Размещено на http://www.allbest.ru/

Противодиабетическая активность сухого экстракта Гимнемы лесной

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет является одной из актуальных проблем здравоохранения (Дедов И.И. и др., 2007; Балаболкин М.И. и др., 2007). Такие поздние осложнения этого заболевания, как ретинопатия, нефропатия, синдром диабетической стопы, ишемическая болезнь сердца, полинейропатия являются главной причиной инвалидизации и смертности больных диабетом. В настоящее время научно обоснованы эффективные методы ранней диагностики, лечения и профилактики осложнений указанной патологии. Ключевым фактором в профилактике поздних осложнений является оптимальная компенсация метаболических нарушении и, прежде всего, нормализация гликемии (Анциферов М.Б., 2007). Научные исследования во многих странах мира направлены на уточнение механизмов патогенеза заболевания, его осложнений и на разработку патогенетических лекарственных средств, применение которых способствовало бы профилактике и улучшению течения уже возникших осложнений (Балаболкин М.И. и др., 2007). Одним из новых направлений в разработке новых подходов к лечению сахарного диабета типа 2 является создание препаратов на основе веществ с инкретиномиметическим действием, в частности аналогов GLP-1 (глюкагоноподобного пептида 1) (Juris J. et al., 1999; Pro P., 2005; Анциферов М.Б., 2007; Тронько Н.Д., 2007). По результатам исследования синтетического аналога GLP-1 установлено, что применение его не эффективно из-за нестойкости вещества (Maksound H. et al., 1999). В последнее время разрабатываются соединения, обладающие ингибирующим влиянием на активность фермента, инактивирующего GLP-1 - DPP-IV (ингибитор дипептидилпептидазы IV типа) (Балаболкин М.И., 2004; Zander M., 2002).

В данном аспекте привлекает внимание тот факт, что лекарственное растение Гимнема лесная оказывает инкретиномиметическое действие (Fushiki T., 1992; Okabayashi Y., 1990; Pullaiah T., 2003). Таким образом, данное растение проявляет свойства, направленные на восстановление естественных физиологических механизмов регуляции уровня глюкозы. Учитывая опыт применения Гимнемы лесной в индийской народной медицине для коррекции нарушений при сахарном диабете, а также данные о гипогликемических свойствах этого растения (Shanmugasundaram E., 1990; Sugihara Y., 2000; Pullaiah T., 2003) представляется целесообразным всестороннее изучение фармакологических свойств экстракта Гимнемы лесной.

Цель исследования. Изучение фармакологических свойств сухого экстракта Гимнемы лесной при экспериментальном сахарном диабете.

Задачи исследования.

1. Оценить гипогликемическую активность сухого экстракта Гимнемы при пероральном введении в зависимости от дозы и степени очистки экстракта.

2. Исследовать антидиабетогенные свойства сухого экстракта Гимнемы лесной на патологических моделях стрептозотоцин-индуцированного и иммунозависимого сахарного диабета.

3. Изучить механизм антидиабетического действия экстракта Гимнемы лесной (утилизация глюкозы изолированной диафрагмой, ингибирование всасывания глюкозы и жирных кислот в кишечнике, морфофункциональные показатели поджелудочной железы).

4. Провести исследования гемореологических свойств сухого экстракта Гимнемы лесной.

5. Определить величину антиоксидантной активности экстракта Гимнемы лесной.

6. Изучить влияние экстракта Гимнемы лесной на липиды плазмы крови.

7. Определить острую токсичность экстракта Гимнемы лесной.

Научная новизна. Проведено сравнительное изучение фармакологической активности экстракта Гимнемы лесной в зависимости от степени очистки. Установлено, что гипогликемические и антидиабетогенные свойства уменьшаются в ряду Гимнема-25 > Гимнема-50 > Гимнема-75. Впервые изучено влияние Гимнемы-25 на морфологическую структуру островков Лангерганса. Зарегистрировано увеличение объемной доли островков и площади ядер в-клеток поджелудочной железы. Впервые показано воздействие Гимнемы-25 на всасывание углеводов и жирных кислот в кишечнике, утилизацию глюкозы периферическими тканями. Впервые установлено влияние Гимнемы-25 на гемореологические свойства крови при экспериментальном сахарном диабете. При этом отмечалось снижение показателей повышенной вязкости крови животных и гиперагрегации тромбоцитов, выявленных при моделировании указанной патологии. Впервые исследована антиоксидантная активность Гимнемы-25 в условиях in vivo и установлено снижение уровней конъюгированных диенов, малонового диальдегида и супероксиддисмутазы в крови и органах крыс.

Научно-практическая значимость работы. В результате проведенного исследования установлено, что по выраженности гипогликемического эффекта Гимнема-25 является наиболее активной фракцией. Данное вещество может быть использовано для углубленного исследования в качестве основы создания лечебно-профилактических комплексов для коррекции метаболических расстройств и синдрома преддиабета. Выявленные гемореологические и антиоксидантные свойства Гимнемы-25 определяют перспективность его дальнейших исследований в качестве средства для профилактики отдаленных осложнений сахарного диабета.

