Психотропные свойства и аспекты механизмов действия новых производных гамма-аминомасляной и глутаминовой кислот

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Психотропные свойства и аспекты механизмов действия новых производных гамма-аминомасляной и глутаминовой кислот

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Багметова Виктория Владимировна

Волгоград, 2013

Работа выполнена на кафедре фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный консультант:

Тюренков Иван Николаевич, член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Официальные оппоненты:

Воронина Татьяна Александровна, ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией психофармакологии ФБГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН,

Резников Константин Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО "Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации,

Решетько Ольга Вилоровна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО "Саратовский государственный медицинский университет" им. В.И. Разумовского Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО "Ростовский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится "_____" декабря 2013 года в "_________" часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

Автореферат разослан "______"_____________2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук Бугаева Любовь Ивановна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На сегодняшний день социальная, экономическая, геополитическая нестабильность, информационная перегрузка, высокий темп жизни в совокупности создают условия хронического мультифакторного стресса, снижают адаптационные возможности, что ведет к невротизации населения и росту распространенности психической патологии, успешность лечения которой во многом зависит от эффективности психофармакотерапии (Александровский Ю.А., 2010; Программа ВОЗ по заполнению пробелов в области охраны психического здоровья, 2010; Информационный бюллетень ВОЗ № 220, № 369, 2010, 2012; Заболеваемость психическими расстройствами в субъектах РФ. (кроме заболеваний, связанных с употреблением психоактивных веществ) ФГУ "ЦНИИОИЗ Минздравсоцразвития РФ", 2011). Мировое потребление психотропных средств за последние 20 лет увеличилось более чем в 5 раз. На Российском фармацевтическом рынке доминируют психотропные препараты зарубежных фармацевтических компаний. Отечественные производители выпускают преимущественно дженерики, обновление ассортимента идет в основном за счет появления синонимов известных средств и не вносит качественных изменений в эффективность психофармакотерапии (Уварова Ю., 2011). Многие современные психотропные средства обладают недостаточной эффективностью, большим количеством побочных эффектов, негативно влияющих на качество жизни больных (Зборовский А.Б., Тюренков И.Н., Белоусов Ю.Б., 2008; Смулевич А.Б., 2013). В связи с этим, поиск и разработка новых оригинальных отечественных психотропных средств с высокой эффективностью и лекарственной безопасностью являются актуальными задачами нейропсихофармакологии (Воронина Т.А., Середенин С. Б., 2007).

Перспективным путем поиска и разработки новых психотропных средств является изучение структурных аналогов естественных нейромедиаторов и метаболитов нервной системы, поскольку эффекты психотропных средств реализуются за счет влияния на системы нейромедиаторов и метаболизм мозга (Петров В.И., Онищенко Н.В., 2002; Петров В.И., 2003; Семьянов А.В., 2003; Спасов А.А., Иежица И.Н., Кравченко М.С., Харитонова М.В., 2008; Beaulieu J.M., Gainetdinov R.R., 2011). Ведущую регуляторную роль в ЦНС играют тормозный нейромедиатор гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) и возбуждающий - глутаминовая кислота, которые поддерживают баланс возбуждения и торможения, присутствуют во всех структурах ЦНС, помимо нейромедиаторного, оказывают мультифункциональное нейрометаболическое действие, однако в силу ряда своих биохимических и физико-химических свойств имеют низкую биодоступность и терапевтическую эффективность (Семьянов А.В., 2003; Лоскутова Л.В., Костюнина Н.В., 2009; Архипов В.И., Капралова М.В., 2011). Показано, что модификация химической структуры данных нейромедиаторов и их структурных аналогов, являющихся уже известными лекарственными средствами, путем введения различных заместителей, а также разработка на их основе солей и композиций с органическими метаболически активными кислотами приводит к получению фармакологических средств с более высокими биодоступностью, активностью, широтой терапевтического действия, с более низкой токсичностью, чем у исходных соединений (Гречко О.Ю., 2000; Воронков А.В., 2003, 2011; Багметов М.Н., 2006; Гарибова Т.Л., Воронина Т.А., Литвинова С. А. и др. 2007; Тюренков И.Н. и др. 2007, 2010, 2012; Бородкина Л.Е., 2009; Перфилова В.Н., 2009; Якимук П.В.,. Стовбун С. В, Литвин А.А., 2011; Самотруева М.А., 2012; Куркин Д.В., 2013). Ввиду этого, представлялось актуальным изучение психотропных свойств и аспектов механизмов действия новых производных ГАМК и глутаминовой кислоты с целью возможного создания новых высокоэффективных нейропсихотропных средств.

Цель исследования - поиск и разработка на основе структурных аналогов гамма-аминомасляной и глутаминовой нейромедиаторных аминокислот новых психотропных средств с поливалентным действием, низкой токсичностью и потенциально высокой лекарственной безопасностью, анализ аспектов механизма их действия.

