Эндогенная интоксикация в формировании патологии сердца, вызванной компонентами цитостатической химиотерапии (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГУ «Волгоградский научный центр» РАМН и администрации Волгоградской области

ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Эндогенная интоксикация в формировании патологии сердца, вызванной компонентами цитостатической химиотерапии (экспериментальное исследование)

14.00.15 - патологическая анатомия

Зарипова Инна Васильевна

Волгоград - 2008

Работа выполнена в ГУ «Волгоградский научный центр» РАМН и администрации Волгоградской области и ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Новочадов Валерий Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Богомолова Нина Викторовна

доктор медицинских наук, профессор Мозеров Сергей Алексеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится «29» апреля 2008 года в 10.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «27» апреля 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук Н.В. Григорьева.

Общая характеристика работы

Актуальность работы.

Заболевания сердечно-сосудистой системы остаются на устойчивом первом месте в структуре причин смерти от травм и болезней как в России, так и во всех развитых странах. Существенное значение на настоящий момент придается группе заболеваний, где основу повреждения и убыли кардиомиоцитов (КМЦ) составляют не ишемия или воспаление, а иные, преимущественно токсические и дисметаболические процессы - кардиомиопатии [Кактурский Л.В., 2000, 2005; Зайратьянц О.В., 2000; Мишнев О.Д., с соавт., 2004; Коваленко В.Л., 2001, 2004; Penicaud L., et al., 2000; Drake-Holland A.J., et al., 2001; Lilly L.S., 2003; Hagege A., 2006; Harris K.M. et al., 2006; McMullen J.R. et al. 2007].

Оценке паренхиматозно-стромальных взаимодействий в мышце сердца при токсических и метаболических повреждениях уделяется большое внимание, в связи с ограниченной пролиферативной активностью кардиомиоцитов и ранним развитием диффузного заместительного кардиосклероза при гибели значительного числа мышечных клеток сердца [Непомнящих Л.М. с соавт., 2003, 2006; Розенберг В.Д., Непомнящих Л.М., 2004; Марков Д.Е., 2004; Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005; Kim Y. et al., 2003; Machackova J. et al., 2006].

Подобная кардиомиопатия лежит в основе регенераторно-пластической недостаточности миокарда и имеет морфологические особенности, отличающие ее от метаболических и ишемических повреждений мышцы сердца. Наиболее ярко она проявляется при супрессии или ингибировании кардиоспецифических генов в результате действия цитостатических (цитотоксических) препаратов. Этот эффект впервые был отмечен клиницистами, которые столкнулись с развитием антрациклиновой кардиомиопатии и необратимостью сердечной недостаточности у онкологических больных после проведения курса химиотерапии. Осложнения со стороны сердца, по мнению клиницистов-онкологов, существенно ограничивают возможности курсовой химиотерапии ряда злокачественных новообразований [Ватутин Н.Т. с соавт., 2001; Лушникова Е.Л. с соавт., 2001; Дуднакова Т.В. с соавт., 2002; Труфакин В.А., 2003; Непомнящая Е.М. с соавт., 2006; Нефедов В.П. с соавт., 2006; Yamaoka M. et al., 2000; Zhou S. et al., 2001; Suwyer D.D. et al., 2002; Raeburn C.D., et al., 2005; Ashrafian H. et al., 2007; Bos J.M. et al., 2007; Kietselaer B.L. et al., 2007].

Известна сходная патология сердца, которая может быть получена в эксперименте длительным воздействием бактериальных липополисахаридов, в особенности в сочетании с паренхиматозным токсическим повреждением печени и/или почек. При этом миокард становится мишенью вторичного повреждения эндогенными токсическими соединениями [Капелько В.И., Попович М.И., 2000; Марков Д.Е., 2004; Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005; Перфилова В.Н. с соавт., 2007; Eriksson C.J., 2001; Lang C.H., et al., 2001; Nemoto S., et al., 2001, 2005; Baba H.-A. et al., 2004; Vona-Davis L., et al., 2004; Zhao X.S. et al., 2006].

Сказанное выше позволяет предполагать участие возникающих при эндогенного токсического компонента и дисметаболических нарушений в развитии кардиомиопатии и регенераторно-пластической недостаточности миокарда при курсовой химиотерапии. Фрагментарность работ, посвященных данной проблеме, обусловливает актуальность выбранной темы.

Цель работы - выявить в эксперименте закономерности развития патологии сердца, возникающей при применении цитостатиков с позиций участия в ее развитии эндогенного токсического компонента для улучшения морфологической диагностики данных состояний в клинической практике.

Задачи исследования.

1. Изучить в эксперименте морфологические изменения в миокарде при курсовом введении цитостатиков, входящих в комплекс химиотерапии злокачественных опухолей.

2. Оценить количественное соотношение убыли кардиомиоцитов и возможности компенсаторно-приспособительных процессов на разных сроках применения цитостатиков.

3. Дать ультрамикроскопическую характеристику кардиомиоцитов на разных сроках применения цитостатиков с позиции возможности внутриклеточной регенерации.

4. Сопоставить морфологический субстрат патологии сердца при курсовом применении цитостатиков с динамикой интегральных маркеров эндогенной интоксикации.

Научная новизна.

Впервые продемонстрировано, что убыль кардиомиоцитов, проявления атрофии и компенсаторной патологической регенерации с гипертрофией отдельных кардиомиоцитов, являющиеся субстратом кардиомиопатии при курсовом применении цитостатиков, находятся в зависимости от присутствия в плазме крови маркеров эндогенной интоксикации.

Показано, что дисметаболическая кардиомипатия при курсовом применении цитостатиков и моделировании хронического эндотоксикоза сочетанным введением тетрахлорметана и малых доз бактериального липопролисахарида имеет сходные морфологические проявления и динамику развития.