Реализация результатов исследования. Данные о наиболее выраженной гипогликемической активности фракции Гимнемы-25 были использованы при создании антидиабетогенной композиции «Диабета». Результаты работы включены в лекционный материал на кафедре фармакологии ВолГМУ для студентов лечебного, педиатрического, фармацевтического факультетов, на кафедре фармакогнозии и ботаники ВолГМУ для студентов фармацевтического факультета, на кафедре фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ для слушателей факультета усовершенствования врачей и провизоров, а также на кафедрах фармакологии Саратовского и Кубанского государственных медицинских университетов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В зависимости от степени очистки экстракта Гимнемы лесной максимальную гипогликемическую и антидиабетическую активности оказала фракция Гимнема-25.

2. Гимнема-25 оказывает ингибирующее действие на процессы поглощения глюкозы и жирных кислот в кишечнике. При пероральном применении Гимнемы-25 происходит увеличение скорости утилизации углеводов мышечной тканью крыс.

3. При курсовом введении Гимнемы-25 на фоне интоксикации стрептозотоцином отмечается уменьшение цитотоксического действия, которое выражается в увеличении площади островков и ядер в-клеток поджелудочной железы.

4. Гимнема-25 воздействует на реологические свойства крови при экспериментальном сахарном диабете, о чем свидетельствуют снижение вязкости крови во всех диапазонах сдвига. Гимнема-25 снижает агрегацию тромбоцитов и оказывает антиоксидантное действие.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 63-й, 64-й и 65-й итоговых научных конференциях студентов и молодых учёных ВолГМУ, Волгоград, 2004-2006 гг.; IX, X, XI Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, Волгоград, 2004-2006 гг.; I Международном конгрессе «Современные проблемы эстетической медицины, дерматокосметологии и иммунореабитологии», Паттайя 2005 г.; XI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, 2006 г.; XIII и XIV Национальных конгрессах «Человек и лекарство», Москва, 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 в журналах, рецензируемых ВАК.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах текста компьютерного набора, иллюстрирована 21 рисунком, содержит 14 таблиц. Состоит из "Введения", "Обзора литературы" (глава I), и 6-ти глав собственных исследований (главы II-VII), обсуждения результатов (глава VIII), выводов и списка литературы, включающего 35 отечественных и 86 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования были выполнены на 692 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах массой 230-400 г и 20 белых неимбредных мышах-самцах массой 22-24 грамма, содержащихся в условиях вивария ВолГМУ на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных (1997). Эксперименты проведены с учётом правил лабораторной практики (GLP) при проведении доклинических исследований в Российской Федерации, разработанные в соответствии с Федеральным законом "О лекарственных средствах" N 86-ФЗ от 22.06.1998 (Собрание законодательства Российской Федерации от 29 июня 1998 г., N 26, ст. 3006; от 13 января 2003 г. N 2 ст. 167; от 10 января 2000 г., N 2, ст. 126; от 7 января 2002 г. (Часть I), N 1, ст. 2) и положением о Министерстве здравоохранения Российской Федерации, утвержденным постановлением Правительства Российской Федерации от 29.04.2002 N 284 (Собрание законодательства Российской Федерации, 6 мая 2002 г., N 18, ст. 1771).

В работе проведено сравнительное изучение фармакологической активности различных фракций сухого экстракта Гимнемы лесной (№ сертификата анализа GYM-030706 от 1.06.03) в гравиметрических концентрациях 25%, 50% и 75% (далее Гимнема-25, Гимнема-50, Гимнема-75). Порошок водно-спиртового экстракта листьев Гимнемы, разводили дистиллированной водой, после фильтрации добавляли кислоту соляную до pH 1.5. Затем остаток экстрагировали этанолом, с последующим выпариванием. После взвешивали для определения гравиметрической концентрации фракций. Было получено три фракции - Гимнема-25, Гимнема-50 и Гимнема-75. В качестве препаратов сравнения использовали: Гликлазид («Сервье», Франция), Танакан («Ipsen», Франция). В исследовании использовались реактивы: глюкоза (ч.д.а., Реахим, Россия), наборы «Глюкоза ФКД» (Россия), стрептозотоцин (Sigma), натрия цитрат (ч.д.а., Реахим, Россия), адъювант Фрейнда (Grand Island Biological Company, США), «Фосфосорб» (Россия), DRG Insulin Elisa Kit (Австрия), олеиновая кислота (Chemapol, Чехия), натрия таурохолат (Chemapol, Чехия), раствор Рингера (Хемофарм, Югославия), наборы «Тромбо-тест» («Технология-стандарт» (Россия)), «Техпластин-тест» (Россия), «Фибриноген-тест» (Россия), «АПТВ(АЧТВ)-тест» (Россия), гептан, изопропиловый спирт (ч.д.а., Россия), тиобарбитуровая кислота (ТБК) (ICN Biomedicals, США), фосфорная кислота (Реахим, Россия), кверцетин (Sigma, США), этилендиамин-тетраацетат (ЭДТА) (Sigma, США), тетраметил-этилен-диамин (ТМЭД) (Реанал, Венгрия), диметилсульфоксид (ДМСО) (Реахим, Россия), наборы GPO-PAP, фирмы “Biocon” для определения уровней триглицеридов, общего холестерина и липопротеидов высокой плотности.

