Главная
Коллекция "Otherreferats"
Медицина
Экспериментальная модель фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки
Экспериментальная модель фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки
Анализ клинико-функциональных особенностей сосудистой окклюзии на фотоиндуцированной и лазеркоагуляционной моделях тромбоза ветви вены сетчатки. Определение динамики иммунноэкспрессии в тканях сетчатки. Изучение сроков появления неоваскуляризации.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 02.08.2018 |
| Размер файла | 48,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Калужский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и Московского государственного медико-стоматологического университета
На правах рукописи
Автореферат
диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Экспериментальная модель фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки
14.01.07 - глазные болезни
Велибекова Диляра Сейфидиновна
Москва - 2012
Работа выполнена на базе Калужского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и Московского государственного медико-стоматологического университета
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Белый Юрий Александрович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Акопян Владимир Сергеевич
доктор медицинских наук, профессор Обрубов Сергей Анатольевич
Ведущее учреждение: ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России
Защита состоится 2012 года на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59А)
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
Автореферат разослан 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.В. Агафонова.
Список сокращений
ВЦВС - ветвь центральной вены сетчатки (клинический термин, соответствующий анатомическому термину - приток центральной вены сетчатки)
ДЗН - диск зрительного нерва
ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия
ЛИ - лазерное излучение
ЛКС - лазерная коагуляция сетчатки
ОКТ - оптическая когерентная томография
ФАГ - флюоресцентная ангиография
ФДТ - фотодинамическая терапия
ФС - фотосенсибилизатор
ЦВС - центральная вена сетчатки
ЭРГ - электроретинография
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Тромбозы центральной вены сетчатки (ЦВС) и ее ветвей являются одной из распространенных и прогностически неблагоприятных форм окклюзионных сосудистых поражений органа зрения. Они занимают второе место по тяжести поражений в структуре сосудистой глазной патологии после диабетической ретинопатии и приводят к стойкому снижению зрительных функций и инвалидизации пациентов (Никольская В.В., 1987; Кацнельсон Л.А., 1996; Либман Е.С., 2000; Alghadyon A.A., 1993; Scott I.U., 2009; Rogers S. et al, 2010).
По данным ряда авторов, примерно 16,4 миллиона взрослого населения имеют данную патологию, из них у 2,5 миллионов - тромбоз ЦВС, а у 13,9 миллионов - тромбоз ее ветвей (Rogers S. et al, 2010). Распространенность тромбозов ретинальных вен составляет 2,14 на 1000 человек старше 40 лет и 5,6 случаев на 1000 человек старше 64 лет (R.David et al, 1988). Возраст больных с окклюзией вен сетчатки варьирует в диапазоне 14-92 года, составляя в среднем 63 года (Малаян А.С., 1999; Hayreh S.S. et al, 1994).
Как известно, в патогенезе заболевания ключевую роль играют процессы патологического ангиогенеза, развивающиеся в результате дисбаланса между проангиогенными и антиангиогенными факторами (Тарковская А.И., 1981; Кацнельсон Л.А., 1990; Silva R.M., 1995; David R.P., 2003).
Поэтому так актуален вопрос создания экспериментальной адекватной естественному течению заболевания модели, с помощью которой возможно полноценное изучение вопросов патогенеза данной патологии и отработка способов ее лечения.
До сих пор экспериментальные модели тромбоза ветвей ЦВС получают, как правило, с помощью высокоинтенсивной лазеркоагуляции. Однако в ходе лазерного воздействия происходит разрушение всех слоев сосудистой стенки, что противоречит естественному течению заболевания, при котором, как известно, нарушение целостности сосудистой стенки является лишь вторичным моментом, а первичным считается формирование тромба (Kohner E.M., 1970, Hamilton A.M., 1979, Hayreh S.S., 1986).
Именно этот принципиальный недостаток лазеркоагуляционных моделей значительно снижает возможность их использования в решении существующих проблем и оставляет актуальным создание новых моделей тромбоза ветвей ЦВС.
В этой связи следует отметить возрастающий интерес офтальмологов к фотодинамическому воздействию, оказывающему выраженное цитотоксическое и антипролиферативное действие на биологические мембраны, вследствие светоиндуцированной реакции активизации фотосенсибилизатора (Каплан М.А., 1993; Странадко Е.Ф, 1999; Dougherty T.J., 1998).
Основным преимуществом фотодинамического воздействия перед другими энергетическими методами является его способность осуществлять целенаправленное, дозированное повреждение тканей с достижением избирательной окклюзии сосудов за счет фототоксического повреждения клеток их эндотелия, приводящего к стазу и агрегации клеток крови с последующей окклюзией сосуда (Черняева Е.Б., 1990; Меерович И.Г., 2004; Kessel D., 1997; Mori K., 1999).
Первые публикации, описывающие фотоиндуцированную модель тромбозов ветвей вен сетчатки у экспериментальных животных (приматов, крыс, свиней), появились в конце прошлого столетия. В ходе экспериментов использовался фотосенсибилизатор (ФС) из группы фталоцианинов (бенгальский розовый). Однако этот ФС применим только в сочетании с высокоинтенсивными лазерами, недостатком которых при создании моделей тромбоза ветви ЦВС является разрушительное воздействие на сосуды и ткани сетчатки (Wilson C., 1991; Danis R., 1993; Shen W., 1996).