На ультрамикроскопическом уровне показано, что в кардиомиоцитах вплоть до поздних сроков процесса имеются возможности к внутриклеточной регенерации, которые на тканевом уровне не реализованы.

Научно-практическая значимость.

Полученные новые данные о морфологическим субстрате дисметаболической кардиомиопатии, вызванной компонентами курсовой цитостатической терапии, расширяют представления о патологии сердца у пациентов с онкологическими заболеваниями.

Возможность прогнозирования развития кардиомиопатии и регенераторно-пластической недостаточности миокарда на основании содержания в плазме крови маркеров эндогенной интоксикации может повысить качество лечения больных онкологического профиля цитостатическими препаратами.

Положения, выносимые на защиту.

1. В сердце при использовании цитостатиков развивается патология с характерными признаками дисметаболической кардиомиопатии, сходная по морфологии и динамике развития с поражением сердца при хроническом эндотоксикозе.

2. Проявления дисметаболической кардиомиопатии при курсовом применении цитостатиков находятся в зависимости от уровня маркеров эндогенной интоксикации в плазме крови, что позволяет считать эндогенный токсический компонент неотъемлемой частью пато- и морфогенеза этого процесса.

3. На ультраструктурном уровне в кардиомиоцитах даже на поздних сроках кардиомипатии присутствуют признаки регенерации, недостаточность которых обусловлена эндогенным токсическим компонентом.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на итоговой научной сессии Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2004), IV Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции» (Волгоград, 2005); 5-й Международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология» (Хургада, 2006), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); II съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006).

Апробация работы осуществлена на расширенном заседании кафедры патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета и отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области 24 ноября 2007 года.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе статья в журнале «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенного в действующий «Перечень … ВАК» по медицинским и биологическим наукам.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Работа была выполнена в отделе общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области и на кафедре патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоградском государственном медицинском университете и Саратовском государственном медицинском университете. Предложенные диагностические критерии в научно-исследовательской работе Волгоградского областного патологоанатомического бюро и Областного клинического онкологического диспансера г. Ульяновска.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, иллюстрирована 21 рисунком. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Список использованной литературы включает 217 источников: 65 отечественных и 152 - зарубежных.

Материал и методы исследования

Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием 79 белых крыс-самцов массой 170-220 г.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP), соответствует этическим нормам, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985) и в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003. Программа экспериментов была согласована с Локальным независимым этическим комитетом по экспертизе диссертационных исследований (протокол № 11-2004 от 14 апреля 2004 года).

Закономерности развития кардиомиопатии были изучены в трех экспериментальных моделях (табл. 1).

В первой модели использовали дробное (последовательное) введение терапевтических доз антибиотика - доксорубицина. Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг первый раз и далее по 5 мг/кг еженедельно в течение 30-90 суток [Семенов Д.Е. с соавт., 2001]. Моделирование кардиомиопатии и сердечной недостаточности у крыс кардионеспецифическими цитостатиками проводили путем введения метотрексата (два раза в неделю) из расчета 15 мг/кг массы животного. В третьей модели животным вводили тетрахлорметан (ТХМ) и бактериальтный липополисахарид (ЛПС) по схеме, разработанной на кафедре патологической анатомии ВолГМУ [Новочадов В.В., 2001; Писарев В.Б., с соавт., 2002]. Крыс выводили из эксперимента также на 30-е, 60-е и 90-е сутки, не ранее чем через 48 ч после последней манипуляции.

Таблица 1 Общая характеристика материала исследования по сериям

Модель	Характеристика серии	Кол-во животных
Хроническое введение доксорубицина	контроль	8
	30 суток	6
	60 суток	6
	90 суток	5
Хроническое введение Метотрексата	контроль	6
	30 суток	6
	60 суток	5
	90 суток	5
Хроническое введение ТХМ + ЛПС	контроль	8
	30 суток	8
	60 суток	8
	90 суток	8
ВСЕГО	79

В качестве интегральных лабораторно-биохимических показателей развития эндогенной интоксикации было использовано определение веществ средней молекулярной массы (ВСММ), а также их олигопептидной фракции. Исследование проводили на двухлучевом спектрофотометре «Shimadzu» в диапазоне длин волн 210-320 нм, при постановке реакции на пептиды - 584 нм [Малахова М.Я., 1995]. Концентрацию малонового диальдегида по реакции с тиобарбитуровой кислотой, расчет производили в мкмоль/л. Для оценки тяжести ЭТ были использованы также определение активности ацилазы (КФ 3.5.1.14) в тканях почек и печени [Жуков С.А. с соавт., 1991], активность фермента выражали в мкКат/г белка ткани.

При морфологическом исследовании были использованы общепри-нятые методики с окрасками гематоксилином и эозином и по ван Гизон. С полученных микропрепаратов изготовлены микрофотограммы. Фотосъемка проведена на исследовательском микроскопе Micros (Австрия) с цифровой фотокамерой Pixera (Япония). миокард цитостатик химиотерапия

При поляризационной микроскопии обнаруживали характерную поперечную исчерченность, связанную с чередованием анизотропных и изотропных дисков или ее патологические изменения (контрактуры - усиление анизотропии дисков А, миоцитолизис - исчезновение анизотропии, цитолиз - аутолитическое разрушение изотропных дисков миофибрилл и диастаз анизотропных дисков [Непомнящих Л.М., 1991; Gregorio C.C., Antin P.B., 1999].

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии со сложившимися принципами системного количественного анализа [Автан-дилов Г.Г., 1996, 2002]. Для прямого морфометрического исследования был использован компьютерный комплекс «Видеотест-Морфо» (Россия). Определяли объемные доли и средние размеры структур.