Влияние сухого экстракта Гимнемы на уровень глюкозы определяли в крови, глюкозооксидазным методом, с использованием набора «Глюкоза ФКД» (Россия), с последующим измерением на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия). Изучение экстракта Гимнемы на толерантность к сахарной нагрузке проводили с использованием глюкозотолерантных тестов: перорального (Баранов В.Г., 1983) и внутривенного (Masiello P., et al, 1998). Результаты оценивали по методу Древаль (2005). Изучение влияния исследуемого экстракта на всасывание жирных кислот и глюкозы проводили по методу Wang L.F. et al. (1998). Концентрацию олеиновой кислоты определяли по цветной реакции с натрия диэтилтиокарбоматом спектрофотометрическим способом (Duncombe G., 1962). Воздействие Гимнемы-25 на утилизацию глюкозы периферическими тканями изучали на изолированной диафрагме крыс по остаточному содержанию сахара в пробах (Дудченко Г.П., 2001). Для исследования гемореологической активности изучаемого экстракта производили измерение вязкости крови на вискозиметре АКР-2 (Россия) по методу ротационной вискозиметрии со свободно плавающим цилиндром-ротором (Добровольский Н.А., 1989). Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-произодственной фирмы "Биола" (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и соавт. (1989). Коагуляционные показатели были измерены на гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) с использованием наборов реактивов производства «Технология - стандарт» (Россия). Влияние Гимнемы-25 на антиоксидантную активность оценивали по методу Ланкина В.З. и соавт. (1975) на модели аскорбат-зависимого ПОЛ в гомогенате печени крыс. Исследование ТБК-активных продуктов липопероксидации исследовали хемилюминесценцией по методу Семешко С.Г., Фархутдинова Р.Р., (2002). Малоновый диальдегид (МДА) определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Гаврилов В.Б. и др., 1987). Уровень коньюгированных диенов определяли в липидном экстракте (Костюк В.А., 1984). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу Костюка В.А. (1990). Количество гликозилированного гемоглобина определяли методом катионно-обменной хроматографии низкого давления с использованием стандартных наборов («Фосфосорб», Россия). Концентрацию инсулина в плазме крови определяли на иммуноферментном анализаторе «SUNRISE», фирмы TECAN (Австрия) с использованием наборов DRG Insulin Elisa Kit (Австрия). Определение содержания триглицеридов и общего холестерина в сыворотке крови, а холестерина липопротеинов высокой плотности в супернатанте после преципитации липопротеидов производилось спектрофотометрическим способом с использованием ферментативного колориметрического теста GPO-PAP (“Biocon”, Германия). Концентрацию липопротеидов низкой плотности вычисляли по формуле Фридвальда (Friedewald W.T., 1972). Дополнительно определяли индекс атерогенности по А.Н. Климову. Токсичность Гимнемы-25 проводили на мышах при пероральном введении экстракта. Гибель животных регистрировали в течение двух недель. Расчет LD₅₀ проводили по методу Личфилда-Вилкоксона (Хабриев Р.У. и соавт., 2005). Формирование тяжелой формы экспериментального сахарного диабета вызывали у крыс стрептозотоцином в дозе 45 мг/кг при внутривенном введении (Srinivasan K., Ramarao P., 2007). В дальнейший эксперимент производился набор животных с уровнем сахара в крови выше 17 ммоль/л. Противодиабетическое влияние изучаемых экстрактов у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом оценивали по уровню гликемии после недельного введения препарата. Иммунозависимый сахарный диабет моделировали подкожной инъекцией 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда (Grand Island Biological Compani,США) и ежедневными внутривенными инъекциями стрептозотоцина в дозе 25 мг/кг в течение 5 дней (Ziegler B. et al., 1990). Морфологическое исследование островкового аппарата поджелудочной железы проводили, разделяя материал на три фрагмента (дуоденальный, желудочный и селезеночный), с последующей обработкой по общепринятым гистологическим методикам (Саркисов Д.С., 1996; Автандилов Г.Г., 2002; Trucco M., 2005). Для выявления в-клеток и б-клеток островков Лангерганса были использованы моноклональные антитела к инсулину и поликлональные антитела к глюкагону (Novocastra, Великобритания). Для визуализации использовали непрямой иммунопероксидазный метод на базе стрептавидин-биотинового метода с высокотемпературной демаскировкой антигенов (Эллиниди В.Н. и соавт. 2002). Морфометрический анализ производили на базе Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области Выражаем признательность зав. кафедрой, член-корр. РАМН, профессору В.Б. Писареву и к.м.н., доценту Г.Л. Снигуру за помощь в проведении исследований. с использованием компьютерной системы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия, СПб). Для анализа морфометрических показателей производили микрофотосъемку цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40 и окуляра х10. Определяли процентное соотношение площади, занимаемой б- и в-клетками к общей площади островка, которая составляла 100%; объемную долю островкового аппарата по отношению к экзокринной части железы; средние размеры островков Лангерганса. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и ANOVA (Newman Keuls test) с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6.0» (Гланц С., 1998) с предварительной проверкой выборки на нормальность распределения.