На сегодняшний день ни у кого уже не вызывает сомнений тот факт, что в проведении фотодинамического воздействия принципиальным является выбор фотосенсибилизатора (ФС), применяемого в сочетании с лазером, не вызывающим разрушения сосудистой стенки (Пономарев Г.В., 1999; Белый Ю.А., 2007; Mori K., 1999; Allisson B., 2004).
К таким ФС может быть отнесен отечественный ФС хлоринового ряда «Фотодитазин», являющийся производным бис-N-метилглюкаминовой соли хлорина e6 и превосходящий практически по всем характеристикам известные зарубежные и отечественные аналоги. Этот препарат обладает интенсивной полосой поглощения в длинноволновой области видимого спектра с максимумом 662 нм, что соответствует области наибольшей оптической прозрачности для биологических тканей и обеспечивает, таким образом, большую глубину проникновения лазерного излучения. Для «Фотодитазина» характерны значительная фотохимическая активность при малых дозах ФС (0,8 мг/кг), квантовый выход синглетного кислорода 75%, низкая темновая и световая токсичность и высокий индекс контрастности накопления 8:1 (Каплан М.А., 2004; Белый Ю.А., 2005-2006; Володин П.Л., 2008).
На базе Калужского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» имеется значительный экспериментальный и клинический материал по изучению эффективности фотодинамического воздействия с использованием «Фотодитазина», в том числе при экспериментальном моделировании различной офтальмопатологии, в ходе которых наблюдался фототромбоз сосудов в месте воздействия, однако клинические и морфологические проявления полученного тромбоза описаны не были (Белый Ю.А., 2004-2010; Володин П.Л., 2008; Терещенко А.В., 2008; Федотова М.В., 2010; Иванов А.М., 2011). Накопленный к сегодняшнему дню опыт и полученные результаты были положены в основу настоящего исследования и определили его цель, направленную на расширение рамок применения данного метода в офтальмологии.
Цель исследования - разработать и обосновать в эксперименте фотоиндуцированную модель тромбоза ветви центральной вены сетчатки.
Для реализации поставленной цели задачи решались в следующей последовательности:
1. Разработать фотоиндуцированную модель тромбоза ветви ЦВС посредством фотодинамического воздействия с использованием отечественного ФС хлоринового ряда «Фотодитазин».
2. Провести сравнительный анализ клинико-функциональных особенностей сосудистой окклюзии на фотоиндуцированной и лазеркоагуляционной моделях тромбоза ветви ЦВС.
3. Провести сравнительный морфологический анализ механизмов тромбообразования на фотоиндуцированной и лазеркоагуляционной моделях тромбоза ветви ЦВС.
4. На модели фотоиндуцированного тромбоза ветви ЦВС определить динамику иммунноэкспрессии VEGF в тканях сетчатки и установить сроки появления неоваскуляризации.
Научная новизна
1. Впервые клинически и морфологически доказано, что фотодинамическое воздействие при плотности энергии 200 Дж/см2 с использованием отечественного фотосензибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин» в дозе 2,4 мг/кг нарушает процесс гемодинамики и вызывает развитие тромбоза ветвей ЦВС экспериментального животного (кролика) с вовлечением в процесс только эндотелиальных структур сосудистой стенки.
2. Впервые установлен факт формирования абсолютной сосудистой окклюзии на фотодинамической модели тромбоза ветви ЦВС с соответствующей острой клинической картиной заболевания в отличие от лазеркоагуляционной модели, на которой отмечается частичное сохранение кровотока и постепенное развитие клинической картины.
3. Метод лазерной допплеровской флоуметрии, усовершенствованный при помощи разработанной специальной насадки, впервые применен интраокулярно, что позволило в эксперименте оценить особенности хориоретинального кровотока при моделировании тромбоза ветви ЦВС.
4. Впервые на фотодинамической модели тромбоза ветви ЦВС установлено динамическое повышение VEGF с достижением максимальных значений ко 2-м суткам и начало формирования новообразованных сосудов с 3-го дня эксперимента.
Практическая значимость
1. Впервые, посредством фотодинамического воздействия с использованием отечественного ФС хлоринового ряда «Фотодитазин», разработана и патогенетически обоснована модель фотоиндуцированного тромбоза ветви вены сетчатки с вовлечением в процесс только эндотелиальных структур сосудистой стенки и динамическим формированием тромба с соответствующей клинической и морфологической картиной заболевания с получением абсолютной сосудистой окклюзии в месте воздействия.
2. Использование в экспериментальной офтальмологии фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС с учетом выявленных особенностей динамики VEGF и сроков появления роста новообразованных сосудов поможет в оценке эффективности существующих и разработке новых методик его лечения.
3. Усовершенствованный метод ЛДФ с разработанной насадкой для интраокулярного применения служит дополнительным инструментальным методом оценки особенностей ретинального кровотока в экспериментальной офтальмологии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Фотодинамическое воздействие при плотности энергии 200 Дж/cм2 с использованием отечественного фотосенсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин» в дозе 2,4 мг/кг обеспечивает создание единственной на сегодняшний день экспериментальной фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС с повреждением только эндотелиальных структур сосудистой стенки, динамическим формированием тромба и последующей абсолютной окклюзией сосуда с соответствующей клинической и морфологической картиной.