Для электронно-микроскопического исследования миокарда использовали папиллярные мышцы сердца. В качестве показателей для структурного анализа использовались такие критерии, как яркость цитоплазмы, ядер, митохондрии. Вариационно-статистическую обработку результатов исследования, и построение графиков проводили в среде электронных таблиц MS Excel.

Математическую обработку данных проводили непосредственно из общей матрицы данных EXEL 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ STATGRAPH 5.1 (Microsoft, USA). Она включала определение показателей средней, среднеквадратичного отклонения и ошибки репрезентативности. Парные корреляции Спирмена рассчитывали между группами показателей эндогенной интоксикации, гормонального профиля и Для наглядности в необходимых случаях рассчитывали показатели интенсивности роста и прироста на каждом сроке эксперимента [Зайцев В.М., с соавт., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенное исследование показало, что во всех опытных группах при хронической интоксикации развивались изменения в сердечной мышце, которые по морфофункциональным проявлениям можно было отнести к разновидностям кардиомиопатии.

На 30-е сутки эксперимента на светооптическом уровне в миокарде наблюдались явления миоцитолиза, глыбчатый распад КМЦ, контрактурные повреждения и фрагментация, гиперхромия ядер, отек. Атрофия и гибель КМЦ сочеталась с гипертрофией части сохранившихся клеток, имеющие ярко выраженный мозаичный характер. Проявления повреждения КМЦ убывали в ряду метотрексат > ТХМ+ЛПС > доксорубимицин. КМЦ с явлениями глыбчатого распада цитоплазмы вплоть до миоцитолиза располагались преимущественно периваскулярно, что также является общей характеристикой кардиомиопатий в отличие от коронарогенных ишемических повреждений миокарда.

Сосуды были полнокровны, за исключением небольшой доли спазмированных артериол. Капилляростаз сопровождался диапедезом эритроцитов и умеренным периваскулярным отеком, также отечными были стенки венул миокарда и более крупных сосудов под эпикардом, что подразумевает присутствие эндогенных токсических соединений. Степень сосудистых нарушений убывала в ряду ЛПС+ТХМ > доксорубимицин > метотрексат.

Соединительнотканная пролиферация имела диффузный характер, была более выражена периваскулярно и сочеталась с умеренной лимфоцитарной инфильтрацией и сателлитозом, что характерно для заместительного фиброза в период его формирования. В отношении стромальной пролиферации серии можно было расположить в последовательности: ЛПС+ТХМ > доксорубимицин > метотрексат.

На 60-е сутки характер повреждений КМЦ сохранялся и нарастал в объеме, а к уже выявленным изменениям добавлялись признаки пространственной дезорганизации миокарда с нарушением ориентации соседних мышечных волокон. Также более яркими становились различия между атрофическими и гипертрофированными КМЦ. Сосудистые изменения в этот период практически не отличались от таковых во всех сериях на 30-е сутки эксперимента. Стромальная пролиферация была явно более яркой, так что в миокарде выявлялись соединительнотканные прослойки и перемычки между мышечными волокнами, нарушающие их ориентацию. В строме миокарда и в адвентиции сосудов преобладали фибробласты с крупными ядрами и хорошо различимыми цитоплазматическими отростками.

На 90-е сутки в миокарде животных сочетание гипертрофии, атрофии и острого повреждения КМЦ смещалось преимущественно в сторону атрофии. Они затрагивали практически всю ткань сердца, и сопровождались нарушением ориентации мышечных волокон. Нарушения микроциркуляции не были стол отчетливыми, но отек стенок сосудов и периваскулярный отек выявлялись повсеместно в миокарде.

Разрастание соединительной ткани и сателлитоз в миокарде были практически диффузными, и уже в малой степени зависели от локализации сосудов. В строме, помимо мелкоочагового периваскулярного кардиосклероза, выявлялись небольшие очажки жировой ткани, следующие вглубь миокарда из эпикардиальной зоны.

Исходя из поставленной цели и задач, нам было необходимым показать, что на всех сроках проводимого эксперимента в каждой из серий в организме экспериментальных животных присутствовала эндогенная интоксикация. Содержание ВСММ в плазме крови животных было увеличено во всех сериях эксперимента с тенденцией к нарастанию по мере его продолжения. Оно превышало аналогичные значения у крыс контрольной группы при введении ТХМ+ЛПС в 1,44-2,06 раза, при введении доксорубимицина - в 1,22-1,44 раза, при хроническом введении метотрексата - в 1,66-1,72 раза. Олигопептиды ВСММ прирастали в еще большей степени и, соответственно, превышали по сериям концентрацию у крыс контрольной группы в 1,35- 2,63 раза.

Концентрация малонового диальдегида не имела существенной динамики и с 30-х по 90-е сутки эксперимента была повышенной в каждой серии на своем уровне: при введении ТХМ+ЛПС - в 1,5 раза, при введении доксорубимицина - в 2,0 раза, при введении метотрексата с небольшими вариациями в 2,12 раза.

Сравнительная информативность отдельных изменений представлена на рис. 1.

Активность ацилазы не имела сколько-нибудь закономерной динамики, характеризовалась большим разбросом показателей, но постоянно была сниженной. Активность тканевых ацилаз печени и почек оказывалась сниженной не менее, чем вдвое, но обычно - в 2,5-3,0 раза вне зависимости от вида токсического воздействия.

Таким образом, введение доксорубимицина и метотрексата сопровождается изменениями маркеров эндогенной интоксикации в периферической крови и внутренних органах (печени и почках), что позволяет считать эндогенный токсический компонент неотъемлемой частью этих процессов.