Результаты экспериментов и их обсуждение

Согласно результатам проведенных исследований, экстракт Гимнемы лесной оказывает сахароснижающий эффект в организме интактных животных. При этом различные фракции данного экстракта проявляют неодинаковую выраженность гипогликемического действия. По выраженности сахароснижающего действия Гимнема- 25 превосходила остальные фракции изучаемого экстракта. Так, через два часа после перорального применения Гимнемы-25, Гимнемы-50 и Гимнемы-75 уровень глюкозы в крови животных снизился на 24,4%; 8,7% и 6,2% по отношению к аналогичным показателям в группе интактных животных (p<0,05). Наиболее перспективным, среди исследованных экстрактов, оказалась фракция Гимнема-25. В результате исследования была установлена ее средняя эффективная доза - 280 мг/кг, при применении которой наблюдается снижение глюкозы в крови на одну треть от исходных показателей. Установлено, что при применении Гимнемы-25 гипогликемическое действие наблюдается в течение четырех часов, при этом максимальный эффект отмечается через два часа после перорального введения (рис.1).

Рис. 1. Гипогликемическая активность экстрактов Гимнемы лесной при однократном пероральном применении (М±m).

Обозначения: По оси абсцисс: время - часы; по оси ординат: изменения концентрации глюкозы в плазме крови (Д%). Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины.

*- данные достоверны по отношению к контролю (p < 0,05).

В ходе глюкозотолерантных тестов выявлено, что Гимнема-25 способствует увеличению скорости утилизации глюкозы у интактных животных, что подтверждается снижением показателей уровня сахара в крови на 25,8% при пероральной сахарной нагрузке (рис. 2).

Рис. 2. Влияние экстрактов Гимнемы лесной на уровень гликемии интактных крыс при пероральной нагрузке глюкозой в дозе 3 г/кг (М±m).

Обозначения: по оси абсцисс: время - минуты, по оси ординат: концентрация глюкозы в плазме крови С (ммоль/л). * - данные достоверны по критерию Стьюдента (p< 0,05).

Некоторые исследователи механизм сахароснижающей активности связывают со стимуляцией ферментов, ответственных за утилизацию глюкозы и ингибированием поглощения глюкозы в кишечнике [Sugihara Y., 2000]. Предположительно, гипогликемическое действие Гимнемы-25 опосредовано через стимуляцию секреции инсулина в-клетками островков Лангерганса, что соответствует литературным данным, полученным для фракции Гимнемы лесной GS4, а также для водно-спиртового экстракта данного растения [Persaud SJ., 1999; Sugihara Y, 2000; Britsch S., 1996]. Не последняя роль в этом отводится инкретиномиметическому действию экстракта Гимнемы лесной, при введении которого происходит повышение секреции GLP-1. Считается, что около 60% секретируемого поджелудочной железой инсулина в ответ на прием глюкозы перорально опосредовано влиянием GLP-1, что объясняет тенденцию снижения уровня сахара в крови после перорального нагрузочного теста [Анциферов М.Б., 2007]. В ходе нагрузочного теста при внутривенном ведении глюкозы наблюдалось снижение количества сахара в крови на 36,4%, по сравнению с контрольной группой животных.

Полученные данные указывают на возможное инсулиномиметическое действие Гимнемы-25 в организме интактных крыс.

В результате проведенных исследований установлено, что Гимнема-25 проявляет выраженное гипогликемическое действие в организме крыс с сахарным диабетом.

Полученные результаты вполне согласуются с имеющимися литературными данными по фракции Гимнемы лесной GS4. В исследованиях Okabayashi Y. (1990) установлено, что при пероральном применении фракции GS4 крысам с сахарным диабетом, наблюдалось существенное снижение уровня глюкозы в крови.

После введения цитотоксина животные были вялы и малоподвижны, при этом отмечалась сниженная реакция на звук и тактильные воздействия. Кроме снижения веса, отмечалась усиленная полидипсия и полиурия.

При курсовом введении Гимнемы-25 животным с сахарным диабетом отмечается антидиабетический эффект вводимой фракции, что выражается в уменьшении выраженности гипергликемии натощак и после нагрузочных тестов с глюкозой, снижении показателей полидипсии и потери массы тела.

Кроме того, выявлено, что после курсового введения стрептозотоцина повышается уровень гликозилированного гемоглобина в крови крыс [Sugihara SJ., 2000; Shanmugasundaram ERB, 1990].

Так, из представленных результатов на рисунке 3 видно, что на 22 день исследования этот показатель у животных с сахарным диабетом увеличился в 2,5 раза по отношению к интактным (р?0,05). В группе крыс, получавших Гимнему-25, отмечалось снижение количества гликозилированного гемоглобина в крови, при этом его уровень был практически в 2 раза ниже, чем в группе животных с диабетом.

Рис. 3. Влияние Гимнемы-25 на уровни гликозилированного гемоглобина в крови крыс с экспериментальным иммунозависимым сахарным диабетом (Мm). Обозначения: по оси ординат - уровень гликозилированного гемоглобина (%). Примечание: Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины.

* - данные достоверны по отношению к интактным, парный критерий Стьюдента, (р?0,05).

¦ - данные достоверны по отношению к контролю-диабет, парный критерий Стьюдента, (р?0,05).