2. На разработанной фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС появлению новообразованных сосудов на 3-и сутки эксперимента предшествует накопление эндотелиального сосудистого фактора роста VEGF с достижением максимальных значений через 48 часов после фотодинамического воздействия и сохранением стабильно высокого его уровня на протяжении всего срока наблюдения (до 30 суток).
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции по офтальмологии «Запад-Восток» (Уфа, 2010); «Актуальные проблемы в офтальмологии» (Москва, 2010);.«Высокие технологии в офтальмологии» (Анапа, 2010); «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии» (Москва, 2011); «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2011); IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения-2011» (Москва, 2011).
Формы внедрения
Результаты исследования изложены в докладах на научно-практических конференциях и публикациях, включены в тематику лекций научно-педагогического центра ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза имени акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 4 в журналах, рецензируемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 109-ти страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 29-ю рисунками, содержит 3 таблицы. Указатель литературы включает 232 источника, из них 61- отечественный и 171 - зарубежный.
Работа выполнена в Калужском филиале ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России (директор - к.м.н. Терещенко А.В.) под руководством д.м.н., профессора Белого Ю.А. Морфологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России при непосредственном участии заведующей, к.м.н. Шацких А.В. Иммуногистохимические исследования проведены на базе группы нейрогенетики и генетики развития ФГБУ Института Биологии гена РАН (директор - д.б.н., проф. Георгиев П.Г) при участии старшего научного сотрудника, к.б.н. Ревищина А.В.
Содержание работы
Материалы исследования
Эксперимент по созданию фотоиндуцированного тромбоза ветви ЦВС с проведением анализа клинико-функциональных особенностей сосудистой окклюзии и морфологического изучения механизма тромбообразования выполнен на 21-м глазу 21-го кролика породы шиншилла весом 1,5-2,0 кг (парные глаза тех же кроликов использовались в качестве интактного контроля). Разработанная модель фотоиндуцированного тромбоза вены сетчатки изучена в сравнении с лазеркоагуляционной моделью тромбоза ветви ЦВС на 21-м глазу 21-го кролика породы шиншилла весом 1,5-2.0 кг (парные глаза тех же кроликов использовались в качестве интактного контроля). Распределение материала в зависимости от сроков энуклеации представлено в таблице 1.
Таблица 1 Распределение материала исследования по срокам энуклеации
|
Моделирование фотоиндуцированного тромбоза ветви ЦВС 42 глаза (21 кролик) |
Моделирование лазериндуцированного тромбоза ветви ЦВС 42 глаза (21 кролик) |
||||
|
OD-опыт |
OS-контроль |
OD-опыт |
OS-контроль |
||
|
30 мин |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
1-е сутки |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
2-е сутки |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
3-и сутки |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
7-е стуки |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
14-е сутки |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
30-е сутки |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
3 глаза |
|
|
Всего |
84 глаза (42 кролика) |
Моделирование тромбоза ветви ЦВС
Разработка фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС проведена на 21-м глазу 21-го кролика породы шиншилла весом 1,5-2,0 кг (1-я опытная группа). лазеркоагуляционный сетчатка окклюзия
В работе использован отечественный ФС хлоринового ряда «Фотодитазин», являющийся производным бис-N-метилглюкаминовой соли хлорина e6 со следующими характеристиками: длинноволновым пиком поглощения 662±2 нм, индексом контрастности накопления 8:1, высокой фотохимической активностью при малых дозах ФС (0,8 мг/кг), квантовым выходом синглетного кислорода 75%, низкой световой токсичностью (LD50 - 158 мг/кг веса при средней терапевтической дозе 0,8 мг/кг) и полным отсутствием темновой токсичности.
Фотодинамическое воздействие выполняли на лазерной установке, разработанной в Калужском филиале ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» совместно с фирмой «Алком-Медика» (Санкт-Петербург), представляющей собой лазерный офтальмо-микрохирургический комплекс, в состав которого входят диодный лазер «АЛОД-01» с длиной волны 662 нм, оснащенный приставкой (формирователем пятен) для транспупиллярного лазерного облучения ПФК-«АЛОД»-02«Алком», адаптированной на модифицированную щелевую лампу «Takagi SM-2N» (Япония); дополнительный видеоканал и высокочувствительная черно-белая видеокамера для формирования флуоресцентного изображения исследуемого участка глаза с системой переноса изображения на персональный компьютер с программным обеспечением для регистрации и обработки полученных изображений.
Используемые в работе параметры были получены в результате ранее проведенного комплекса экспериментальных работ по определению порога фотодинамического воздействия на структуры глаза кроликов, в которых было доказано, что использование ФС «Фотодитазин» и лазерного излучения с длиной волны 662 нм и плотностью энергии 200Дж/см2 является пороговым для сосудов сетчатки и приводит к развитию индуцированного фототромбоза в месте воздействия без повреждения фоторецепторов и клеток пигментного эпителия сетчатки (Ю.А. Белый, А.В. Терещенко, Каплан М.А., 2005) Однако в проведенных работах клинические и морфологические проявления полученного тромбоза описаны не были.