Задачи исследования:

1. Провести скрининговый отбор соединений c выраженной нейропсихотропной активностью в рядах производных ГАМК и глутаминовой кислоты с гетероциклическими и ароматическими заместителями в бета-положении, солей и композиций фенибута, фенотропила и нейроглутама с органическими нейрометаболически активными кислотами, полифункционально замещенных производных фенотропила.

2. Изучить острую токсичность наиболее активных соединений на двух видах лабораторных животных с использованием двух предполагаемых путей введения и учетом гендерных различий.

3. Определить диапазон терапевтически эффективных доз новых производных ГАМК и глутаминовой кислоты с наиболее выраженным нейропсихотропным действием.

4. Сравнить эффективность наиболее активных соединений и применяемых в клинике препаратов аналогичного спектра действия.

5. Изучить гендерные аспекты психотропного действия, возможность развития толерантности и синдрома отмены после длительного введения наиболее активных соединений самцам и самкам крыс в терапевтических и субтоксической дозах.

6. Провести изучение эффективности, характера и направленности действия наиболее активного соединения в зависимости от возраста.

7. Изучить механизмы действия наиболее активного соединения с использованием компьютерного PASS-прогноза, а также методов нейрофармакологического анализа in vivo путем определения влияния на эффекты агонистов и антагонистов основных медиаторных систем, а также на поведение инбредных мышей с альтернативными фенотипами эмоционально-стрессовой реакции; нейрохимического анализа влияния на обмен моноаминов и нейроактивных аминокислот в структурах мозга и радиолигандного анализа связывания с рецепторами мозга крыс: NMDA, Д 2, 5НТ 2, ГАМК-А, ГАМК-Б; нейрофизиологического анализа влияния на трансмембранные ионные токи и внутриклеточные потенциалы нейронов.

8. Обосновать перспективность разработки новых нейропсихотропных средств с поливалентным действием, низкой токсичностью и потенциально высокой лекарственной безопасностью на основе структурных аналогов ГАМК и глутаминовой кислоты, а также их солей и композиций с метаболически активными органическими кислотами.

Научная новизна. Впервые проведен целенаправленный поиск веществ с нейропсихотропным действием среди 35 новых производных ГАМК и глутаминовой кислоты: с гетероциклическими и ароматическими заместителями в бета-положении, солей и композиций фенибута, фенотропила и нейроглутама с органическими метаболически активными кислотами, полифункционально замещенных производных фенотропила, в результате которого выделены вещества с высокой нейропсихотропной активностью, низкой токсичностью, не вызывающие развития толерантности и синдрома отмены при длительном применении, обладающие потенциально высокой лекарственной безопасностью перспективные для разработки на их основе нейропсихотропных средств: соединение РГПУ-147 (цитрат 4-амино-3-фенилбутановой кислоты, цитрокард), обладающее выраженным ноотропным, нейропротекторным и анксиолитическим действием, активирующими, антиагрессивными, анальгетическими свойствами, повышающее физическую работоспособность, а также соединение РГПУ-135 (гидрохлорид бета-фенилглутаминовой кислоты, нейроглутам), проявляющее выраженную антидепрессантную и анксиолитическую активность, ноотропные, нейропротекторные, активирующие и антиагрессивные свойства, повышающее физическую работоспособность.

Впервые изучена острая токсичность соединений РГПУ-147 и РГПУ-135 на двух видах лабораторных животных (мышах и крысах) с использованием двух предполагаемых путей введения и учетом гендерных различий, установлено что данные соединения согласно классификации И.В. Саноцкого (1970) относятся к классу малотоксичных.

Впервые изучена зависимость нейропсихотропного действия цитрокарда и нейроглутама от дозы, определен диапазон терапевтически эффективных доз. Установлено, что ноотропный и анксиолитический эффекты цитрокарда как при интраперитонеальном, так и интрагастральном введении наиболее выражены в интервале доз 1/30-1/100 от LD50. Нейроглутам при интрагастральном введении в широком диапазоне доз 1/60-1/600 от LD50 проявляет антидепрессивное, анксиолитическое и ноотропное действие. психотропное аминомасляная глутаминовая безопасность

Впервые показано отсутствие толерантности к цитрокарду и нейроглутаму, а также отсутствие синдрома отмены после прекращения их шестимесячного введения в терапевтических дозах самцам и самкам крыс.

Впервые рассмотрены гендерные и возрастные особенности нейропсихотропного действия нейроглутама, проведено углубленное изучение его специфического антидепрессантного действия на модели "выученной беспомощности" в сравнении с известными антидепрессантами. Показано, что нейроглутам проявляет антидепрессивное, анксиолитическое и ноотропное действие в равной степени у самцов и самок крыс преимущественно среднего возраста (4-месячных) и менее эффективен у старых крыс (18-месячных).

Впервые изучены возможные механизмы фармакологического действия нейроглутама с использованием компьютерного PASS-прогноза, а также методов нейрофармакологического, нейрохимического, нейрофизиологического анализа. Показано, что в основе нейропсихотропного действия нейроглутама лежат: стимуляция дофамин- и серотонинергической нейропередачи без прямого связывания с Д 2- и 5НТ 2-рецепторами, модулирующее влияние на трансмембранные ионные токи и внутриклеточные потенциалы нейронов.