Известно, что одним из признаков длительно протекающей гипергликемии является высокий уровень гликозилированного гемоглобина в крови [Балаболкин М.И., 2000; Ефимов А.С., 2006; Бондарь Т.П., 2003]. Гликозилированный гемоглобин, обладая повышенным сродством к кислороду, способствует снижению парциального давления кислорода в крови, а тем самым и ишемии органов и тканей. Полагают, что этот механизм, в свою очередь, играет определенную роль в патогенезе микроангиопатии [Куприянов В.В., 1993; Grundy S.M., 1999]. Эритроциты, содержащие гликозилированный гемоглобин, обладают измененным поверхностным s-потенциалом. Последнее приводит к стазу и агглютинации эритроцитов. Финалом данных процессов является микротромбоз, что создает местную циркуляторную и гемическую гипоксию, активацию перекисного окисления липидов с повреждением цитоплазматических мембран эндотелиальных клеток [Куприянов В.В., 1993; Heldin C.H., 1990]. Следовательно, при применении Гимнемы-25, вероятно будет снижаться риск возникновения патогенетических механизмов, изложенных выше.

Значимые изменения были выявлены при измерении уровней инсулина в крови животных. Так, содержание инсулина в крови крыс с сахарным диабетом к окончанию исследования было достоверно ниже на 32,2%, чем у интактных животных. В группе крыс с сахарным диабетом, получавших Гимнему-25, уровень инсулина в крови был статистически не значимо выше на 16,7%, чем в группе контроль-диабет, что согласуется с литературными данными об инсулиномиметических свойствах фракции GS4 данного растения [Sugihara Y., 2000]. Ориентируясь на имеющиеся литературные данные [Shanmugasundaram ERB, 1990] и полученные результаты настоящих исследований, установлено, что Гимнема-25 осуществляет протекторное действие в отношении в-клеток поджелудочной железы при цитотоксическом воздействии стрептозотоцина, что подтверждается увеличением количества ядер эндокриноцитов и площади, занимаемой в-клетками (рисунок 4).

Рис. 4. в-клетки островка Лангерганса: А - контрольная группа животных. Б - 22^й день стрептозотоцинового диабета. В - 22^й день стрептозотоцинового сахарного диабета на фоне профилактического введения Гимнемы-25. Окраска моноклональными антителами к инсулину (Novocastra, Великобритания). Увеличение: Х400.

При гистологическом исследовании поджелудочной железы крыс, получавших Гимнему-25, отсутствовали признаки деструкции и воспаления, однако, отмечалось наличие единичных склерозированных островков. Объемная доля островков и их площадь практически достигали показателей интактных животных. Результаты исследования представлены в таблице 1. Так, при морфологическом исследовании дуоденального отдела поджелудочной железы крыс с иммунозависимым сахарным диабетом, получавшим в течение месяца Гимнему-25, установлено, что объемная доля островков была в 1,5 раза выше аналогичного показателя в группе крыс с иммунозависимым сахарным диабетом. При этом количество в-клеток на 36,7% было выше аналогичного показателя в группе животных с сахарным диабетом, и не отличалось от значений полученных для интактных животных (р<0,05).

Таблица 1. Влияние Гимнемы-25 на изменение структуры островкового аппарата поджелудочной железы (М±m).

Примечание: * - статистически достоверные показатели.

При изучении желудочного отдела поджелудочной железы после применения Гимнемы-25 объемная доля островков увеличилась на 24,4% по сравнению с животными с сахарным диабетом. Площадь ядер в-клеток, а также их количество не отличалось от показателей у интактных крыс, однако были выявлены отличия с группой животных с сахарным диабетом. Так, процент в-клеток в 1,5 раза выше, чем в группе крыс с диабетом (р<0,05). Также был исследован селезеночный отдел поджелудочной железы крыс. Объемная доля островков в этом отделе у животных, которым вводили Гимнему-25, на 20,1% выше аналогичного значения у крыс с диабетом. Площадь ядер в-клеток не отличалась от значения полученного для интактных животных, однако эта величина превышала аналогичных показатель у крыс с иммунозависимой формой диабета на 12,5%. Количество в-клеток было в 1,6 раз выше (р<0,05), чем у животных с диабетом. Полученные данные указывают на способность Гимнемы-25 активировать регенерацию в-клеток поджелудочной железы, что согласуется с данными о возможной регенерации эндокриноцитов поджелудочной железы у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом, получавшим неочищенный экстракт листьев Гимнемы лесной [Shanmugasundaram ERB, 1990]. Гимнемовые кислоты при пероральном применении снижают уровень глюкозы в крови у животных с диабетом [Persaud SJ., 1999; Sugahara Y., 2000; Brown D., 1995]. Этот терапевтический эффект был объяснен способностью экстракта Гимнемы лесной ингибировать поглощение глюкозы в кишечнике. В этом случае Гимнема лесная может быть полезна не только для пациентов с сахарным диабетом, но также и для людей с ожирением. Известно, что ожирение ассоциировано с сахарным диабетом типа 2. Многочисленные наблюдения и исследования подтверждают, что избыточное накопление абдоминальной жировой ткани, как правило, сопровождается метаболическими нарушениями и в значительной мере увеличивает риск развития метаболического синдрома и СД 2 типа [Бутрова С.А, 2001; Беляков Н.А., 2005; Чазова И.Е., 2002]. В исследованиях Thomson и др. (1997) установлено, что ингибирование поглощения жирных кислот может предотвращать ожирение [Brown D., 1995]. Одним из механизмов регуляции уровня гликемии является снижение всасывания углеводов в кишечнике. Установлено, что Гимнема-25 способствует ингибированию поглощения глюкозы и олеиновой кислоты в тонком кишечнике крыс, что находит подтверждение в литературных источниках [Luo H., 2001; Wang L.F., 2001]. При проведении перфузии в группе животных получавших Гимнему-25 количество поглощенной жирной кислоты к 15 минуте понизилось в 2,36 раза (р?0,05) (рис. 5).