Фотодинамическое моделирование тромбоза ветви ЦВС осуществляли под общей анестезией, включавшей внутримышечные инъекции калипсола (6-8 мг/кг массы тела) и сибазона (0,2мг/кг массы тела). Животным 1-й опытной группы внутривенно болюсно вводили Фотодитазин в дозе 2,5 мг/кг веса. Через 15 мин, т.е. времени, достаточного для максимального накопления Фотодитазина в сосудах сетчатки по данным флюоресцентной диагностики (Белый Ю.А., 2006), транспупиллярно проводили лазерное облучение вены в месте ее выхода из диска зрительного нерва (ДЗН). Диаметр пятна лазерного излучения составлял 3,0 мм, что соответствует двум диаметрам ДЗН кролика.
Методика лазеркоагуляционного моделирования тромбоза ветви ЦВС выполнена на 21-м глазу 21-го кролика (2-я опытная группа) по стандартной методике на аргоновой лазерной установке «Ultima» с длиной волны 532нм (Kohncr E. M., 1970; Hamilton A.M., 1979; Danis R., 1993; Shen W., 1996) под общей анестезией, включающей внутримышечные инъекции калипсола в дозировке 6-8 мг/кг массы тела и сибазона - 0,2мг/кг массы тела. Лазерные коагуляты наносились последовательно на вену в месте выхода из ДЗН в количестве 30-40, пятном 200 мкм, экспозицией 0,15 нс, мощностью энергии 200-240 мВт до получения устойчивого спазма сосуда.
Сравнительный анализ клинико-функциональных особенностей сосудистой окклюзии на глазах экспериментальных животных (кроликов) с фотоиндуцированным и лазериндуцированным тромбозом ветви ЦВС
Методы исследования
Сравнительный анализ клинико-функциональных особенностей сосудистой окклюзии на обеих экспериментальных моделях тромбоза проводился через 30 мин, на 1-е, 2-е, 3-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки эксперимента.
Клинико-функциональные исследования включали: биомикроскопию переднего отрезка глаза на щелевой лампе фирмы «Opton» (Германия); офтальмоскопию с использованием бинокулярного офтальмоскопа фирмы «Heine» (Германия); оптическую когерентную томографию (ОКТ) на аппарате Stratus ОST-3000 фирмы «Zeiss» (Германия); фоторегистрацию изображений глазного дна с использованием диагностической ретинальной системы «Ret Cam-120» (США); электроретинографию (ЭРГ) на электродиагностической системе «Tomey» (Япония) с принятыми за норму следующими показателями: амплитуда a-волны - 51+5,6 мкВ, время - 15+1,5 мс и амплитуда b-волны - 125+15,1 мкВ, время - 36+1,7 мс (Юдина Н.Н., 2005); флюоресцентную ангиографию сосудов глазного дна (ФАГ) с фоторегистрацией глазного дна на фундус-камере «Canon CF-60UD» (фирмы Canon, Япония), оснащенной цифровой видеокамерой и системой архивации полученных изображений «САРИ» фирмы «Эком» (Санкт-Петербург, Россия). В качестве контрастного вещества использовался 0,1% раствор флюоресцеина натрия в дозе 25 мг/на кг веса животного.
Для подтверждения наличия сосудистой окклюзии в месте фотодинамического и лазеркоагуляционного воздействий применяли модифицированную методику лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) на приборе «ЛАКК - 02» (НПП «Лазма», Россия), позволяющую оценивать состояние хориоретинального кровотока над сетчаткой на капиллярном уровне. Измерения проводили с помощью специально разработанной насадки для интраокулярного введения диаметром 0,8 мм, которую вводили в витреальную полость исследуемого глаза через разрез в зоне проекции цилиарного тела и устанавливали бесконтактно в 0,3-0,4 мм от исследуемых точек. Время экспозиции для выполнения исследования составляло 5 секунд.
Результаты исследования
Сравнительный анализ клинико-функциональных особенностей сосудистой окклюзии на обеих экспериментальных моделях тромбоза ветви ЦВС показал, что уже в первые сутки после воздействия на глазах с фотоиндуцированной моделью тромбоза ветви ЦВС офтальмоскопически проявлялась острая картина тромбоза ветви вены сетчатки, достигавшая пика к третьему дню эксперимента. Тромбированная венозная ветвь была полнокровной, имела патологическую извитость, четкость, темную окраску. Отмечалось наличие микроаневризм, расширение капиллярной сети. Выше места окклюзии определялось запустевание пораженного сосуда. Все перечисленные признаки были характерны для клиники тромбоза ветви ЦВС.
Глаза с лазеркоагуляционной моделью тромбоза ветви вены сетчатки с первых дней после воздействия отличались скудностью офтальмоскопической картины, проявлявшейся в наличии небольших расширений и извитости поврежденного сосуда, а также единичных геморрагий, обусловленных разрушением мелких сосудов.
К 7-м суткам наблюдения на глазах с фотоиндуцированной моделью офтальмоскопически выявлялось рассасывание геморрагий и экстравазатов и уменьшение отека тканей, а к 14-му дню кровоизлияния частично рассасывались, однако отек сетчатки над пораженной аркадой и центральной зоной сохранялся. Что касается глаз с лазеркоагуляционной моделью, то на них по данным офтальмоскопии лишь на 7-е сутки была зафиксирована картина тромбоза с расширением, извитостью, нарушением кровотока в пораженном сосуде и кровоизлияниями вдоль пораженной вены, отеком сетчатки парапапиллярно (в зоне воздействия и в зоне проекции макулы).