Научно-практическая значимость работы. Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы кафедры фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей (ФУВ) ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Минздрава России (ВолгГМУ) и утверждена на заседании Ученого совета (Протокол №3 от 09 ноября 2011 года). Ряд экспериментальных серий проведен в ходе выполнения работ по коммерческому договору с ОАО "Щелковский витаминный завод" № 09 ОИПР/2007 от 19.01.2007 "Доклинические исследования вещества соль 4-амино-3-фенилбутановой кислоты и лекарственное средство, обладающее антиишемической, гипотензивной, противоаритмической, ноотропной и антигипоксической активностью". Часть диссертации выполнена в рамках доклинических исследований нового психотропного средства, разрабатываемого по государственному контракту с Минпромторгом РФ № 11411.18700.13.089 от 13.09.2011 на выполнение научно-исследовательской и опытно-конструкторской работы (НИОКР) "Доклинические исследования антидепрессантного, анксиолитического и нейропротекторного лекарственного средства на основе глутаминовой кислоты" Шифр "2.1 Нейро глутамин 2011", заключенному в рамках Федеральной целевой программы "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу" (утвержденной постановлением правительства РФ от 17.02.2011 г. № 91).

Теоретически и экспериментально обоснована перспективность целенаправленного поиска и разработки психотропных средств с поливалентным действием, низкой токсичностью и потенциально высокой лекарственной безопасностью на основе структурных аналогов естественных нейромедиаторов ЦНС - ГАМК и глутаминовой кислоты.

В ходе выполнения диссертационного исследования выделены активные вещества с психотропным действием, на основе которых планируется или ведется разработка оригинальных отечественных нейропсихотропных средств. На основе соединения РГПУ-87 планируется разработка средства с антидепрессивным, анксиолитическим и ноотропным действием (Берестовицкая В.М., Васильева О.С., Остроглядов Е.С. и др. патент RUS 2437659 от 12.11.2010); на основе соединения РГПУ-207 планируется разработка средства с ноотропной, антидепрессивной и анксиолитической активностью (Берестовицкая В.М., Васильева О.С., Остроглядов Е.С. и др. патент RUS 2440981 от 12.11.2010); на основе соединения РГПУ-147 разрабатывается средство с антиишемической, гипотензивной, противоаритмической и ноотропной активностью (Берестовицкая В.М., Васильева О.С., Новиков Б.М. и др., патент RUS 2216322 от 28.02.2002), анксиолитическим, церебропротекторным действием, снижающее влечение к алкоголю (Тюренков И.Н., В.М. Берестовицкая, О.С. Васильева, патент RUS № 2393855 от 29.12.2008). На основе соединения РГПУ-135 (нейроглутам) разрабатывается средство с антидепрессантным, анксиолитическим, нейропротекторным и ноотропным действием (Петров В.И., Тюренков И.Н., Багметова В.В. и др. патент RUS 2429834 от 23.07.2010, государственный контракт с Минпромторгом РФ № 11411.18700.13.089 от 13.09.2011 г). По материалам настоящей работы получено 3 патента Российской Федерации на изобретения.

На основании выявленных закономерностей зависимости между структурой и активностью даны рекомендации по направленному синтезу и поиску высокоактивных и малотоксичных средств с нейропсихотропным действием в ряду структурных аналогов ГАМК и глутаминовой кислоты, которые используются химиками-синтетиками Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург) и Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО "Волгоградский государственный медицинский университет" Минздрава России.

Система методических подходов к изучению нейропсихотропной активности новых веществ, а также разработанная нами в ходе выполнения исследования, модель депрессивноподобного состояния у крыс при хроническом комбинированном стрессе со сменой разномодальных стрессоров (шума, вибрации и пульсирующего яркого света) по стохастической схеме, приводящем к формированию "выученной беспомощности" (Тюренков И.Н., Багметова В.В., Чернышева Ю.В., Бородин Д.Д., 2013) применяются в научно-исследовательской работе кафедр фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ. Результаты исследования используются также в учебном процессе кафедр фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ.

Акты о внедрении прилагаются.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработка производных естественных нейромедиаторов ЦНС - ГАМК и глутаминовой кислоты является перспективным путем поиска новых высокоэффективных и безопасных нейропсихотропных лекарственных средств, с поливалентным действием, перспективных для внедрения в клиническую практику с целью лечения нервных и психических расстройств. В результате направленного поиска веществ с нейропсихотрпным действием среди новых производных ГАМК и глутаминовой кислоты выделены вещества с высокой активностью, низкой токсичностью, не вызывающие развития толерантности и синдрома отмены при длительном применении, обладающие потенциально высокой лекарственной безопасностью, перспективные для разработки на их основе нейропсихотропных средств: на основе соединения РГПУ-147 (цитрат 4-амино-3-фенилбутановой кислоты, цитрокард) - средства с ноотропным, нейропротекторным и анксиолитическим действием, на основе соединения РГПУ-135 (гидрохлорид бета-фенилглутаминовой кислоты, нейроглутам) - средства с антидепрессантным, анксиолитическим, ноотропным и нейропротекторным действием.