Рис. 5. Влияние Гимнемы-25 в дозе 280 мг/кг при 7 дневном пероральном введении на всасывание олеиновой кислоты при перфузии кишечника крыс (М±m).

Обозначения: по оси абсцисс - время перфузии (минуты); по оси ординат - поглощение олеиновой кислоты на 30 см кишечника (мкМоль/л).

Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины.

*- данные достоверны по отношению к контролю, парный критерий Стьюдента, (р?0,05).

При перфузии кишечника животных, получавших Гимнему-25, к 30 минуте количество утилизированного углевода достоверно уменьшилось в 4,9 раза, по сравнению с группой интактных животных (рисунок 6).

В исследованиях Yoshioka H. (1986), проводили измерение глюкозо-индуцированного трансмурального потенциала, и предположили, что ингибирующее влияние гимнемовых кислот на поглощение глюкозы может быть связан с супрессией Na⁺-зависимого транспорта глюкозы, хотя точный механизм все еще неясен. Stremmel L. (1988) установил, что поглощение олеиновой кислоты изолированным клетками слизистой тонкого кишечника крыс частично зависит от Na⁺-K⁺-ATФазы. Эти особенности поглощения жирных кислот подобны таковым для глюкозы. Предположительно, ингибирующий эффект Гимнемы заключается в том, что под влиянием гимнемовых кислот происходит блокирование Na⁺-K⁺-АТФ-азы. Известно, что Na⁺-K⁺-АТФ-аза в базолатеральной мембране энтероцитов способствует перемещению Na⁺ из клетки, для поддержания более низкой концентрации внутриклеточного Na⁺, чем в кишечном люмене, который является движущей силой для поступления глюкозы в клетку [Luo H., 2001; Philpott DI., 1992]. Всасывание жирных кислот в кишечнике связано со многими факторами, в том числе наличием желчных кислот, водного слоя и рН среды. Известно, что проникновение глюкозы и олеиновой кислоты в энтероциты осуществляется путем пассивной диффузии (образование гидрофильных мицелл), а также посредством промежуточных транспортных систем, различных для каждого из веществ [Luo H., 2001].

Гимнемовые кислоты ухудшают всасывание олеиновой кислоты. Полученные результаты могут объясняться наличием различных внутриклеточных механизмов утилизации глюкозы и жирных кислот.

Считается, что эффект в отношении глюкозы и олеиновой кислоты связан с различными химическими структурами гимнемовых кислот [Luo H., 2001].

Установлено влияние Гимнемы-25 (при непосредственном добавлении в перфузат) на всасывание глюкозы и олеиновой кислоты в зависимости от дозы - 0,25 мг/мл и 0,5 мг/мл и был выявлен дозозависимый эффект. По ингибирующей активности Гимнема-25 в дозе 0,5 мг/мл превалировала над таковой в дозе 0,25 мг/мл.

При этом зарегистрировано, что ингибирующий эффект является обратимым. Восстановление исходной способности клеток кишечника поглощать углеводы и жирные кислоты происходит через 6 часов после отмены Гимнемы-25, в данной временной точке регистрируются значения тождественные показателям у интактных животных, что свидетельствует об обратимости действия Гимнемы-25.

Рис 6. Влияние Гимнемы-25 в дозе 280 мг/кг при 7 дневном пероральном введении на всасывание глюкозы при перфузии кишечника крыс (М±m).

Обозначения: по оси абсцисс - время перфузии (минуты); по оси ординат - поглощение глюкозы на 30 см кишечника (мкМоль/л).

Примечание: Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины.

* - данные достоверны по отношению к контролю, парный критерий Стьюдента, (р?0,05)

Установлено, что снижение гликемии, как следствие утилизации глюкозы периферическими тканями (печень и мышечная ткань), обусловлено инсулином, который активирует гликогенсинтазу, ответственную за образование гликогена в указанных тканях-мишенях [Балаболкин М.И., 2000]. Одним из путей утилизации глюкозы является захват ее периферическими тканями, в частности, мышечной. Экспериментально определено, что при применении Гимнемы-25 в дозе 280 мг/кг в течение 30 дней увеличивается количество поглощенной глюкозы изолированной диафрагмой интактных крыс. Из представленных на рисунке 6 результатов исследования видно, что Гимнема-25 при пероральном применении в 2,8 раза повышает способность изолированной диафрагмы к поглощению глюкозы достоверно выше (р<0,05 по отношению к интактным животным). При добавлении к пробам инсулина показатель поглощения глюкозы в 1,5 раза превышает аналогичный показатель интактных крыс (р<0,05). Не менее значимые результаты получены при проведении подобных экспериментов у крыс с диабетической патологией. Так, Гимнема-25 в дозе 280 мг/кг (при пероральном применении в течение 7 дней) увеличивает поглощение глюкозы диафрагмой крыс с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным диабетом.

Рис 7. Влияние Гимнемы-25 при пероральном введении в дозе 280 мг/кг на поглощение глюкозы изолированной диафрагмой крыс в сравнении с группой контроля (М±m).