К 14-му дню эксперимента кровоизлияния и отек сохранялись, отмечалось формирование атрофии зрительного нерва. На протяжении дальнейшего периода наблюдения офтальмоскопическая картина в обеих группах сохранялась без изменений.
Ангиографически на глазах с фотоиндуцированной моделью тромбоза ветви ЦВС уже к 3-му дню наблюдения определялось полное отсутствие контрастирования поврежденного сосуда. Одновременно отмечалось прокрашивание окружающих тканей, что указывало на отек сетчатки и появление темных зон ишемии сетчатки с формированием микроаневризм. Таким образом, данные ФАГ подтвердили формирование сосудистой окклюзии и тромбообразование на 3-и сутки после фотодинамического воздействия.
На глазах с лазеркоагуляционной моделью тромбоза ветви ЦВС на 7-е сутки эксперимента выявлялось пропитывание окружающих тканей флюоресцеином, нарушение целостности сосудистой стенки, формирование контуров сосуда и отсутствие его контрастирования, что не соответствовало механизму естественного тромбообразования, при котором формирование тромба первично, а кровоизлияние и нарушение целостности стенки сосуда вторично.
По данным ОКТ в 1-е сутки наблюдения на глазах с фотоиндуцированным тромбозом ветви вены сетчатки отмечалось увеличение толщины сетчатки на 60-70 мкм, определялись участки серозной отслойки нейроэпителия парапалиллярно, а также множественные преретинальные и интраретинальные кровоизлияния. В то же время на лазеркоагуляционных моделях выявлялось незначительное увеличение толщины сетчатки в парапапиллярной зоне на 10-20 мкм по сравнению с интактной сетчаткой, за счет диффузного отека. На 3-й день эксперимента на глазах с фотоиндуцированным тромбозом ветви ЦВС не обнаруживались зоны экссудативной отслойки нейроэпителия, однако диффузный отек сетчатки сохранялся (до 190 мкм). В тот же срок наблюдения на глазах с лазеркоагуляционным тромбозом ветви ЦВС определялась полная резорбция отека, и толщина сетчатки соответствовала толщине интактной сетчатки (до 132 мкм). На протяжении последующего периода наблюдения параметры ОКТ в обеих моделях носили тот же характер.
Согласно результатам ЭРГ на глазах с фотоиндуцированной моделью тромбоза ветви вены сетчатки наблюдалась тенденция к увеличению амплитуды «а» и «b»-волн с полным восстановлением электрической активности сетчатки на 14-е сутки. При этом на всех глазах с лазеркоагуляционной моделью тромбоза ветви ЦВС отмечалось незначительное увеличение амплитуды волн ЭРГ, однако полного восстановления функций сетчатки не происходило и на 14-е сутки определялось стойкое снижение амплитуды «а» и «b» волн ЭРГ, соответственно, на 60% и 55% относительно нормы.
В ходе проведения интраокулярной лазерной допплеровской флоуметрии было зафиксировано, что величина хориоретинального кровотока в интактной сетчатке в зоне выхода ретинальных сосудов из ДЗН составляет 40,73 + 2,65 пф. ед. (перфузионных единиц), а над ДЗН - 18,10 + 1,13 пф. ед. На глазах с фотоиндуцированным тромбозом ветви ЦВС хориоретинальный кровоток над ретинальными сосудами в месте фотодинамического воздействия отсутствовал, а в зоне интактной сетчатки над ДЗН компенсаторно усиливался, составляя 20,04+1,27 пф. ед. На глазах с лазеркоагуляционным тромбозом ветви ЦВС хориоретинальный кровоток над ретинальными сосудами в месте лазерного воздействия частично сохранялся, составляя 3,58±1,08 пф. ед., а в зоне интактной сетчатки над ДЗН также компенсаторно усиливался до 21,08±1,31 пф. ед. (таблица 2). Следует подчеркнуть, что результаты ЛДФ коррелировали с данными ФАГ, подтверждая образование сосудистой окклюзии в зоне фотодинамического воздействия без нарушения целостности сосудистой стенки.
Таблица 2 Сравнительный анализ результатов ЛДФ на экспериментальных моделях тромбоза вен ЦВС (М+r)
|
Зона измерения |
Интактная сетчатка |
Фотоиндуцированная модель тромбоза ветви ЦВС |
Лазеркоагуляционная модель тромбоза ветви ЦВС |
|
|
Точка 1 (над ДЗН) |
18,10±1,13 |
* 20,04±1,27 |
*3,58±1,08 |
|
|
Точка 2 (зона выхода ретинальных сосудов из ДЗН) |
40,73±2,65 |
* Не определяется |
*21,08±1,31 |
* Критерий Манна-Уитни, p < 0,05 - При проведении сравнения результатов, полученных на глазах с индуцированным тромбозом ветви ЦВС, с данными, характерными для интактной сетчатки экспериментальных животных (кроликов).
Таким образом, представленные выше результаты клинико-функционального анализа особенностей сосудистой окклюзии на глазах с фотоиндуцированным и лазеркоагуляционным тромбозом ветви ЦВС показали, что процесс создания фотодинамической модели тромбоза ветви ЦВС сопровождается развитием острой клинической картины заболевания с формированием абсолютной сосудистой окклюзии на 3-и сутки в области поражения, в отличие от лазеркоагуляционной модели, на которой отмечается частичное сохранение кровотока в месте воздействия и постепенное нарастание клинической картины тромбоза ветви ЦВС к 7-м суткам.