ВСММ Малоновый диальдегид

Ацилаза печени Ацилаза почек

Рис. 1. Динамика маркеров эндогенной интоксикации по мере нарастания сроков эксперимента (100% - показатели в контрольной группе).

По приросту малонового диальдегида, как отражения активации перекисного окисления липидов, введение компонентов цитостатической химиотерапии превосходит классическую модель хронического эндотоксикоза, а в отношении депрессии активности тканевых ацилаз печени и почек - несколько уступает ей по выраженности и динамике.

Исходя из определения дисметаболической кардиомиопатии как мультифакторной патологии и центрального места эндогенной интоксикации в механизме ее развития следует возможность использования определения эндогенных токсинов в крови для диагностики дисметаболической кардиомиопатии невыясненной этиологии.

Количественный анализ миокарда был призван оценить в деталях динамику и сопоставить по группам изменения в трех ключевых процессах - повреждения и убыли КМЦ, сосудистых нарушений и компенсаторного изменения стромы миокарда.

Развитие эндогенной интоксикации сопровождалось прогрессирующим уменьшением объемной доли КМЦ более чем на 20% за 90 сут эксперимента (P<0,01). Снижение объемной доли сосудов было не столь выражено, и наблюдалось, начиная с 60-х суток эксперимента (P<0,05). В противовес этому, суммарная объемная доля интерстиция и соединительной ткани, увеличивалась более, чем в 1,5 раза уже к 60-м суткам хронического ЭТ, когда составляла более 36% (рис. 2).

При введении доксорубимицина объемная доля КМЦ прогрессивно снижалась с 74,1+3,1% до 55,2+1,9% к 90 суткам эксперимента, объемная доля сосудов была повышена более чем в 1,5 раза на всех сроках эксперимента, а суммарная объемная доля интерстиция и соединительной ткани увеличивалась: в 1,27 раза на 30 сутки, в 1,82 раза - на 90-е устки эксперимента, соотношения строма/паренхима и капилляры/паренхима также были достоверно повышены к 90-м суткам эксперимента.

Введение метотрексата сопровождалось весьма резким уменьшением объемной доли КМЦ, которая уже к 30 суткам была меньше исходной на 19%, а к 90-м суткам - на 31%. Это сопровождалось соответствующим ростом суммарной объемной доли интерстиция и соединительной ткани, но объемная доля сосудов практически не изменялась. Расчетные коэффициенты выявляли весьма выраженное увеличение соотношения строма/паренхима - почти в 2,8 раза к 90 сут эксперимента при стабильных значениях соотношения капилляры/паренхима в пределах 0,04-0,05 на всех сроках интоксикации.

Характерным во всех моделях было уменьшение толщины КМЦ (к 90 сут - на 15-30%) и средней площади их сечения (при хронической эндогенной интоксикации - на 40%, в остальных сериях - на 10-15%).

Общая убыль КМЦ за 90 суток эксперимента составила в группе с хронической эндогенной интоксикацией свыше 6,7 _* 10⁶ клеток на 1 животное (35%), в группе с введением доксорубимицина - 7,6 _* 10⁶ клеток (42%), в группе с введением метотрексата - 4,8 _* 10⁶ клеток (26%).

В целом, морфометрическое исследование выявило несколько количественных признаков, которые могут быть положены в основу диагностики дисметаболической кардиомиопатии различной этиологии.

1. Снижение объемной доли КМЦ, их средней толщины и/или сечения на 15% и 25%, соответственно.

2. Уменьшение абсолютного числа КМЦ желудочков ниже 15,0 _* 10⁶ .

3. Увеличение объемной доли соединительной ткани в 1,5 раза и более и/или увеличение соотношения строма/паренхима свыше 0,45.

Рис. 2. Прирост отношения строма/паренхима и абсолютная убыль КМЦ. Слева - при хронической эндогенной интоксикации, справа - при введении доксорубимицина, внизу - при введении метотрексата (за 100% приняты значения у крыс контрольной группы).

Объемные доли сосудов и изменения ангиоархитектоники в отношении развивающихся кардиомиопатий оказались малоинформативными.

Результаты при исследовании областей, наиболее «актуальных» с клинической точки зрения, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН и администрации Волгоградской области (рис. 3).

Рис. 3. Радиальное распределение интенсивности окрашивания КМЦ в контрольной и опытных группах. 1-10 - ход сканирования от центра КМЦ к периферии. Опыт 1 - ТХМ+ЛПС, опыт 2 - доксорубимицин, опыт 3 - метотрексат. Сравннение проведено на 30-е сутки.

Кривая распределения тинкториальной плотности на поперечных срезах КМЦ имела у крыс контрольной группы типичный вид: она характеризовалась небольшим подъемом (К около 0,70) к зоне вблизи 0,2 от геометрического центра сечения, максимумом яркости в пределах 10-10,5 усл. ед. и вариабельностью по секторам от 4% до 6%.

Показатель К, описывающий изменения тинкториальной плотности по направлению от центра к периферии поперечного сечения КМЦ, при интоксикации уменьшался во всех экспериментальных группах. При интоксикации ТХМ и ЛПС его величины становились вдвое меньше к 60-м суткам эксперимента и в 5,5 раз - к 90-м суткам. При хроническом введении доксорубомицина тангенс угла становился отрицательным (до -0,30 к 90-м суткам).

При введении метотрексата кривая радиального распределения тинкториальной плотности к 30-м суткам становилась практически горизонтальной, а затем К также менял знак на отрицательный (до -0,10 к 90-м суткам). Расстояние от центра сечения КМЦ до максимума тинкториальной плотности смещалось при интоксикациях к периферии: R увеличивался в первой группе до 0,41, во второй - до 0,29, в третьей - до 0,61. Величина дисперсии распределения окраски составила при введении ТХМ и ЛПС - увеличивалась, варьируя 14%, во второй (введение доксорубимицина) - 3,7%, при интоксикации метотрексатом - 23%.