2. Перспективен поиск веществ с нейропсихотропным действием в химических рядах производных алифатической ГАМК и глутаминовой кислоты с гетероциклическими и ароматическими заметсителями в бета-положении, солей и композиций фенибута, фенотропила и нейроглутама с органическими нейрометаболиески активными кислотами, полифункционально замещенных производных фенотропила.

3. Введение в структуру ГАМК и глутаминовой кислоты одинаковых ароматических и гетероциклических заметителей в бета-положении приводит к получению соединений со спектром фармакологического действия, отличным от спектра действия исходных веществ, производные ГАМК и глутаминовой кислоты с одними и теми же заместителями проявляют различный спектр нейропсихотропных эффектов. Разработка солей и композиций структурных аналогов ГАМК и глутаминовой кислоты с органическими нейрометаболически активными кислотами не вызывает изменений профиля фармакологических эффектов исходных соединений, но изменяет их выраженность, снижает токсичность.

4. В ряду солей и композиций структурных аналогов ГАМК и глутаминовой кислоты с органическими метаболически активными кислотами наиболее выраженным нейропсихотропным действием обладает соединение РГПУ-147, которое проявляет широкий спектр эффектов - ноотропный, анксиолитический, активирующий, антиагресивный, а также умеренные анальгетические и антидепрессантные свойства.

5. В ряду производных алифатической ГАМК и глутаминовой кислоты с гетероциклическими и ароматическими заметсителями в бета-положении наиболее выраженным нейропсихотропым действием обладает соединение РГПУ-135, на основе которого разрабатывается средство с антидепрессивным, анксиолитическим и нейропротекторным действием (государственный контракт с Минпромторгом РФ № 11411.18700.13.089 от 13.09.2011 г).

6. Нейропсихотропное действие нейроглутама связано со способностью стимулировать дофамин- и серотонинергическую нейропередачу без прямого связывания с Д 2- и 5НТ 2-рецепторами, модулировать трансмембранные натриевые, калиевые и, в большей степени, кальциевые ионные токи, а также внутриклеточные потенциалы нейронов.

Личный вклад автора. Автором проведен анализ литературы по теме исследования, разработан дизайн исследования, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, выводы и научно-практические рекомендации. По результатам анализа литературы автором подобраны, освоены и адаптированы к имеющейся материальной базе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ психофармакологические модели и методы, составляющие данное исследование; по инициативе автора проведены закупка и изготовление оборудования для выполнения поведенческих тестов. При непосредственном участии автора проведено планирование, подбор методов и разработка протоколов всех поведенческих экспериментов, входящих в настоящее исследование и выполненных на базе кафедры фармакологии и биофармациии ФУВ ВолгГМУ, а также проведено порядка 80 % экспериментов. Лично автором выполнен анализ результатов данных экспериментов, их статистическая обработка и описание. При личном участии автора, в рамках настоящей диссертационной работы, подготовлен проект, выигравший открытый конкурс на право заключения государственных контрактов с Минпромторгом России на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ (НИОКР) по федеральной целевой программе "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу", утвержденной постановлением Правительства Российской Федерации от 17 февраля 2011 г. № 91 (лот №3; Уникальный номер закупки 133/13-ФМП-12.07ок.), по результатам конкурса заключен государственный контракт № 11411.18700.13.089 от 13.09.2011 г. Часть экспериментальных работ (не более 20 %), посвященных изучению нейропсихотропной активности и механизмов действия наиболее активного соединения, выполнено на базах других кафедр и учреждений в рамках указанного государственного контракта. При личном участии автора по материалам диссертации подготовлены патенты РФ на изобретения и публикации.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научно-практических конференциях: IX, X, XI, XII, XIII Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2004-2008); XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XIX, XX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" (Москва, 2006-2010, 2012, 2013); Международная научно-практическая конференция "Фармация и здоровье" (Пермь, 2005); 4-я и 5-я Международные конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006, 2010); Научно-практическая конференция "Проблемы клинической фармакологии и моделирования в фармакологии и биомедицине" (Ростов-на-Дону, 2006); III Cъезд фармакологов России "Фармакология - практическому здравоохранению" (Санкт-Петербург, 2007); IV Съезд фармакологов России "Инновации в современной фармакологии" (Казань, 2012); Научная конференция "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2008); Научный симпозиум "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств" (Москва, 2008); Х Международный конгресс "Здоровье и образование в ХХI веке "Инновационные технологии в биологии и медицине", (Москва, 2009); II Всероссийский научно-практический семинар молодых ученых "Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии" (Волгоград, 2010); 3-й Международный конгресс Армении (Ереван, 2011); IV Всероссийский научно-практический семинар молодых ученых с международным участием "Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств" (Волгоград, 2012).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 128 печатных работ, в том числе 27 в журналах, рекомендованных ВАК, 3 патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 420 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 7 глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, научно-практические рекомендации, список литературы, содержащий 377 источников, из них 128 отечественных и 249 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 124 рисунками и содержит 67 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 1530 самцах и самках крыс массой 180-220 г и 756 самцах и самках мышей массой 18-24 г, 60 аутбредных мышах самцах линии Balb/c и 60 аутбредных мышах самцах линии C57Bl/6, полученных из Филиала "Столбовая" ГУ НЦБМТ РАМН, ФГУП "Питомника лабораторных животных "Рапполово" РАМН. Проведение экспериментов и содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 и ГОСТ Р-51000.4-2011), Федеральному закону № 61-ФЗ от 12.04.2010 г. "Об обращении лекарственных средств", Приказу Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708Н "Об утверждении правил лабораторной практики" (GLP), ГОСТ Р-53434-2009, с учетом международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), одобрено Региональным Независимым Этическим Комитетом (ГУ Волгоградский Медицинский Научный Центр): протокол № 140-2011 от 11.06.2011 г.