Сравнительный морфологический анализ механизма тромбообразования на фотоиндуцированной и лазеркоагуляционной экспериментальных моделях тромбоза ветви ЦВС
Методы исследования
Распределение количества глаз по срокам энуклеации представлено в таблице 1. Все энуклеированные глаза подвергались гистологическому исследованию.
В ходе морфологического анализа механизма тромбообразования на обеих экспериментальных моделях тромбоза ветви ЦВС, проводившегося через 30 мин, на 1-е, 2-е, 3-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки эксперимента для подтверждения адекватности разработанной фотодинамической модели тромбоза ветви ЦВС и ее преимуществ перед лазеркоагуляционной моделью, использовали методику световой микроскопии.
Для ее выполнения применяли окраску гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LB2 при x50, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием.
Результаты исследований
В результате гистологического исследования тромбообразование ветви ЦВС было зафиксировано на глазах кроликов с обеими моделями, однако при этом выявлены и принципиальные различия течения процесса в обеих группах. Так, в случаях фотоиндуцированной модели уже на первые сутки эксперимента определялись предрасполагающие факторы тромбоза (повреждение эндотелия, сладж-синдром, повышенная проницаемость сосудистой стенки, отек), способствующие агглютинации тромбоцитов и коагуляции фибриногена. В последующие сроки наблюдения отмечалось усиление пристеночного внутрисосудистого прикрепления тромба, появление дополнительных фиброзных структур и оседание на них форменных элементов крови, все больше перекрывающих просвет сосуда. Эти процессы сопровождались отеком и ишемическими изменениями в близлежащих оболочках с компенсаторным развитием неоваскуляризации. Данная морфологическая картина полностью подтверждает наличие тромба, формирование и строение которого соответствует одному из патогенетических механизмов его образования в естественных условиях.
В то же время в случае лазеркоагуляционной модели с первых дней наблюдения отмечалось нарушение целостности сосудистой стенки. В месте лазерного воздействия возникало компенсаторное тромбирование (приток тромбоцитов и лимфоцитов), спазм сосудов, гемофтальм из разрушенных сосудов, т.е. наблюдалось не первичное формирование полноценного тромба в просвете сосуда, а застой клеток крови, что коррелировало с полученными ранее данными других авторов (Hamilton A.M., 1977; Rosen D.A., 1979; Miller J., 1994).
Таким образом, сравнительный морфологический анализ механизмов формирования тромба в представленных экспериментальных моделях подтвердил существующее между ними принципиальное различие: при лазеркоагуляции ведущим фактором является повреждение всех слоев стенки сосуда, тогда как при фотодинамическом воздействии в процесс вовлекаются только эндотелиальные структуры сосудистой стенки, приводящие к первичному тромбообразованию.
Результаты иммуногистохимических исследований VEGF на глазах с фотоиндуцированной моделью тромбоза притоков центральной вены сетчатки
Основной задачей проведения иммуногистохимических исследований на фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС было определение накопления васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) в стенке сосудов и ткани сетчатки, а также сроки появления новообразованных сосудов. Основанием к проведению этих исследований послужил факт все большего распространения в клинике интравитреального введения анти - VEGF препаратов (люцентис), что, по мнению многих исследователей, позволяет существенно уменьшить риск развития неоваскуляризации, являющейся основным осложнением окклюзионного поражения вен сетчатки (Rabana M.D., 2007; Hoh A.E., 2007; KreutzerT.C., 2008).
Методы исследования
Все глаза с полученным фотоиндуцированным тромбозом ветви ЦВС, энуклеированные по срокам 30 мин, 1-е, 2-е, 3-и, 7-е сутки эксперимента подверглись дополнительному иммуногистохимическому исследованию. Распределение количества глаз в соответствии со сроками энуклеации представлено в таблице 1.
Иммуногистохимическое исследование проведено с использованием раствора мышиных моноклональных первичных антител против VEGF (Abcam ab28775). Гистологические срезы размещали на стеклах с адгезивным полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, Barrington, IL, США). Иммуногистохимической окраске предшествовали стадии демаскировки антигена и деактивации эндогенной пероксидазы. Препараты изучали под микроскопом Olympus IX81 (Olympus Life Science Europa, Гамбург, Германия) с управляемым компьютером, моторизованным препаратоводителем и цифровой фотокамерой Olympus DP72 при x50-, х200-, х400-кратном увеличении с последующим фотографированием.
Результаты исследования
Следует уточнить, что в начале исследования отмечалась ложноположительная реакция с реактивом во всех опытных и контрольных образцах. Однако при более детальном изучении литературы, посвященной данному вопросу, выяснилось, что для ткани сетчатки свойственно неспецифическое связывание антител к VEGF, особенно в слое нервных волокон, а также слабое и редкое окрашивание оптикоганглионаров и клеток внутреннего ядерного слоя (Schreiber A., 1985; Ferrara N., 1989), что позволило продолжить начатое исследование.