Обозначения: по оси абсцисс - группы животных, получавших препараты, по оси ординат - коэффициент поглощения глюкозы (мг глюкозы/г диафрагмы).

Б+И - буфер + инсулин; Б+Д - буфер + диафрагма; Б+Д+И - буфер + диафрагма + инсулин

Так, способность мышечной ткани к поглощению глюкозы в группе крыс получавших Гимнему-25, в 1,9 раза превышает аналогичный показатель у животных группы контроля и соответствует снижению ее количества в пробе на 16,2% (р0,05). В присутствии инсулина остаточная глюкоза определяется в количестве 6,8 ммоль/л, что соответствует достоверному снижению ее уровня на 32,1% по отношению к контрольной пробе с буфером и инсулином (рис. 8). Полученные данные свидетельствуют о непосредственном влиянии изучаемого экстракта на процессы утилизации глюкозы, которые, как известно, осуществляются с помощью белков-переносчиков - ГЛЮТов. В данном случае, возможный механизм элиминации глюкозы из кровяного русла осуществляется с помощью одного из транспортеров глюкозы 4 (GLUT 4), который представляет собой преобладающую форму в мышечной ткани. Он имеет большую аффинитивность к глюкозе. Поэтому она очень быстро при постпрандиальной гипергликемии может оказаться в клетках. Благодаря этому концентрация глюкозы в крови остаются относительно постоянны [Балаболкин М.И., 2000]. Учитывая вышеперечисленное, повышение утилизации глюкозы периферическими тканями при курсовом введении Гимнемы-25 можно объяснить непосредственным влиянием последней на указанный рецепторный аппарат.

Рис. 8. Влияние Гимнемы-25 при пероральном введении в дозе 280 мг/кг на поглощение глюкозы изолированной диафрагмой крыс в сравнении с группой контроля (стрептозотоциновый диабет) (М±m).

Обозначения: Б+И - буфер + инсулин; Б+Д - буфер + диафрагма; Б+Д+И - буфер + диафрагма + инсулин

Широко известно, что сахарный диабет часто сопряжен с различного вида нарушениями реологических свойств крови [Бондарь Т.П., 2003]. В патогенезе диабетических ангиопатий большое значение отводят изменениям системы гемостаза и реологическим патологиям (деформабельность и агрегация эритроцитов, увеличение агрегационной способности тромбоцитов, угнетение фибринолиза, дисфункции сосудистого эндотелия), что нарушает внутрисосудистую гемодинамику и приводит к формированию тромбов. Важными составляющими микроангиопатии при сахарном диабете являются нарушение вязкости крови и дисфункция тромбоцитов [Jenssen T., 1999]. Поэтому обоснованно использование средств, улучшающих реологические свойства крови. Современной тенденцией является включение в комплексную терапию сахарного диабета не только гипогликемизирующих средств, но и препаратов, оказывающих влияние на уменьшение окислительного стресса и улучшение реологических свойств крови [Jenssen T., 1999]. Установлено, что при применении Гимнемы-25 снижается вязкость крови крыс с сахарным диабетом при всех скоростях сдвига.

Как видно из представленных результатов в таблице 2, при применении Гимнемы-25 выявлено, что при высоких скоростях сдвига вязкость крови была на 24,5% ниже аналогичного показателя у крыс с сахарным диабетом, что свидетельствует о некотором воздействии Гимнемы-25 на пластические свойства мембраны эритроцитов. При низких скоростях сдвига наблюдается усиление эффекта после применения Гимнемы-25.

Таблица 2.Влияние Гимнемы-25 (280 мг/кг) при пероральном введении в течение 21 дня на вязкость крови и индексы агрегации эритроцитов крыс с экспериментальным сахарным диабетом при различных скоростях сдвига (Mm).

Примечание:

^* - данные достоверны по отношению к контрольной группе крыс, больных сахарным диабетом (р<0,05), критерий Манна-Уитни.

^¦ - данные достоверны по отношению к контрольной группе интактных крыс (р<0,05), критерий Манна-Уитни.

При этом полученные данные указывают на возможное снижение уровня гликилирования белков мембраны эритроцитов из-за повреждающего действия глюкозы и увеличение эластичности клеточной оболочки, что также может сказываться на восстановление физико-химических свойств клеточной мембраны, и как следствие снижение ее «жесткости» [Бондарь Т.П., 2003]. Таким образом, изученный экстракт оказывает воздействие как на агрегационный, так и на деформационный компоненты реологических свойств клеток крови, что способствует нормализации микроциркуляции крови, нарушенной при сахарном диабете. При курсовом введении Гимнемы-25 наблюдалось снижение гиперагрегации тромбоцитов и гиперкоагуляционного статуса, выявленных при сахарном диабете. Так, после применения Гимнемы-25 наблюдалось уменьшение тромбинового времени по сравнению с животными с сахарным диабетом. А значение активированного парциального тромбопластинового времени было ниже на 13,4%, чем у крыс с диабетом.