В работе изучена нейропсихотропная активность 35 новых производных ГАМК и глутаминовой кислоты Выражаем искреннюю благодарность и глубокую признательность зав. кафедрой органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (Санкт-Петербург, Россия), ЗДН, д.х.н., профессору В.М. Берестовицкой, старшему научному сотруднику, к.х.н., доц. О.С. Васильевой и всем сотрудникам кафедры, предоставившим соединения и композиции для исследования.: производных алифатической ГАМК (n=4) и глутаминовой кислоты (n=7) с гетероциклическими и ароматическими заместителями в бета-положении, солей и композиций фенибута (n=7), фенотропила (n=5) и нейроглутама (n=4) с органическими метаболически активными кислотами, полифункционально замещенных производных фенотропила (n=8). При разработке солей и композиций структурных аналогов ГАМК и глутаминовой кислоты использовали органические кислоты: лимонную, янтарную, яблочную, никотиновую, глутаминовую, салициловую, ацетилсалициловую.

Изучение нейропсихотропных эффектов новых производных ГАМК и глутаминовой кислоты проведено с использованием стандартных нейропсихофармакологических моделей и методов, изложенных в "Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" - Фармакологический государственный комитет, МЗ РФ, Москва, 2005", "Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств" - ч. 1, Москва, 2012: "открытое поле" (ОП), "приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ), "условная реакция пассивного избегания" (УРПИ), "тест экстраполяционного избавления" (ТЭИ), "подвешивание мышей за хвост" (ПМХ), "принудительное неизбегаемое плавание" по Порсолту, "потребление/предпочтение сахарозы" (П/ПС), "конфликтная ситуация по Vogel", "пролонгирование снотворного действия барбитуратов", "подвешивание на горизонтальной сетке", "принудительное неизбегаемое плавание с грузом", "раздражение лап электрическим током до вокализации", "tail immersion", модели неконкурентного и конкурентного агрессивного поведения в условиях спровоцированной внутривидовой агрессии, "максимальный электрошок" (МЭШ). При углубленном сравнительном изучении нейропсихотропного действия наиболее активных соединений и известных препаратов с близким спектром действия использовали метод изучения пространственной памяти в условиях 8-лучевого радиального лабиринта с равномерным распределением пищевого подкрепления (Островская Р.У. и др., 1995; Трофимов С. С. и др., 2000), метод парного взаимодействия (Петров В.И. и др., 1996), а также разработанную нами модель депрессивноподобного состояния у крыс при хроническом комбинированном стрессе со сменой разномодальных стрессоров (шума, вибрации и пульсирующего яркого света) по стохастической схеме, приводящем к формированию "выученной беспомощности" (Тюренков И.Н., Багметова В.В., Чернышева Ю.В., Бородин Д.Д., 2013).

На различных этапах исследования применяли следующие вещества и препараты сравнения: в дозах, численно равных 1/10 от молекулярной массы фенибут - 18, фенотропил, баклофен - 22, толибут - 19 мг/кг (в виде субстанций, синтезированных на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия), а также в терапевтически эффективных дозах: диазепам (Simplex pharma Pvt. Ltd.) - 1 мг/кг (Т.А. Воронина, 2006), амитриптилин (10 мг/кг) (р-р 10 мг/мл; ФГУП "Московский эндокринный завод", Москва, Россия); имипрамин (15 мг/кг) (Мелипрамин, р-р 25 мг/2 мл; ОАО Фармацевтический завод ЭГИС, Будапешт, Венгрия); сертралин (10 мг/кг) (Стимулотон, таб., покр. пл. об. 100 мг; ОАО Фармацевтический завод ЭГИС, Будапешт, Венгрия); пароксетин (10 мг/кг) (Паксил, таб., покр. об. 20 мг; Брашов, Румыния; GlaxoSmithKline); флуоксетин (20 мг/кг) (Флуоксетин-Канон, капс. 20 мг; ЗАО "Канонфарма продакшн", Щелково, Россия); венлафаксин (10 мг/кг) (Велаксин, таб. 75 мг; ОАО Фармацевтический завод ЭГИС, Будапешт, Венгрия). Применялись также: тиопентал натрий (лиофилизат для приготовления р-ра для в/в введения 1 г; Синтез АКО ОАО, Россия); янтарная кислота (ACS, США); яблочная кислота (AppliChem, Германия); лимонная кислота (AppliChem, Германия); салициловая кислота (Panreac; Barcelona, Espaсa); L-глутаминовая кислота (Panreac; Barcelona, Espaсa); гамма-аминомасляная кислота (Sigma-Aldrich, Германия); крахмал картофельный (ГОСТ 7699-78, высший сорт, Беларусь).

