Використання MALDI-TOF мас-спектрометрії у клінічній мікробіологічній практиці

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВИКОРИСТАННЯ MALDI-TOF МАС-СПЕКТРОМЕТРІЇ У КЛІНІЧНІЙ МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ПРАКТИЦІ

Д.Л. Кирик

Національна медична академія післядипломної освіти

імені П.Л. Шупика, м. Київ

Применение MALDI-TOF мас-спектрометрии в клинической микробиологической практике. Д.Л. Кирик

Национальная медицинская академия последипломного образования

имени П. Л. Шупика, г. Киев

Вступление. Наибольший прогресс в идентификации микроорганизмов сделал метод на основе матрично -- активированной лазерной десорбционной ионизации с время-пролётным аналізатором (МАЛДИ-ВПА).

Цель. С целью углубления знаний врачей в лекции изложен современный взгляд на проблему микробиологической диагностики с помощью МАЛДИ-ВПА.

Материалы и методы. Исследование физиологических и морфологических характеристик фенотипическими методами не позволяет достичь высокой таксономической дифференциации и в настоящее время выполняет лишь вспомогательную функцию, а для точной идентификации на видовом и внутривидовому уровнях используются тест-системы и молекулярно-генетические методы.

Результаты. Метод МАЛДИ-ВПА позволяет проводить прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции микробной клетки (прямое белковое профилирование) без фракционирования и очистки отдельных белков.Получаемые уникальные для данного вида микроорганизмов масс-спектры с высокой точностью и способностью характеризуют исследуемый объект по типу «отпечатков пальцев» .

Выводы. Использование МАЛДИ-ВПА позволит сформировать принципиально новый персонифицированный подход к комплексному обследованию пациентов и определить альтернативные варианты терапии с учетом особенностей генотипа и популяционной принадлежности возбудителей.

Ключевые слова: микробиологическая диагностика, масс-спектрометрия, быстрая идентификация, белковый профиль, генотипирование.

Using MALDI-TOF mass spectrometry in microbiological clinical practice

D.L. Kyryk

Introduction. The greatest progress in the identification of microorganisms was done on the basis of the method of Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF).

Goal. With the aim of deepening the knowledge of physicians in the lecture presented a modern view on the problem of microbiological diagnostics using MALDI-TOF.

Materials and methods.The study of the physiological and morphological characteristics by the phenotypic methods can not achieve high taxonomic differentiation and currently has only a supporting function. For accurate identification at the species and intraspecific levels, test systems and molecular genetic methods are used.

Results. Method MALDI-TOF allows for direct mass spectrometric analysis of the protein fraction of microbial cells (direct protein profiling) without the fractionation and purification of individual proteins. High precision and capability of mass spectra, which are unique for the type of microorganism, allow qualifying them as `fingerprints' of the object under study.

Conclusions.The use of MALDI-TOFwill allow to create a new personalized approach to complex patients testing and identifying alternative treatment options, taking into account characteristics of the genotype and population of origin of pathogens.

Key words: microbiological diagnosis, mass spectrometry, fast identification, protein profile, genotyping.

Вступ. Найбільший прогрес в ідентифікації мікроорганізмів зробив метод на основі матрично-активованій лазерній десорбційній іонізації з годино-прольотним аналізатором-МАЛДІ-ГПА.

Мета. Поглиблення знань лікарів, викладено сучасний погляд на проблему мікробіологічної діагностики за допомогою MALDI-TOF мас-спектрометрії.

Матеріали та методи. Дослідження фізіологічних і морфологічних характеристик фенотиповими методами не дозволяє досягти високої таксономічної диференціації і в даний час виконує лише допоміжну функцію, а для точної ідентифікації на видовому і внутрішньовидовому рівнях використовуються тест-системи і молекулярно-генетичні методи.

Результати. Метод МАЛДІ-ГПА дозволяє проводити прямий мас-спектрометричний аналіз білкової фракції мікробної клітини (пряме білкове профілювання) без фракціонування та очищення окремих білків.Отримані унікальні для даного виду мікроорганізмів мас-спектри з високою точністю і здатністю характеризують досліджуваний об'єкт за типом «відбитків пальців» .

Висновки. Використання МАЛДІ-ГПА дозволить сформувати принципово новий персоніфікований підхід до комплексного обстеження пацієнтів і визначити альтернативні варіанти терапії з урахуванням особливостей генотипу і популяційної належності збудників.