Было выявлено, что запуск процессов неоваскуляризации как механизма компенсации нарушения кровоснабжения сетчатки при тромбозе начинался сразу после проведения фотодинамического воздействия. Уже через 30 мин. после фотодинамического моделирования тромбоза было обнаружено интенсивное выкрашивание VEGF во внутренних слоях сетчатки, особенно выраженное в слое нервных волокон и со слабым и редким окрашиванием оптикоганглионаров и клеток внутреннего ядерного слоя. При этом стенки сосудов на внутренней поверхности сетчатки не были окрашены. В наружном ядерном слое окрашенные элементы отсутствовали.
Накопление VEGF происходило в течение первых суток наблюдения. Сосуды на внутренней поверхности сетчатки были интенсивно окрашены, но наличие экстравазатов несколько затрудняло исследование, маскируя истинное накопление VEGF в стенке сосудов. Появлялись редкие окрашенные элементы, уходящие вглубь сетчатки на фоне неспецифического выкрашивания VEGF, описанного выше.
Максимальное накопление VEGF на фотоиндуцированной модели тромбоза притоков сетчатки наблюдалось на 2-е сутки эксперимента. В этот срок выявлена наиболее интенсивная окраска стенок сосудов на внутренней поверхности сетчатки. Многочисленные окрашенные элементы VEGF были также зафиксированы во всех слоях сетчатки.
К третьим суткам наблюдения динамики в интенсивности выкрашивания VEGF не наблюдалось. Отмечалось его перераспределение вдоль «сосудистых почек», как подтвержденного факта появления роста новообразованных сосудов. Через неделю интенсивная окраска стенок сосудов свидетельствовала о продолжении в ней пролиферативных процессов с увеличением площади неоваскуляризации и захватом периферии сетчатки. Стабильно высокое количество VEGF было зафиксировано на всех сроках наблюдения до 30-ти суток. При этом вовлечение в процесс периферических отделов сетчатки способствовало появлению новых участков неоангиогенеза. Полученные результаты являются лишь началом исследований в этой области и требуют продолжения для правильного выбора анти - VEGF препарата, его дозировки и сроков назначения для коррекции патологического процесса.
Таким образом, в ходе иммуногистохимических исследований по определению VEGF на фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС выявлено динамическое повышение VEGF с достижением максимальных значений ко 2-м суткам и начало формирования новообразованных сосудов с 3-го дня эксперимента.
В результате комплекса проведенных в экспериментах in vivo клинико-функциональных и морфологических исследований было установлено, что принципиальным отличием фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС является острый характер процесса, ярко выраженная клиническая картина и, что самое важное, повреждение только внутренних структур сосудистой стенки с последующим первичным тромбообразованием. Это отличает полученную модель от лазериндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС, а также от ранее полученных и описанных в литературе фотоиндуцированных моделей заболевания с использованием высокоинтенсивной лазеркоагуляции, которые характеризуются постепенно развивающейся клинической картиной, частичным сохранением кровотока и повреждением всех слоев сосудистой стенки в месте воздействия (Wilson C., 1991; Danis R. P., 1996; Shen W, 1996). Поэтому очевидным становится факт, что для оценки существующих и для обоснования патогенетического подхода к разработке новых методов лечения данной патологии, использование фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС является более предпочтительным и целесообразным, ввиду её наибольшей адекватности клинике и патогенезу заболевания.
Выводы
1. Фотодинамическое воздействие при плотности энергии 200 Дж/cм2 с использованием отечественного фотосенсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин» в дозе 2,4 мг/кг обеспечивает на глазах экспериментальных животных (кроликов) создание адекватной экспериментальной фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС с вовлечением в процесс только эндотелиальных структур сосудистой стенки, динамическим формированием тромба с последующей абсолютной окклюзией сосуда и соответствующей клинической и морфологической картиной.
2. На глазах с фотоиндуцированной моделью тромбоза ветви ЦВС по результатам ФАГ установлен факт абсолютной сосудистой окклюзии к 3-им суткам после воздействия в отличие от глаз с лазеркоагуляционной моделью, при которых на 7-е сутки отмечается сохранение частичного кровотока.
3. В результате клинико-функционального анализа особенностей сосудистой окклюзии на экспериментальных моделях тромбоза ветви ЦВС установлено, что фотоиндуцированный тромбоз характеризуется острым развитием и ярко выраженной клинической картиной заболевания, тогда как при лазеркоагуляционном отмечается постепенное нарастание процесса и относительно скудная клиническая картина патологии.
4. Усовершенствованный метод ЛДФ с разработанной насадкой для интраокулярного применения служит дополнительным инструментальным методом оценки особенностей ретинального кровотока в экспериментальной офтальмологии.
5. Формирование новообразованных сосудов на глазах с фотоиндуцированной моделью тромбоза ветви ЦВС происходит к 3-му дню эксперимента, при этом ему предшествует динамическое накопление эндотелиального сосудистого фактора роста VEGF с достижением максимальных значений к 48-ми часам и сохранением его максимальных значений на протяжении всего периода наблюдения (до 30 суток).
Практические рекомендации
1. Фотоиндуцированная модель тромбоза ветви ЦВС, полученная с использованием отечественного фотосенсибилизатора хлоринового ряда «Фотодитазин», с вовлечением в процесс только эндотелиальных структур сосудистой стенки, динамическим формированием тромба с последующей абсолютной окклюзией сосуда и соответствующей клинической и морфологической картиной тромбоза ветви вены сетчатки, рекомендуется для использования в экспериментах по оценке существующих и разработке новых методов лечения соответствующей патологии.
