазах передняя камера была равномерной, средней глубины, водянистая влага прозрачной, сохранялась живая реакция зрачка на свет, а также обычные цвет и структура радужной оболочки. Хрусталики были прозрачными, рефлекс с глазного дна розовым. Диск зрительного нерва, сосуды сетчатки и хориоидеи, а также собственно внутренние оболочки заднего отдела глаза были без видимых патологических изменений.

В 6-й группе с интравитреальным введением миниплазмина в дозе 360 мкг на первые сутки в опытных глазах наблюдали смешанную инъекцую конъюнктивы, отек эпителия роговицы, экссудат в передней камере, глазное дно не офтальмоскопировалось, что соответствовало картине выраженной экссудативной реакции. При этом контрольные глаза оставались спокойными. Было принято решение не пролонгировать эксперимент. Животные были выведены из эксперимента.

Результаты инструментальных методов исследований.

В 1-ой и во 2-ой группах, в которых доза интравитреального введения миниплазмина составляла 65 и 100 мкг - ЗОСТ не была выявлена на протяжении всего времени эксперимента (7 суток).

В опытных глазах 3-ей группы с дозой интравитреального введения миниплазмина 125 мкг, в отличие от контроля, через 60 мин выявлялась частичная ЗОСТ, без динамики в течении последующих 7-ми суток.

В 4-й и 5-й группах с дозой интравитреального введения миниплазмина 180, 240 мкг соответственно определялась полная ЗОСТ через 60 мин, подтвержденная результатами В-сканирования и ОКТ, где просматривалась четкая линия отслоения кортикальных слоев СТ. Динамическое наблюдение показало стабильность полученного результата в обеих группах на протяжении всего времени эксперимента, как в ранние сроки наблюдения (7 суток), так и в отдаленные сроки (6 месяцев). При этом высота ЗОСТ оставалась неизменной.

В 6-й группе с дозой интравитреального введения миниплазмина 360 мкг до выведения животных из эксперимента также была установлена полная ЗОСТ через 60 мин после введения препарата.

Экссудативные явления, проявились только в группе с дозой 360 мкг.

Из двух доз 180 и 240 мкг, вызывающих полную ЗОСТ, было решено выбрать, как оптимально эффективную, меньшую из них - 180 мкг.

Результаты интраоперационного метода исследования

Интраоперационный метод исследования включал выполнение витрэктомии на 8-ми глазах 4-х кроликов. Витрэктомию выполняли на 1-ые сутки после интравитреального введения миниплазмина в опытные, правые, глаза в дозе 180 мкг, и на парном глазу - на первые сутки после введения физиологическго раствора.

Операцию начинали с установки двух портов 27 G. Один порт предназначался для инфузионной системы, второй - для входа эндовитреальных инструментов. Далее выполняли срединную витрэктомию, после чего вводили краситель Кеналог-40 для окраски СТ. На опытных глазах было видно окрашенное СТ, отстоящие от поверхности сетчатки, которое с помощью реза и аспирации витреотома свободно удалялось. Повторное введение Кеналог-40 демонстрировало отслойку волокон СТ от поверхности сетчатки.

В отличие от опытных, в контрольных глазах, после оседания частиц Кеналог-40 было видно, что СТ лежит на поверхности сетчатки. Для его удаления витреотомом понадобились аспирационно-тракционные усилия с использованием 300-500 мм рт ст, что демонстрировало отсутствие ЗОСТ.

Результаты электрофизиологичеких исследований

ЭРГ выполнялась через 10 мин, 1 час, 24 часа, а так же на 4-е и 7-е сутки после начала эксперимента.

Отсутствие токсического воздействия миниплазмина на сетчатку глаз экспериментальных животных было отмечено во всех группах с дозой препарата до 240 мкг.

Анализ динамики общей ЭРГ глаз кроликов после введения 180 и 240 мкг миниплазмина показал изменения амплитуды "а" и "b" - волн. В первые 10 мин после начала эксперимента регистрировалась субнормальная ЭРГ у животных в обеих группах. В глазах с интравитреальным введением миниплазмина в дозе 180 мкг наблюдалась тенденция к увеличению амплитуды "а" и "b"-волн ЭРГ с полным восстановлением амплитуды "а"-волны уже через час после начала эксперимента и полным восстановлением электрической активности сетчатки в первые сутки после введения препарата. В глазах с интравитреальным введением миниплазмина в дозе 240 мкг при исследовании в динамике отмечалось незначительное увеличение амплитуды ответа, с восстановлением амплитуды "а"-волны в первые 24 часа после введения препарата. Полное восстановление функций сетчатки происходило лишь на 7-е сутки.

Таким образом, полное восстановление электрической активности сетчатки происходило в обеих рассматриваемых группах. Однако, более быстрое восстановление функций сетчатки было отмечено в группе, где доза эндовитреально введенного препарата была 180 мкг миниплазмина, что подтвердило целесообразность использования в клинических исследованиях именно этой дозы.

Результаты световой микроскопии. В 1-ой и во 2-ой группах, где введенные интравитреально дозы миниплазмина были 65 и 100 мкг соответственно, была отмечена схожая картина гистологических срезов. Ни в одном из срезов не просматривалось отслойка ЗКС СТ от поверхности сетчатки, аналогично контролю.

Гистологически в 3-й группе, с интравитреальным введением миниплазмина в дозе 125 мкг, наблюдалось частичное отслоение ЗКС СТ с сохранением структуры сетчатой оболочки. В контроле витреоретинальный интерфейс оставался без изменений.