Ключові слова: мікробіологічна діагностика, мас-спектрометрія, швидка ідентифікація, білковий профіль, генотипування.

Вступ. Швидка і точна ідентифікація мікроорганізмів є актуальною задачею у багатьох сферах людської діяльності як наукового, так і прикладного характеру. Найбільше значення серед них має лабораторна діагностика, так як точність і швидкість ідентифікації патогенів можуть зіграти вирішальну роль в успішності лікування. Іншими важливими галузями є санітарний та епідеміологічний контроль, протидія загрозам біотероризму, екологічні та мікробіологічні дослідження[3]. Найбільший прогрес в ідентифікації мікроорганізмів зробив метод на основі матрично-активованій лазерній десорбційній іонізації з годино-прольотним аналізатором-МАЛДІ-ГПА (MALDI-TOF -Matrix Assisted Laser Desorption Ionization -Time of Flight). Це дало можливість проводити аналіз складних біоорганічних молекул нуклеїнових кислот і білків.У нашій країні імлементація цього методу діагностики у лабораторну практику знаходиться на початковій стадії,тому лекція із зазначеною тематикою є актуальною.

Мета. З метою поглиблення знань лікарів викладено сучасний погляд на проблему мікробіологічної діагностики за допомогою MALDI-TOF мас-спектрометрії.

Матеріали та методи. Традиційно для ідентифікації мікроорганізмів використовувалися фенотипові методи, засновані на аналізі фізіологічних і морфологічних характеристик -- розмір і форма мікробної клітини, умови росту, здатність до спороутворення, а також біохімічні тести -- забарвлення за Грамом, властивість специфічно розщеплювати певні субстрати або стійкість до певних компонентів середовища. Дослідження фізіологічних і морфологічних характеристик не дозволяє досягти високої таксономічної диференціації і в даний час виконує лише допоміжну функцію, а для точної ідентифікації на видовому і внутрішньовидовому рівнях використовуються тест-системи. На даний момент створено і комерційно доступна безліч таких тест-систем, що дозволяють з високою точністю ідентифікувати певні таксономічні групи .

Окремо необхідно відзначити імунологічні методи аналізу, що засновані на специфічній взаємодії антитіл з мембранними білками клітин мікроорганізмів, що дозволяє за допомогою флуоресцентних міток ідентифікувати окремі види і серотипи. Більшість біохімічних та імунологічних процедур можуть займати тривалий час, що дуже критично у клінічній діагностиці.

Результати. Сучасні генотипові методи засновані на аналізі структури ДНК, що реалізовано у вигляді гібридизації ісеквенуванні ДНК, або аналізі фингерпринту, отриманого в результаті сайт-специфічної рестрикції ДНК [2]. Піонерами в цій галузі були ДНК-ДНК гібридизація і гель-електрофорез в пульсуючому полі-ГЕПП( PFGE -pulsed-fieldgel-electrophoresis), які протягом довгого часу залишалися «золотими стандартами» при ідентифікації мікроорганізмів. Прогресом в області генотипових методів стала розробка ефективних способів секвенування ДНК, заснованих на полімеразно-ланцюговій реакції (ПЛР). Зважаючи на те, що секвенування цілого геному досі залишається дорогою і тривалою процедурою, при ідентифікації мікроорганізмів використовуються секвенси окремих ділянок ДНК.За останні роки велику популярність набув метод секвенування гену 16s рРНК. Перевагою методів, заснованих на ПЛР, є здатність працювати з мікрокількостями досліджуваного матеріалу, що дозволяє ідентифікувати мікроорганізми, які не культивуються. Все більш популярним стає метод типування мультилокусної послідовності-ТМЛП (MLST -multilocus sequence typing), який заснований на одночасному секвенуванні декількох генів “домашнього господарства”, що дозволяє збільшити точність ідентифікації [9].

Одним ідентифікаційним підходом є хемотаксономічні методи, що засновані на дослідженні біохімічного складу клітини. Суть методу полягає у визначенні біохімічних маркерів, які мають певну таксономічну специфічність. Ще на початку 70-х років минулого століття здійснено успішні досліди з ідентифікації мікроорганізмів за допомогою піролітичної газорідинної хроматографії. Показано наявність у пірохроматографічних спектрах характеристичних піків, що дозволяють ідентифікувати окремі види і серотипи мікроорганізмів. Пізніше було запропоновано використовувати мас-спектрометрію для хемотаксономічних досліджень. Мас-спектри, що отримані з хлороформ-метанольних екстрактів ліофілізованих клітин, мали достовірні відмінності для представників різних видів бактерій [1].