2. Для оценки хориоретинального кровотока у экспериментальных животных целесообразно использовать усовершенствованный метод лазерной допплеровской флоуметрии с введением в витреальную полость в зоне проекции цилиарного тела исследуемого глаза специально разработанной насадки для интраокулярного исследования диаметром 8 мм. Проводить исследования необходимо бесконтактно в течение 5 секунд в 0,3-0,4 мм от исследуемых точек.
3. При оценке действия антиангиогенных препаратов при тромбозе ветви ЦВС необходимо учитывать, что рост новообразованных сосудов начинается с 3-го дня образования тромба.
Список статей и изобретений, опубликованных по теме диссертации
1. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Велибекова Д.С. Интраокулярная лазерная доплеровская флоуметрия хориоретинального кровотока на ишемической модели тромбоза ветви ЦВС // Восток-Запад: Сб. науч. тр. международной конф. по офтальмохирургии / под ред. проф. М.М. Бикбова. - Уфа, 2010. - С. 357-358.
2. Велибекова Д.С., Белый Ю.А., Терещенко А.В., Тростников Т.В. Ишемическая модель тромбоза ветви ЦВС и интраокулярная оценка хориоретинального кровотока // V Всероссийская научная конференция молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии»: Сб. науч. тр. / под ред. Х.П. Тахчиди. - М., 2010. - С. 45-47.
3. Белый Ю.А., Шацких А.В., Тростников Т.В., Велибекова Д.С. Фотоиндуцированная ишемическая модель атрофии зрительного нерва // IX Съезд офтальмологов России: Тез. докл. - М.: Издательство «Офтальмология», 2010. - С. 256.
4. Велибекова Д.С., Шаулов В.В., Соловьев Д.К., Тростников Т.В., Башук В.В. Интраокулярное исследование хориоретинального кровотока на модели тромбоза ветви ЦВС // Инновационная офтальмология: Сб. науч. тр. - Краснодар, 2010. - С. 178.
Подобные документы
Острая непроходимость центральной артерии сетчатки. Тромбоз центральной вены. Воспаление зрительного нерва. Атрофия, ишемическая нейропатия, опухоли. Предрасполагающие факторы отслойки сетчатки. Экстрасклеральные и эндовитреальные вмешательства.
презентация [3,5 M], добавлен 20.02.2017Понятие отслоения сетчатки как процесса отделения сетчатой оболочки глаза от сосудистой оболочки. Причины отслоения сетчатки. Формирование разрыва сетчатки. Симптоматика заболевания, хирургические методы его лечения. Неудачи экстрасклеральной хирургии.
презентация [1,0 M], добавлен 03.04.2014Точечная белая дистрофия сетчатки. Ангиоидные полосы, сенильные дистрофии сетчатки. Центральная серозная хориопатия. Дистрофия желтого пятна. Отслойка сетчатки, ретинопатия недоношенных. Жалобы больных с патологией сетчатки. Офтальмоскопии на глазном дне.
презентация [384,7 K], добавлен 09.02.2014Классификация заболеваний сетчатки и зрительного нерва: ретинопатия; тромбоз ретинальных вен; окклюзии ретинальных артерий; неврит; ишемическая оптикопатия; застойный диск, атрофия или отек зрительного нерва. Причины макулярной дегенерации сетчатки.
презентация [403,0 K], добавлен 09.12.2012Факторы, способствующие возникновению отслойки сетчатки. Классификация отслойки сетчатки по степени распространенности, виду и отношению к макулярной зоне. Клинические проявления заболевания, последовательность проведения его диагностики и методы лечения.
презентация [1,0 M], добавлен 01.12.2015Заболевания глаз, приводящие к значительному снижению или потере зрения. Применение склеропластических вмешательств при отслойке сетчатки. Объем витреоретинальных вмешательств, выполняемых при отслойке сетчатки. Одноэтапное оперативное вмешательство.
реферат [748,3 K], добавлен 12.10.2014Знакомство с основными причинами остановки нормального формирования сосудистой системы сетчатки. Ретинопатия недоношенных как сосудисто-пролиферативное поражение сетчатки, приводящее к слепоте. Анализ международной классификации ретинопатии недоношенных.
презентация [2,5 M], добавлен 18.05.2017Технология лечения периферических витреохориоретинальных дистрофий. Факторы риска развития регматогенной отслойки сетчатки. Абсолютные и относительные показания к лазерной коагуляции сетчатки. Усовершенствованы методики проведения лазерной коагуляции.
реферат [356,7 K], добавлен 04.07.2015Основные заболевания сетчатки. Односторонний и двусторонний ретинит как воспалительное заболевание сетчатки, его симптомы. Кровоизлияние в клетчатку, ее отслоение и опухоль. Токсические положения, неврит и дистрофия. Проведение лечебных мероприятий.
презентация [194,7 K], добавлен 26.05.2015Виды заболеваний сетчатки: наследственные и врожденные дистрофии, болезни, обусловленные инфекциями, паразитами и аллергическими агентами, сосудистыми нарушениями и опухолями. Мутации, приводящие к дегенерации сетчатки. Болезни зрительного нерва.
презентация [357,5 K], добавлен 02.10.2014