Таким образом, радиальная морфометрия дает новые данные о характере повреждения цитоплазмы КМЦ при различных комбинированных воздействиях, сопровождающихся формированием кардиомиопатии. Она позволила не только выявить атрофию КМЦ, но и показать морфологические проявления ее протекания на субклеточном уровне. Повышенная неравномерность оптической плотности окраски цитоплазмы КМЦ опытной группы по сравнению с контрольной свидетельствует об усилении дезорганизации мышечных клеток, сопровождающей хронический ЭТ и другие хемоиндуцированные кардиомиопатии.

Выявленные при микроскопии вариации КМЦ в сочетании с данными количественного анализа следует трактовать как значительное сокращение размеров сократительных структур в КМЦ. Выраженность этих процессов убывает в ряду доксорубимицин > ТХМ+ЛПС > метотрексат, что отражает известные представления о селективности и кардиотоксичности данных веществ.

Для того, чтобы показать участие эндогенного токсического компонента в развитии атрофии и убыли КМЦ при изучаемых кардиомиопатиях, мы воспользовались корреляционным анализом. В отношении объемной доли и абсолютного числа КМЦ наибольшее количество корреляционных связей (отрицательных - для ВСММ и малонового диальдегида и положительных - для тканевых ацилаз) было выявлено при хронической эндогенной интоксикации (табл. 2).

Для хронической интоксикации доксорубимицином получены убедительные, но несколько меньшие по значению корреляционные связи (0,480 - 0,755 по модулю), причем большие значения корреляций зафиксированы для малонового диальдегида (табл. 3).

Таблица 2 Матрица корреляций маркеров хронического ЭТ и показателей морфометрии миокарда у крыс при хроническом введении ТХМ и ЛПС (r)

Показатели морфометрии миокарда	Маркеры эндогенной интоксикации
	ВСММ	Малоновый диальдегид	Ацилазы
Объемная доля КМЦ Объемная доля сосудов Объемная доля интерстиция и соединительной ткани Поперечное сечение КМЦ Поперечное сечение ядер КМЦ Абс. число КМЦ	-0,800* 0,382 0,756* -0,881* 0,354 -0,714*	-0,685* 0,265 0,788* -0,612 0,227 -0,822*	0,523 -0,402 -0,717* 0,472 0,152 0,537

* - здесь и в табл. 3-4 - сильные достоверные корреляционные связи (>0,669)

В серии с хроническим введением метотрексата корреляционные связи варьировали в пределах 0,312 - 0,610 по модулю. Было крайне мало связей между показателями морфометрии миокарда и малонового диальдегида (табл. 4)

Аналогичные зависимости для размеров КМЦ были убедительными только в серии с хронической эндогенной интоксикацией (0,596 - 0,881 по модулю), единственная сильная отрицательная связь малоновый диальдегид - поперечное сечение КМЦ зафиксирована в серии с введением доксорубимицина (-0,707).

Таблица 3 Матрица корреляций маркеров хронического ЭТ и показателей морфометрии миокарда у крыс при хроническом введении доксорубимицина (r)

Показатели морфометрии миокарда	Маркеры эндогенной интоксикации
	ВСММ	Малоновый диальдегид	Ацилазы
Объемная доля КМЦ Объемная доля сосудов Объемная доля интерстиция и соединительной ткани Поперечное сечение КМЦ Поперечное сечение ядер КМЦ Абсолютное число КМЦ	-0,573 0,404 0,771* -0,381 -0,275 -0,432	-0,480 0,715* 0,697* 0,172 -0,743* -0,755*	0,640 -0,221 -0,337 0,286 0,477 0,343

Таблица 4 Матрица корреляций маркеров хронического ЭТ и показателей морфометрии миокарда у крыс при хроническом введении метотрексата (r)

Показатели морфометрии миокарда	Маркеры эндогенной интоксикации
	ВСММ	Малоновый диальдегид	Ацилазы
Объемная доля КМЦ Объемная доля сосудов Объемная доля интерстиция и соединительной ткани Поперечное сечение КМЦ Поперечное сечение ядер КМЦ Абсолютное число КМЦ	-0,610 -0,095 0,624 -0,225 -0,179 -0,580	-0,312 0,118 0,427 0,254 -0,183 -0,571	0,333 -0,150 -0,408 0,301 0,498 0,409

Таким образом, часть изменений КМЦ, наблюдаемая при хроническом введении доксорубимицина и метотрексата, математически связана с возрастанием в плазме крови компонентов хронической эндогенной интоксикации и падением активности тканевых ацилаз печени и почек. Количество и величина этих связей меньше, чем при моделировании хронического ЭТ введением тетрахлорметана и бактериального ЛПС, но достаточно, чтобы признать эндогенный токсический компонент участником повреждения и гибели кардиомиоцитов при воздействии компонентами цитостатической химиотерапии.

Для характеристики сосудистого компонента в изучаемой патологии при количественном анализе оценивали изменения объемной доли сосудов и соотношения капилляры/паренхима.

При хронической эндогенной интоксикации наблюдалось умеренное снижение объемной доли сосудов и практически неизменный коэффициент капилляры/паренхима. При хроническом введении доксорубимицина объемная доля сосудов и коэффициент капилляры/паренхима были повышена более чем в 1,5 раза на всех сроках эксперимента. При хроническом введении метотрексата объемная доля сосудов практически не изменялась при стабильных значениях соотношения капилляры/паренхима в пределах 0,04-0,05 на всех сроках интоксикации.