Найбільший прогрес в ідентифікації мікроорганізмів зробив «м'який» метод іонізації молекул досліджуваної речовини -- мас-спектрометрія, яка базується на матрично-активованій лазерній десорбційній іонізації з годино-прольотним аналізатором -- МАЛ-ДІ-ГПА( MALDI-TOF -Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight). Це дало можливість проводити аналіз складних біоорганічних молекул, зокрема, важколетучих молекул нуклеїнових кислот і білків [5]. Цей метод заснований на десорбції та іонізації досліджуваної речовини за допомогою лазерного випромінювання в присутності матриці з подальшим розподілом іонів у годино-прольотному мас-аналізаторі. Під дією лазерних імпульсів матриця, що кристалізувалась з досліджуваною речовиною, активно поглинає випромінювання лазера. Переходячи в газову фазу, матриця захоплює за собою молекули досліджуваної речовини, а також сприяє їх іонізації з утворенням переважно однозарядних іонів. Метод дозволяє проводити прямий мас-спектрометричний аналіз білкової фракції мікробної клітини (пряме білкове профілювання), тобто без фракціонування та очищення окремих білків. Отримані унікальні для даного виду мікроорганізмів мас-спектри з високою точністю і здатністю характеризують досліджуваний об'єкт за типом «відбитків пальців» .

Для ідентифікації окремих видів мікроорганізмів здійснюють пошук за існуючими базами їх білкових профілів. Для цього необхідна база даних еталонних спектрів, які представляють собою суперспектри та отримані шляхом усереднення серії одиничних спектрів, що дозволяє досягти більшої точності та відтворюваності аналізу. В рамках процедури ідентифікації відбувається попарне порівняння піків у спектрі досліджуваного зразка з піками еталонних суперспектрів із бази даних. Кожному порівнянню з суперспектром в базі даних присвоюється чисельний рейтинг, обчислений на підставі кількості збігів. Ідентифікація мікроорганізмів відбувається за найкращим збігом .

До позитивних характеристик мас-спектрометрії належать чутливість, точність, експресність, інформативність і відтворюваність. Про визнання світовою науковою спільнотою внеску цих досягнень в ідентифікації та дослідженні біологічних макромолекул свідчить присвоєння у 2002 році Нобелівської преміїв галузі хімії одному з винахідників лазерної десорбційної іонізації японському інженерові Коіші Танака та винахідникові іонізації електронним розпилюванням американцю Джону Фенну за «створення ними методів м'якої десорбційної іонізації для мас-спектрометричного аналізу біологічних макромолекул».

Незважаючи на широкі потенційні можливості використання цього підходу для ідентифікації та типування мікроорганізмів, на даний момент не існує єдиного протоколу для пробопідготовки та ідентифікації. Зважаючи на це, пробопідготовка може представляти собою просте нанесення клітинної культури на підкладку мас-спектрометра в суміші з матрицею. Найчастіше вдаються до різних методів лізису клітин для отримання білкового екстракту. Також залишається відкритим питання щодо відтворюваності білкових профілів окремих мікроорганізмів в залежності від умов культивування та стадії росту. спектрометрія клінічний мікробіологічний діагностика

На сьогоднішній день різними фірмами випускаються мас-спектрометри призначені для вирішення завдань ідентифікації мікроорганізмів. Існують також комерційно доступні бази даних спектрів різних мікроорганізмів. Це обумовило розширення імплементації цієї методики у клінічній діагностиці. Для ідентифікації мікроорганізмів використовуються спектри в діапазоні мас 2-20 кДа. Аналіз мас-спектрів E. coli в діапазоні 2-20 кДа показав, що з 2000 білків, передбачених на підставі даних секвенованогогеному E. coli, у спектрах присутні тільки 30. Близько половини піків були віднесені до рибосомальних білків, решта -- до ДНК-зв'язуючих білків і білків холодового шоку. Рибосомальні білки належать до білків “домашнього господарства” і внаслідок цього є досить консервативними, що забезпечує їх таксономічну специфічність. Крім цього, рибосомальні білки у великій кількості присутні в цитоплазмі клітин -- до половини маси зростаючої клітини, а їх набір залишається незмінним незалежно від зовнішніх умов і стадії росту, що і забезпечує відтворюваність мас-спектрів [ 8 ].