В 4-й и 5-й группах с интравитреальным введением миниплазмина в дозах 180 и 240 мкг соответственно, на гистологических срезах просматривалось полное отслоение ЗКС СТ.

При гистологическом исследовании глаз 6-ой опытной группы (360 мкг миниплазмина) клинические экссудативные явления были подтверждены морфологически. Наблюдали субтотальную ферментативную деструкцию стекловидного тела, индуцированную миниплазмином, с сохранением только передних слоев СТ, приближенных к хрусталику. В витреальной полости имелись скопления фибринозного экссудата с умеренной воспалительной клеточной инфильтрацией, представленной, в основном, моноцитами и единичными эозинофилами. Воспалительных явлений в других структурах глаза и зрительном нерве не было обнаружено. Отмечена отечность внутренних оболочек глазного яблока с застойными явлениями в сосудах хориоидеи. Несмотря на это, структура сетчатки оставалась сохранной, как в отношении клеток, так и в отношении архитектоники ее слоев.

Результаты сканирующей электронной микроскопии.

По результатам СЭМ структура стекловидного тела на поверхности сетчатки 1-ой (65 мкг) и 2-ой (100 мкг) групп имела незначительные отличия от интактного СТ. При использовании малых доз миниплазмина было отмечено лишь появление мелких щелевидных пространств в структуре СТ.

В 3-ей группе (125 мг) явления частичной ЗОСТ при СЭМ были представлены фрагментарным освобождением сетчатки от ЗКС СТ. Кроме того, в остатках СТ прослеживалось изменение его структуры: оно было менее компактным, его волокна были истончены.

Увеличение дозы миниплазмина до 180 мкг и выше (4-ая и 5-ая группа) привело к полному освобождению внутренней поверхности центральных отделов сетчатки от волокон ЗКС СТ. При этом не было обнаружено изменений поверхности самой сетчатки.

Выводы

1. Миниплазмин может быть использован при ферментативном витреолизисе для индукции задней отслойки стекловидного тела.

2. Эффективной дозой миниплазмина, не оказывающей токсического влияния на глаза экспериментальных животных in vivo и вызывающей заднюю отслойку стекловидного тела является 180 мкг при экспозиции 60 мин.

3. Восстановление функциональной активности сетчатки в глазах при интравитреальном введении миниплазмина в дозах 180 и 240 мкг, вызывающих идентичные морфо-структурные изменения витреоретинального интерфейса происходит в 7 раз быстрее на фоне использования меньшей дозы.

4. Максимальная амидолитическая активность миниплазмина при интравитреальном введении сохраняется в течение первых 60 минут.

5. Двукратное превышение установленной эффективной дозы миниплазмина (360 мкг) вызывает развитие выраженных экссудативных явлений в глазах экспериментальных животных.

Практические рекомендации

1. Миниплазмин в дозе 180 мкг с экспозицией 60 минут может использоваться в качестве индуктора задней отслойки стекловидного тела.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Новиков С.В., Шацких А.В., Норман К.С.. Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела. // Современные технологии лечения витреоретинальной патологии: Научно-практ. конф.: Материалы. - М., 2012. - С. 202-204.

2. Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Шацких А.В., Огородникова С.Н., Новиков С.В., Узунян Д.Г., Норман К.С. Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела на кроличьих глазах in vivo. // Х Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. Федоровские чтения - 2012. - М., 2012. - С. 152-153.

3. Шарафетдинов И.Х., Норман К.С., Новиков С.В., Узунян Д.Г., Огородникова С.Н. Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела. // Практическая медицина. - 2012. - № 4(59) 2012. - С. 146-148.

4. Норман К.С., Тахчиди Х.П., Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Новиков С.В., Шацких А.В. Первый опыт использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела на глазах экспериментальных животных. // Актуальные прблемы офтальмологии: Сборник научных работ. - М. 2011. - С. 201-202.

5. Тахчиди Х.П., Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Новиков С.В., Шацких А.В., Норман К.С. Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела (предварительное сообщение). // Современные технологии лечения витреоретинальной патологии: Научно-практ. конф.: Материалы. - М., 2011. - С. 164-166.

6. Тахчиди Х.П., Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Норман К.С. Роль витреоретинального соединения в патологии заднего отрезка глаза и способы отделения задних гиалоидных слоев стекловидного тела // Офтальмохирургия. - 2011. - № 3. - С. 84-88.

7. Тахчиди Х.П., Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Шацких А.В., Норман К.С. Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела // ВЕСТНИК ОГУ. - 2011. - № 14(133). - С. 363-366.

8. Тахчиди Х.П., Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Шацких А.В., Норман К.С. Экспериментальное обоснование использования миниплазмина с целью индукции задней отслойки стекловидного тела // Научные ведомости Бел ГУ. - 2011. - №16(111). - С. 194-198.

Патенты РФ на изобретения по теме диссертации

Шкворченко Д.О., Шарафетдинов И.Х., Новиков С.В., Шацких А.В., Норман К.С. Способ индукции задней отслойки стекловидного тела с помощью миниплазмина. Заявка № 2011134578/14(051219), дата подачи заявки 18.08.2011

Биографические данные

Норман Кирилл Сергеевич, 1984 года рождения, в 2007 году окончил Курский государственный медицинский университет, по специальности "лечебное дело". С 2007 по 2009 год проходил обучение в клинической ординатуре по специальности "офтальмология" на базе ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России. С 2009 по 2012 год обучался в очной аспирантуре на базе ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России.

Размещено на Allbest.ru