Корреляционный анализ выявил единственную сильную положительную связь между уровнем малонового диальдегида и объемной долей сосудов миокарда (0,715) при хроническом введении доксорубимицина.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при хронических процессах дисфункция эндотелия и нарушения микроциркуляции отступают на второй план и не в столь значительной мере опосредуют прямые и опосредованные эффекты токсических соединений на миокард. Многие из этих изменений, выявленные на светооптическим уровне в поздние сроки эксперимента могут быть отнесены скорее к вторичным, следующим за ремоделированием миокарда в процессе развития рестриктивной кардиомиопатии.

Наконец, скорость стромальной пролиферации и прирост соединительной ткани оценивались по динамике их объемной доли и коэффициента строма/паренхима.

Объемная доля интерстиция и соединительной ткани увеличивались при хронической эндогенной интоксикации к 90-м суткам более чем в 1,5 раза, при введении доксорубимицина - в 1,82 раза, при введении метотрексата - в 1,97 раза. За счет параллельной убыли КМЦ, соотношение строма/паренхима еще более информативно отражало стромальную пролиферацию. Этот коэффициент за 90 суток опыта возрастал в серии с хронической эндогенной интоксикацией в 1,85 раза, при хроническом введении доксорубимицина - в 2,24 раза, при введении метотрексата - в 2,80 раза.

Корреляционный анализ выявил множество связей между этими изменениями и маркерами эндогенной интоксикации.

При хронической эндогенной интоксикации зафиксированы сильные положительные корреляционные связи с содержанием ВСММ и малонового диальдегида, отрицательные - с активностью тканевых ацилаз (0,582 - 0,788 по модулю). При хроническом введении доксорубимицина также выявлены достоверные корреляции (0,508 - 0,771 по модулю). В меньшей степени зависимость была характерна для серии с хроническим введением метотрексата (0,312 - 0,610 по модулю).

Как известно, элиминация и атрофия КМЦ сопровождаются диффузным склерозированием миокарда, которое можно рассматривать как более-менее адекватную компенсаторную реакцию соединительной ткани на выраженное уменьшение массы мышечных волокон. Ремоделирование миокарда при подобных кардиомиопатиях в результате изменения характера паренхиматозно-стромальных взаимодействий не приводит к грубой деформации сердца, что является благоприятным фактором для восстановления нормальной тканевой архитектоники мышцы сердца при возобновлении регенераторных процессов [Непомнящих И.М. с соавт., 2003].

Наблюдаемое увеличение относительного объема соединительной ткани связано не только с диспропорциональным уменьшением парен-химатозных компонентов, но и с пролиферативной реакцией стромы.

Кардиомиопатия, развивающаяся при введении ТХМ+ЛПС, имеет сходный морфогенез и динамику развития с хроническим поражением миокарда этанолом. Исходя из известных литературных данных, в ее развитии основное значение стали приобретать продукты, выделяемые лимфоцитами и моноцитами инфильтратов и распадающимися КМЦ, а значение эндогенных токсических соединений, приносимых с кровотоком от других органов и тканей, начинает отходить на второй план [Абидов М.Т. с соавт., 2000; Соколова Р.И., Жданов В.С., 2002; Booke M. Et al., 1999]. Возможно, что увеличение объема стромальных компонентов в миокарде при атрофии определяется потребностями паренхиматозных клеток и направлено на обеспечение оптимального для данных условий уровня функционирования КМЦ [Розенберг В.Д., Непомнящих Л.М, 2004; Harris K.M. et al., 2006; McMullen J.R. et al. 2007].

Таким образом, совместное выявление низкой объемной доли КМЦ (менее 60%), варьирующей площади их поперечного сечения и размеров ядер, уменьшение абсолютного числа КМЦ желудочков ниже 15,0 _* 10⁶ при увеличении объемной доли соединительной ткани в 1,5 раза и более и/или увеличение соотношения строма/паренхима свыше 0,45 следует считать признаками дисметаболической рестриктивной кардиомиопатии. Вне зависимости от этиологии, на всех этапах ее развития в формировании убыли КМЦ и заместительного ремоделирования миокарда с возрастанием стромального компонента существенную роль играют эндогенные токсические соединения.

Установление характера ультраструктурных изменений КМЦ, особенностей их гибели и элиминации, а также регенерации при пластических дефицитах различного генеза имеет фундаментальное значение для патологии миокарда.

На уровне ядра рассматриваемые изменения можно было охарактеризовать как уменьшение ядра в размерах, небольшую фестончатость кариолеммы. Ядрышко уменьшено в размерах, деформировано, с резким снижением гранулярного компонента. Плотность гранул хроматина резко повышена, он представлен большим количеством глыбок в кариоплазме.

При введении цитостатиков в ядрах клеток содержание гетерохроматина резко снижено, эухроматин диффузно рассредоточен и занимает основную площадь среза ядра. Часть ядрышек функционально активно, но в отдельных случаях наблюдается образование кольцевидных ядрышек и потеря фибриллярного компонента.

Как известно, снижение или подавление синтеза РНК в ядрах приводит к дефициту АТФ, снижению содержания свободных рибосом и полисом в саркоплазме КМЦ и нарушению процессов внутриклеточной регенерации. Результатом таких нарушений является атрофия части КМЦ, гибель их путем апоптоза [Sawyer D.B. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Wang G.-W. et al., 2001] и резорбция мононуклеарными клетками - процессы, представляющие последовательные стадии развития регенераторно-пластической недостаточности миокарда.