Дослідження за участю 8 лабораторій з різних країн світу показника міжлабораторної відтворюваності підтвердили високу надійність методу [6]. Використовуючи обладнання і програмне забезпечення фірми «BrukerDaltonics», кожна лабораторія проводила ідентифікацію 60 зразків за допомогою бази даних спектрів, що складалася з 2800 штамів. В результаті ідентифікації 97,29 % зразків були визначені до виду і лише 2,5 % -- до роду. З усіх зразків 98,75 % були визначені вірно. Дане дослідження показує, що при використанні стандартних протоколів та єдиної бази даних спектрів, метод ідентифікації MALDI-TOF мас-спектрометрії забезпечує високу точність та відтворюваність.

Важливим питанням є залежність результатів ідентифікації від умов культивування мікробних культур, таких як середовище і тривалість росту. При дослідженні спектрів культур B. subtilis, Y enterocolitica, E. coli, кожна з яких була вирощена на 4 різних середовищах: М9, триптичному соєвому бульйоні TSB, LB і кров'яному агарі, було показано, що в залежності від вибору середовища , склад піків може змінюватися [11].

Метод MALDI-TOF мас-спектрометрії переважає класичні методи за швидкістю, точністю та економічністю ідентифікаційного аналізу. Показано його перевагу надметодом на основі секвенування гену рРНК. Порівняння цих двох методів проведено на 50 штамах, що представляли собою патогени, виділені з морських харчових продуктів[4 ]. Ідентифікація за допомогою секвенування гену рРНК дозволила визначити 50 % штамів до видового рівня, в той час як з допомогою MALDI-TOF мас-спектрометрії вдалося ідентифікувати 76 %. Також метод дозволяє розрізняти штамові відмінності мікроорганізмів на внутрішньовидовому рівні - ідентифіковано 45 ізолятів Francisellatularensis до штамового рівня [10].

Наведені роботи показують, що метод ідентифікації мікроорганізмів за допомогою MALDI-TOF мас-спектрометрії не поступається більшості відомим методам за точністю ідентифікації та дискримінаційній здатності, а деякі з них помітно перевершує. Метод має великий потенціал для ідентифікації на внутрішньовидовому рівні, який буде реалізовуватися з удосконаленням технічної бази лабораторного обладнання і розширенням бібліотеки еталонних суперспектрів і секвенсів бактеріальних геномів.

Нещодавно компанія Біомерьє представила нову систему ідентифікації мікроорганізмів на основі платформи MALDI-TOF -MS. Прилад отримав назву Vitek MS і для ідентифікації бактерій визначає спектр білків безпосередньо з бактеріальної клітини без попередньої тривалої пробопідготовки. Для кожного виду мікроорганізмів сформований характерний набір білків (біомаркерів), отриманий на основі аналізу не менше 50 мас-спектрів цього виду. Кожен зразок ідентифікований за допомогою секвенса 16s РНК або інших сертифікованих методів аналізу. Методика ідентифікації на Vitek MS (MALDI-TOF) складається з 2-х етапів:

1. Підготовка зразка: аналіз починається з того, що на підкладці мас-спектрометра змішують біоматеріал з колонії бактерій і спеціальну матрицю (2',5' дигидроксибензойна кислота). Розчин вже готовий до використання і стійкий до світла. Витрати часу для підготовки 24 ізолятів -- 10 хвилин, для 96 ізолятів -- 33 хвилини;

2. Ідентифікація: зразок розміщують у прилад і піддають впливу наносекундних лазерних імпульсів. При цьому молекули матриці і аналіту (білки) переходять у газову фазу, а молекули матриці взаємодіють з білками, переносячи на них позитивний заряд. Під дією електричного поля іонізовані білки рухаються від джерела іонізації до детектора з прискоренням зі швидкістю обернено пропорційною їх атомним масам. Програмне забезпечення приладу оцінює час прольоту частинок і перетворює цю інформацію в спектр молекулярних мас (мас-спектр). Мас-спектр порівнюється зі спектрами з бази даних, і на підставі відомостей про маси характеристичних білків відбувається ідентифікація мікроорганізмів. Витрати часу для ідентифікації 24 ізолятів -- 12 хвилин, для 96 ізолятів -- 43 хвилини. Вартість 1 дослідження складається з вартості одноразових планшет і матриксу.