На каждом этапе исследования формировались контрольные группы животных, которые получали дистиллированную воду либо 2 %-ую крахмальную слизь.

На начальном этапе изучения возможных механизмов нейропсихотропного действия нейроглутама использовали метод компьютерного прогноза спектра рецепторной активности с помощью системы PASSВыражаем искреннюю признательность и благодарность д.б.н., с. н.с. НИИ фармакологии ВолгГМУ, старшему преподавателю каф. фармакологии ВолгГМУ Васильеву П.М. за конструктивную консультативную и практическую помощь, а также исчерпывающее информационное обеспечение при выполнении компьютерного прогноза рецепторной активности соединения РГПУ-135 с помощью системы PASS. (Филимонов Д.А., Поройков В.В., 2006).

Нейрофармакологический анализ взаимодействия нейроглутама с основными нейромедиаторными системами ЦНС in vivo проводили в тестах по изучению влияния тестируемого соединения на эффекты агонистов и антагонистов основных нейромедиаторных систем ЦНС (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, 2012). Использовались: пикротоксин 2,5 мг/кг, апоморфин 1 мг/кг (Sigma, США), галоперидол 1 мг/кг (Lake Chemikals PVT. LTD, Индия), клофелин 0,1 мг/кг (Минмедпром объединение им. 60-летия СССР, Россия), ареколин 25 мг/кг (Aldrich, Германия), никотин 5 мг/кг (Sigma, Германия), 5-окситриптофан 300 мг/кг (Sigma, Германия).

С целью нейрофармакологического анализа специфического психостимулирующего действия нейроглутама оценивали его влияние на спонтанную локомоторную активность инбредных мышей линий Balb/c и C57Bl/6 с использованием инфракрасного актиметра фирмы Panlab (Испания) с программным обеспечением ActiTrack Выражаем искреннюю признательность и благодарим за помощь в организации и проведении нейрохимического и нейрофармакологического исследования механизма действия нейроглутама академика РАН и РАМН, д.м.н., проф., директора ФГБУ"НИИ фармакологии им. В.В. Закусова" РАМН Середенина С. Б., а также сотрудников данного учреждения:

д.м.н., ведущего научного сотрудника лаборатории фармакогенетики Яркову М.А. и всех сотрудников лаборатории, принимавших участие в исследовании..

Нейрохимический анализ влияния вещества РГПУ-135 на содержание моноаминов и их метаболитов определялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125 (И.И. Мирошниченко, 1988) к.м.н., зав. лабораторией нейрохимической фармакологии Кудрина В.С., а также всех сотрудников лаборатории, принимавших участие в исследовании..

Радиолигандный анализ связывания с рецепторами компетентных структур мозга крыс выполнен с применением стандартных радиолигандов [3H]-MK-801, [3H]-кетансерина, [3H]-сульпирида, [3H]-SR95531 и [3H]-баклофена ("PerkinElmer") в соответствии с рекомендациями IUPHAR ("Guide to Receptors and Channels", S.P.H. Alexander, A. Mathie and J.A. Peters, BJP, v.147, Suppl.3, 2006) д.м.н., проф., зав. лабораторией радиоизотопных методов исследований Ковалева Г.И., а также всех сотрудников лаборатории, принимавших участие в исследовании..

Нейрофизиологический анализ влияния нейроглутама на трансмембранные ионные токи внутриклеточные потенциалы нейронов моллюсков прудовика большого (Lymnaea stagnalis) и катушки роговой (Planorbarius corneus) проводили методом внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала с помощью аналого-цифрового преобразователя фирмы "L-Card" (Россия) L-791 Благодарим и выражаем глубокую признательность за помощь в организации и выполнении нейрофизиологического анализа механизма действия нейроглутама академику РАМН, д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. Акад. И.П. Павлова" Минздрава России Игнатову Ю.Д., д.м.н., проф. зав. отд. нейрофармакологии НИИ фармакологии им. А.В. Вальдмана Вислобокову А.И..