Доказательство на ультраструктурном уровне изменений сократительного аппарата КМЦ при повреждениях сердечной мышцы необходимо для установления функциональных последствий развивающейся кардиомиопатии. На 30-е сутки хронической эндогенной интоксикации часть миофибрилл была лизирована, на их месте располагалось большое количество лизосом. К 60-м суткам указанные изменения были выражены в несколько большей степени, а к 90-м суткам в КМЦ появлялись новообразованные миофибриллы. Они были более тонкими и располагались под углом к сохранившимся волокнам, Z-диски были смещены относительно друг друга, а в некоторых миофибриллах не определялись.

При действии цитостатиков миофибриллы также частично лизировались, во многих саркомерах появлялись пустоты вплоть до тотального лизиса миофиламентов в пределах саркомера. Литические изменения миофибрилл сопровождались усилением процессов аутофагии и приводили к гибели КМЦ по типу апоптоза. К 60-ти суткам большинство миофибрилл заметно истончалось, особенно в центральной зоне КМЦ. Начиная с 90-х суток, в КМЦ также определялись ультраструктурные признаки регенераторных реакций: по периферии истонченных миофибрилл отмечаются скопления рибосом и полирибосом, появляются небольшие новообразованные миофибриллярные пучки. В некоторых КМЦ новообразованные миофибриллярные пучки располагались веерообразно или были спиралеобразно закручены.

Деструкция миофибрилл и редукция миофибриллярных пучков в КМЦ являются основными морфологическими критериями рестриктивной кардиомиопатии, описаны у пациентов и в экспериментах как in vivo, так и in vitro [Капелько В.И. с соавт., 1998; Sussman M.A. et al., 1997; Sawyer D.B. et al., 2002].

В наших исследованиях важно, что практически идентичная картина трансформации сократительного аппарата КМЦ наблюдается как при хронической эндогенной интоксикации, так и при хроническом (дробном) введении цитостатических препаратов. Это наталкивает на мысль о сходстве механизмов, опосредующих данную патологию, а, возможно, и на участие эндогенного токсического компонента в происхождении обнаруженных нарушений.

Например, нарушения пластического обеспечения кардиомиоцитов при полном алиментарном голодании кроликов и крыс, получавших в течение 5-10 сут только воду, на ультраструктурном уровне также выражались в частичном лизисе и истончении миофибриллярных пучков. К концу эксперимента отмечалась выраженная атрофия кардиомиоцитов, что приводило к снижению массы сердца [Непомнящих Л.М., 2001].

Митохондрии играют главную роль в обеспечении клеток энергией и одну из центральных ролей в инициации апоптоза в ответ на различные внеклеточные и внутриклеточные стимулы, в связи с чем оценке их состояния уделяется очень большое внимание и постоянно проводится поиск ультраструктурных критериев, характеризующих разные типы повреждения митохондрий.

В наших исследованиях митохондрии КМЦ при хронической эндогенной интоксикации были увеличены в размерах и имели повышенную электронную плотность. В противовес этому, при введении цитостатиков обнаруживалось большое количество митохондрий с разрушенным и гомогенизированным матриксом, вокруг которого формировались электроннопрозрачные поля. Данный феномен был расценен как артефакт, указывающий на прижизненную неустойчивость мембранного аппарата митохондрий [Непомнящих Л.М. с соавт., 2003].

В других исследованиях аналогичные изменения митохондрий были обнаружены в КМЦ крыс после введения им доксорубицина в разных дозах. Так, после однократного введения крысам адриамицина в дозах до 2 мг/кг в 36% КМЦ отмечались изменения внутриклеточных мембран: умеренное расширение перинуклеарных пространств, канальцев саркоплазматической сети и трубочек Т-системы, набухание митохондрий с просветлением в них матрикса и редукцией крист [Капелько В.И. и др., 1998]. Это позволяет считать, что такая реорганизация митохондриального аппарата является характерной чертой антрациклиновых повреждений мышечных клеток сердца.

Выявленные нами ультраструктурные изменения митохондрий при введении доксорубомицина не соответствуют ни «митохондриальному пикнозу», описываемому при апоптозе, ни массивному тотальному набуханию, выявленному при некрозе. Вероятно, в данном случае возникает особый тип повреждения митохондрий, по мнению Л.М.Непомнящих (2001), связанный с непосредственным воздействием данных антибиотиков на структуры митохондрий и общим нарушением биосинтетических процессов. Последнее связывает механизм трансформации митохондрий с эндогенным токсическим компонентом.

Таким образом, пато- и морфогенез дисметаболической кардиомиопатии имеет комплексный характер и включает в себя, как минимум, элементы переноса токсических соединений к сердечной мышце от других органов и тканей, сосудистые нарушения, собственные (тканевые) нарушения метаболизма, вегетативную дизрегуляцию и тканевую перестройку с преобладанием диффузного компенсированного кардиосклероза. Основу процесса составляют прогрессирующее уменьшение объемной доли КМЦ и стромально - сосудистая перестройка с развитием диффузного кардиосклероза.

Одним из объяснений схожести картины кардиомиопатий различных повреждения может служить повреждение миокарда эндогенными продуктами интоксикации, которые в развитии этой патологии не только с самых ранних сроков, но и в дальнейшем начинают играть самостоятельную, подчас ведущую роль в пато- и морфогенезе вторичного повреждения сердечной мышцы.

В своей совокупности, полученные результаты способствуют развитию концепции о рестриктивной кардиомиопатии и регенераторно-пластической недостаточности миокарда, в основе которой лежит нарушение процессов биосинтеза ультраструктур и внутриклеточной регенерации. Предложенные основные морфологические характеристики нарушения биосинтетических процессов в КМЦ базируются на универсальных и стереотипных молекулярно-клеточных реакциях, развивающихся при действии на клетки различных факторов, подавляющих биосинтез. Поэтому они могут быть использованы для диагностики регенераторно-пластической недостаточности органов и тканей вне зависимости от природы патогенного агента.