Таким чином, на ідентифікацію одного мікроорганізму потрібно менше 2-х хвилин часу, при цьому зразком може служити первинна колонія. База даних Vitek MS складається з 755 клінічно значущих видів (бактерій, дріжджів, грибів, мікобактерій) і покриває більшість видів, що зустрічаються в щоденній практиці мікробіологічної лабораторії, база постійно поповнюється.

Для вирішення задачі комплексного підходу ідентифікації і визначення антибіотикочутливості компанія Біомерьє поєднала два аналізатора Vitek MS (проведення ідентифікації зразка) та Vitek 2 (визначення чутливості до антибіотику і мінімальної інгібуючої концентрації). Цей зв'язок здійснюється через станцію підготовки зразків Vitek MS PREP (входить в комплектацію Vitek MS), яка надійно зв'язує інформацію про зразок і програмне забезпечення Myla (входить в комплектацію Vitek MS), що забезпечує повну автоматизацію процесів в лабораторії. Програмне забезпечення Myla являє собою комп'ютерну програму на базі технології Web 2.0, яка відстежує всі дії при ідентифікації мікроорганізмів, забезпечує взаємодію між приладами і лабораторною інформаційною системою.

Висновки. Швидкість і простота ідентифікації мікроорганізмів за допомогою MALDI-TOF-мас-спектрометрії має незаперечні переваги для клінічних лабораторій. Зменшення прямих і непрямих витрат (вартість реагентів -0,25дол. США) при аналітичному часі обороту тесту < 3 хв на один досліджений ізолят, що у багато разів нижче, ніж для традиційної автоматизованої ідентифікації, дозволить сформувати принципово новий персоніфікований підхід до комплексного обстеження пацієнтів і визначити альтернативні варіанти терапії з урахуванням особливостей генотипу і популяційної належності збудників.

ЛІТЕРАТУРА

1. Кирик Д. Л. Аналіз жирнокислотного складу бактерій роду Campylobacter // Збірник наукових праць співробітників НМАПО ім.П. Л. Шупика. -- К., 2011. -- Вип.20, кн. 2. - С.534-541.

2. Кирик Д. Л. Молекулярні методи у мікробіологічній діагностичній практиці і епідеміологічному аналізі // Профілактична медицина. -2015. -№ 1-2(24). -- С.127-134.

3. Современные методы микробиологических исследований/ Семенихина А. В. Рахманова, Т И. Нехаева [и др.]. -- Воронеж: Издательство Воронежского государственного университета, 2007. -69 с.

4. Bohme K., Fernandez-No I.C., Pazos M. [et al.] Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16 S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting // Electrophoresis. -- 2013. -- V. 34, Nо. 6.-P877-887.

5. Liang Li. MALDI mass spectrometry for synthetic polymer analysis. A John Willey & SonsInc., Publication, Hoboken, New Jersey, 2010.-326 p.

6. Mellmann A., Cloud J., Maier T. etal. Evaluation of matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16 S rRNA genesequencin gforspeciesidentificationofnonfermentingbacteria // J. Clin. Microbiol. -2008. -V. 46. Nо. 6. -- P 1946-1954.

7. Pfaller M. A. The Clinical Microbiology Laboratory and Infection Control: Emerging Pathogens, Antimicrobial Resistance, and New Technology // Clin.Infect.Dis. -- 2007. -- № 25. -- Р 858-870.

8. Ryzhov V., Fenselau C. Characterization of the protein subset desorbed by MALDI from whole bacterial cells // Analyt. Chem.. -2001. -V. 73. Nо. 4. -P. 746-750.

9. Sambrook J., Fritisch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory Manual. -- New York: Cold Spring Harbour Univ. Press., 2005. -- 435 р.

10. Seibold E., Maier T., Kostrzewa M. [et al.]. Identification of Francisella tularensis by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: fast, reliable, robust, and cost-effective differentiation on species and subspecies levels // J. Clin. Microbiol. 2010. V. 48. Nо. 4. -P. 1061-1069.

11. Valentine N., Wunschel S., Wunschel D. [et al.]. Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry // Appl. Environ. Microbiol. -- 2005. -- V. 71. Nо. 1.-P58-64.

Размещено на Allbest.ru