Таблица 1. Дизайн исследования: психотропные свойства и аспекты механизмов действия новых производных гамма-аминомасляной и глутаминовой кислот

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ: Microsoft Office Excel 2007, (Microsoft, США), Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., США), BioStat 2008 Professional 5.1.3.1. В зависимости от характера данных использовали: ранговый однофакторный дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса в сочетании с апостериорными критериями Ньюмена-Кейлса (множественные сравнения для выборок одинакового объема) или Дана (множественные сравнения для выборок разного объема); точный критерий Фишера; непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для проверки распределения на нормальность использовали критерий Шапиро-Уилка. Статистически значимыми расценивались эффекты при p<0,05 (Гланц С., 1988; Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И., 2003; Кобзарь А.И., 2003; Ивантер Э.В., Коросов А.В., 2011; Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., Маевский Е.И., 2012).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На этапе скрининга структурные аналоги ГАМК и глутаминовой кислоты, а также их соли использовали в дозах численно равных 1/10 от молекулярной массы (мг/кг), что позволяло вводить их животным в эквимолярных количествах и, таким образом, сравнивать их активность.

Скрининг веществ с психотропным действием в ряду производных ГАМК и глутаминовой кислоты с одинаковыми ароматическими и гетероциклическими заместителями в бета-положении показал следующее (табл. 2).

Таблица 2. Результаты скрининга соединений с нейропсихотропной активностью в ряду производных алифатической ГАМК и глутаминовой кислоты с ароматическими и гетероциклическими заместителями в бета-положении

Фенилсодержащее производное глутаминовой кислоты соединение РГПУ-135 в сравнении с фенилсодержащим производным ГАМК фенибутом проявляет сопоставимое ноотропное, нейропротекторное и активирующее действие, превосходит фенибут по выраженности антидепрессантного и анксиолитического действия. В целом фенилсодержащие аналоги ГАМК и глутаминовой кислоты проявляют близкий спектр действия. Парахлорфенилсодержащие аналоги ГАМК и глутаминовой кислоты отличаются по спектру действия - у аналога ГАМК баклофена преобладает миорелаксирующее и анксиолитическое действие, тогда как у аналога глутаминовой кислоты РГПУ-146 преобладает умеренное антидепрессивное действие. Ближе по спектру активности были толилсодержащие аналоги - толибут и РГПУ-202 оказывали анксиолитическое и седативное действие. Индолил и бензилиндолисодержащие производные проявили слабые психотропные свойства различного профиля. Существенно отличались по спектру действия пиридилсодержащие аналоги - РГПУ-195 производное ГАМК сочетало ноотропное действие с анксиолитическим, а РГПУ-198 - производное глутаминовой кислоты - с анксиогенным. Метилбензимидазолсодержащие производные также отличались по характеру психотропного действия РГПУ-196 (аналог ГАМК) оказывало анксиоседативное действие, а РГПУ-199 (аналог глутамата) - активирующее и анксиогенное.

Для сопоставления эффектов структурных аналогов ГАМК/глутаминовой кислоты (фенибута, фенотропила, нейроглутама) и их композиций с органическими кислотами дозы композиций рассчитывались таким образом, чтобы все животные в составе композиций получали действующее вещество в терапевтически эффективной дозе численно равной 1/10 от М, то есть в той же дозе, что и в виде чистой субстанции. Т.к. соотношение структурных аналогов ГАМК/глутаминовой кислоты и органических кислот в составе композиций составляло 1:1, композиции в виде смеси равных соотношений действующего вещества и целевой добавки вводили животным в дозах, численно равных удвоенной дозе исходного соединения. Эффекты солей и композиций сравнивали также с действием органических кислот, использованных при их разработке. Дозы органических кислот были выбраны из расчета их содержания в составе вводимых композиций и согласно литературным данным входили в диапазон эффективных экспериментальных доз данных кислот (Mutuskina E.A., Zarzhetskii Iu.V., Trubina I.E. et al., 1996; Wang Y., Yan-Xia L., Dong-Lian Z. еt al., 2002; Saleem R., Ahmad M., Naz A. et аl., 2004; Cao Y., DuBois D.C. et al., 2012).

Скрининг веществ с нейропсихотропным действием в рядах солей и композиций структурных аналогов ГАМК - фенибута и фенотропила, а также глутаминовой кислоты -нейроглутама с органическими метаболически активными кислотами показал, что полученные соли и композиции имеют тот же профиль фармакологических эффектов, что и исходные вещества, но иной степени выраженности.

Результаты изучения психотропного действия солей и композиций фенибута представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты скрининга соединений с нейропсихотропной активностью в ряду солей и композиций фенибута с органическими метаболически активными кислотами

Установлено, что лимонная кислота преимущественно потенцирует активирующее, анксиолитическое, ноотропное, нейропротекторное действие фенибута и способность повышать физическую выносливость, салициловая - анксиолитические, анальгетические и нейропротекторные свойства, янтарная кислота - ноотропный эффект и способность повышать физическую выносливость, а ацетилсалициловая - анксиолитический эффект. Яблочная, никотиновая и глутаминовая кислоты изменяет фармакологическую активность фенибута преимущественно, уменьшая степень выраженности эффектов. Собственно, глутаминовая кислота проявляла активирующее и умеренное противосудорожное действие, тенденцию к ноотропному действию, янтарная кислота также проявляла тенденцию к активирующему и ноотропному действию, салициловая кислота проявляла седативные свойства, остальные органические кислты, использованные в составе солей и композиций не проявляли нейропсихотропного действия.