Выводы

1. При курсовом введении цитостатика с селективным кардиотоксическим эффектом доксорубимицина и неселективного цитостатика метотрексата в сердце развиваются однотипные изменения по типу рестриктивной кардиомиопатии - регенераторно-пластической недостаточности миокарда. Ее основой является прогрессирующее повреждение и гибель кардиомиоцитов, наличие стромально-сосудистой перестройки с развитием диффузного кардиосклероза, по общей динамике и характеру патологии сходные с дисметаболической кардиомиопатией при хроническом эндотоксикозе.

2. Развитие кардиомиопатии при курсовом введении цитотоксических препаратов, как и при хронической эндогенной интоксикации, сопровождается относительной и абсолютной убылью кардиомиоцитов в желудочках сердца: в группе с введением доксорубимицина - на 7,6 _* 10⁶ клеток (42%), в группе с введением метотрексата - на 4,8 _* 10⁶ клеток (26%), в группе с хронической эндогенной интоксикацией - свыше 6,7 _* 10⁶ клеток на 1 животное (35%).

3. Формирование рестриктивной кардиомиопатии при курсовом применении доксорубимицина и метотрексата сопровождается приростом содержания интегральных маркеров эндогенной интоксикации (веществ средней молярной массы - в пределах 122-206%, олигопептидов - 135-263%), постоянно высоким уровнем малонового диальдегида - 200-212%) и двух-, трехкратным снижением активности тканевых ацилаз печени и почек, что по своему характеру соответствует развитию хронического эндотоксикоза.

4. Повреждение компонентов ядра, миофибрилл, лизосом и синтетического аппарата кардиомиоцитов при хронической эндогенной интоксикации и хроническом действии цитостатиков имеет однотипные структурные характеристики и динамику с наличием на 90-е сутки признаков неполной внутриклеточной регенерации. Повреждение митохондрий цитостатиками в кардиомиоцитах носит специфический характер, и заключается в их раннем необратимом устранении, что играет роль в развитии регенераторно-пластической недостаточности.

5. Между основными количественными показателями изменений миокарда при рестриктивной кардиомиопатии (объемная доля, размеры и абсолютное число кардиомиоцитов, объемная доля соединительной ткани) и маркерами эндотоксикоза имеются множественные корреляции (до 0,707-0,820 по модулю), указывающие на прямую взаимосвязь между хронической эндогенной интоксикацией и процессами в миокарде при курсовом применении цитостатических препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Основные морфометрические и гистохимические критерии дисметаболических кардиомиопатий // Матер. н.-пр. конф. «Совершенствование и развитие … здравоохранения Волгоградской области». - Волгоград, 2005. - С. 128-131 (соавт. В.В. Новочадов, Д.Е. Марков).

2. Моделирование кардиомиопатии при хроническом эндотоксикозе // Бюл. Волгоградского научного центра РАМН. - 2005. - N1. - С. 36-37. (соавт. В.В. Новочадов).

3. Возможности компьютерной морфометрии в оценке различных моделей кардиомиопатии // Морфология процессов индивидуального развития, адаптации и компенсации: Труды ВолГМУ. - Т. 62, вып.1. - Волгоград, 2005. - С. 94-97. (соавт. Соснин Д.А.).

4. Варианты развития кардиомиопатии в зависимости от уровня общей неспецифической реактивности организма // Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека: Материалы 4-й Всероссийской конференции. - Волгоград, 2005. - С. 251-253. (соавт. В.В. Новочадов).

5. Радиальная морфометрия кардиомиоцитов в оценке патологии сердца при его токсическом повреждении // Новые технологии в медицине: Труды ВолГМУ. - т. 62, вып. 2. - Волгоград, 2005. - С. 291-292. (соавт. Д.А. Соснин).

6. Количественные характеристики фиброгенеза в миокарде при хроническом эндотоксикозе // Акт. проблемы современной ревматологии: сб. н. трудов. - Вып. 22. - Волгоград, 2005. - С. 109-110. (соавт., В.В Новочадов, Д.А. Соснин).

7. Иммуногистохимическая характеристика ремоделирования миокарда при хроническом эндотоксикозе // Совр. наукоемкие технологии - 2006. - №2. - С. 36-37.

8. Эндогенная интоксикация в механизмах формирования кардиомиопатий различной этиологии // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии: Материалы Росс. н. конференции с международным участием. - В 2-х т.т. - Курск: КГМУ, 2006. - Т. 1. - С. 289-291. (соавт. Д.А. Соснин, А.Н. Горячев).

9. Количественная оценка ремоделирования миокарда при хроническом экспериментальном эндотоксикозе // Морфогенез и регенерация: Материалы заочной электронной конференции. - Курск, 2006. - C. 22-24. (соавт. Горячев А.Н.)

10. Органопатология ингаляционных поражений бактериальными полисахаридами // Материалы II Съезда Российского общества патологоанатомов. - Москва 2006. - С. 185-187. (соавт. Новочадов В.В., Горячев А.Н., Ахмед Итмизи)

11. Ультраструктура кардиомиоцитов при патологии сердца, вызванной хронической эндогенной интоксикацией и цитостатическими антибиотиками // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. - 2007 №4 С. 35-38. (соавт. В.Б. Писарев, В.В. Новочадов - журнал «Перечня … ВАК»).



Подп. в печать 24.03.08. Формат 60 х 84/16 Бум. пл. 65 г/м².

Печать офсетная. Усл. печ. л. 1.0 Тираж 100. Заказ 246.

Волгоградский государственный медицинский университет,

400131, Волгоград, Пл. Павших борцов, 1.

Размещено на Allbest.ru