В ряду композиций фенотропила с органическими кислотами наибольшую активность проявила композиция с янтарной кислотой, которая превосходила фенотропил по выраженности ноотропного, нейропротекторного, активирующего действия и способности повышать физическую работоспособность, но уступала ему по выраженности анксиолитических свойств (табл.4).

Таблица 4. Результаты скрининга соединений с нейропсихотропной активностью в ряду солей и композиций фенотропила с органическими метаболически активными кислотами

В ряду композиций нейроглутама с органическими кислотами наиболее активной была композиция с янтарной кислотой РГПУ-223, которая превосходила нейроглутам по выраженности ноотропного, нейропротекторного действия, способности повышать физическую рабооспособность, но уступала ему по антидепрессантной и анксиолитической активности (табл. 5).

Таблица 5. Результаты скрининга соединений с нейропсихотропной активностью в ряду солей и композиций нейроглутама с органическими метаболически активными кислотами

Скрининговое изучение нейропсихотропных свойств полифункционально-замещенных производных фенотропила показало, что все соединения изучаемого ряда уступают фенотропилу по выраженности ноотропного эффекта. Наиболее активны были соединение РГПУ-87, содержащее метоксифенильный заместитель, которое превосходило фенотропил по выраженности антидепрессивного и противосудорожного действия, а также фенилгидразид-содержащее производное - РГПУ-207, превосходившее фенотропил по анксиолитическому и антидепрессивному действию (табл. 6).

Таблица 6. Результаты скрининга соединений с нейропсихотропной активностью в ряду полифункционально-замещенных производных фенотропила

По результатам скрининга веществ с нейропсихотропным дейсвием были выделены перспективные для дальнейшего изучения соединения, которые обладают оригинальным спектром действия: гидрохлорид бета-фенилглутаминовой кислоты (РГПУ-135, нейроглутам) сочетает выраженные антидепрессантное и анксиолитическое действие с ноотропными, нейропротекторными свойствами, способностью повышать физическую работоспособность; соль фенибута с лимонной кислотой (соединение РГПУ-147, цитрокард) обладает выраженным ноотропным, нейропротекторным и анксиолитическим действием а также активирующими свойствами, способностью повышать физическую работоспособность (рис. 1).

Рис. 1. Спектр нейропсихотропного действия наиболее активных соединений РГПУ-135 и РГПУ-147

Обозначения: 0 баллов - отсутствие эффекта; 1 балл - тенденция к проявлению эффекта (различия статистически значимы не по всем показателям); 2 балла - слабый, но статистически значимый эффект; 3 балла - умеренный эффект; 4 балла - выраженный эффект; 5 баллов - высокая активность.

Острую токсичность цитрокарда и нейроглутама изучали на 2-х видах лабораторных животных (мышах и крысах) с использованием 2-х путей введения (внутрижелудочного и внутрибрюшинного) по методу Литчфилда и Уилкоксона Выражаем искреннюю признательность и благодарность за помощь в планировании, организации, непосредственном выполнении исследования и анализе его результатов д.б.н., зав. лабораторией лекарственной безопасности, зам. директора НИИ Фармакологии ВолгГМУ Бугаевой Л.И., к.б.н., н.с. лаборатории морфотоксикологии НИИ Фармакологии ВолгГМУ Кузубовой Е.А., а также всем сотрудникам лабораторий лекарственной безопасности и морфотоксикологии НИИ фармакологии ВолгГМУ.. Соединения растворяли в дистиллированной воде и вводили животным в возрастающих токсических дозах из расчета 2 мл/100 г массы тела.

Установлено, что субстанция цитрокарда согласно классификации Саноцкого относится к классу малотоксичных, ее токсичность ниже, чем у исходного вещества - фенибута. ЛД 50 у мышей: при внутрижелудочном введении (независимо от пола) - более 4000,0 мг/кг; при внутрибрюшинном введении: 2324,1 (2119,4-2548,6) мг/кг- у самцов; 2143,0 (1967,0-2334,8) - у самок. ЛД 50 у крыс: при внутрижелудочном введении (независимо от пола): 3500 (3250,1-3769,1) мг/кг; при внутрибрюшинном введении: 1708,5 (1456,0-2004,9) мг/кг- у самцов, 1491,1 (1361,8-1632,6) - у самок. В картине интоксикации превалировали симптомы угнетения ЦНС. На основании результатов макроскопического обследования внутренних органов животных выделены предполагаемые "органы-мишени": легкие, сердце, печень, почки, а также желудочно-кишечный тракт (при интрагастральном введении). Вероятные причины гибели - дыхательная недостаточность, сердечно-легочная недостаточность.