В настоящее время в литературе активно обсуждается вопрос о роли оксидативного стресса в развитии диабетических сосудистых осложнений [Ефимов А.С., 2001; Baynes J., 1991; Nathan D.M., 2006]. Установлено, что гипергликемия в результате активации ряда биохимических путей (аутооксидации глюкозы, накопления полиолов, гликозилирования белков) может приводить к усиленному накоплению свободных радикалов, которые, в свою очередь, нарушают функцию эндотелия и ведут к ускоренному развитию атеросклероза [Ефимов А.С., 2001]. В результате самоокисления глюкозы образуются свободные радикалы кислорода, которые запускают процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазматических мембран, вследствие чего и образуются конечные продукты не ферментного гликозилирования в сосудистой стенке [Baynes J., 1991]. В связи с вышеизложенным, можно сделать вывод, что логичным и патогенетически обоснованным является применение в комплексной терапии сахарного диабета препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами. Эти лекарственные средства не только замедляют процесс прогрессирования специфических сосудистых осложнений, но и сохраняют секреторные способности в-клеток. Влияя на фосфолипидный слой клеточной мембраны, антиоксиданты повышают чувствительность к инсулину, благодаря чему достигается более полная компенсация сахарного диабета [Baynes J., 1991].

В ходе проведенных исследований выявлено, что Гимнема-25 проявляет антиоксидантные свойства у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом, уменьшая образование как начальных, так и конечных продуктов перекисного окисления. Так, на модели аскорбат-зависимого ПОЛ показано, что при применении Гимнемы-25 эффективно снижается образование конечных ТБК-активных продуктов липопероксидации. При этом наблюдается дозозависимый эффект. Учитывая роль процессов пероксидации в развитии гемореологических и микроциркуляторных нарушений при сахарном диабете можно сделать предположение, что выявленные антиоксидантные свойства Гимнемы-25 могут уменьшать выраженность развития осложнений сахарного диабета.

Наряду с тем, что борьба с гипергликемией - ключевым метаболическим нарушением при сахарном диабете типа 2 - исторически занимает основное место в лечении этого заболевания, терапия других ассоциированных расстройств также важна [Nathan D.M., 2006]. При сахарном диабете типа 2 нарушения углеводного обмена сочетаются с выраженными изменениями липидного обмена [Балаболкин М.И., 2001]. Согласно результатам исследования, представленным в таблице 3, сахарный диабет сопровождается повышением содержания в сыворотке крови общего холестерина, липопротеидов низкой плотности, триглицеридов и снижением липопротеидов высокой плотности, что согласуется с литературными данными [Чугунова Л.А., 2000].

Таблица 3.Влияние Гимнемы-25 на липиды плазмы крови у интактных крыс и животных с иммунозависимой формой сахарного диабета.

Обозначения:

ХСобщ - концентрация общего холестерина в плазме крови крыс (ммоль/л);

ХС_ЛПВП - концентрация холестерина липопротеидов высокой плотности в плазме крови крыс (ммоль/л);

ХС_ЛПНП - концентрация холестерина липопротеидов низкой плотности в плазме крови крыс (ммоль/л);

ХС_ЛПОНП - концентрация холестерина липопротеидов очень низкой плотности в плазме крови крыс (ммоль/л);

ТГ - концентрация триглицеридов в плазме крови крыс (ммоль/л);

ИАТ - индекс атерогенности (отн.ед.)

Примечание:

* - данные достоверны по отношению к группе интактных крыс, Newman-Keuls test (р<0,05).

^¦ - данные достоверны по отношению к группе контрольных крыс с экспериментальным сахарным диабетом, Newman-Keuls test (р<0,05).

Одновременно с гиперлипидемией происходят значительные изменения активности ферментов антиоксидантной системы и увеличение показателей ПОЛ. Установлено, что атеросклероз и связанные с ним заболевания протекают при значительном повышении содержания в плазме крови фракции ЛПНП, а во многих случаях и фракции ЛПОНП [Чугунова Л.А., 2000]. При изучении показателей дислипидемии на модели иммунозависимого экспериментального сахарного диабета после применения Гимнемы-25 отмечено снижение уровней липидов низкой и очень низкой плотности на 8,7% и 16,4% соответственно, по отношению к группе животных с сахарным диабетом. Кроме того, наблюдалась тенденция повышения уровня липопротеидов высокой плотности, содержание которых в плазме крови снижается при развитии сахарного диабета, что возможно связано с препятствием всасывания в тонком кишечнике содержащих холестерин желчных кислот и прерыванием их энтеропеченочной рециркуляции. Так, уровень ЛПВП был выше на 24,4% по отношению к показателям крыс с диабетом. Также, следует отметить, что в настоящем исследовании индекс атерогенности был ниже на 25,9% по отношению к животным с диабетом, что может свидетельствовать о нормализации липидного спектра крови животных. Полученные данные согласуются с таковыми в литературе о влиянии водно-спиртового экстракта Гимнемы на уровень липидов в крови [Norihiro S., 2001]. В ходе проведенных исследований установлено, что Гимнема-25 относится к классу малотоксичных веществ (величина LD₅₀ при пероральном введении составляет > 5г/кг).

Таким образом, Гимнема-25 может использоваться для разработки лечебных комплексов, используемых в качестве терапии сахарного диабета второго типа и профилактики отдаленных осложнений данного заболевания. Однако при их создании необходимо обратить внимание на компоненты, усиливающие антиоксидантное и гиполипидемическое действие.

ВЫВОДЫ

1. Гипогликемическая активность сухих экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от степени очистки экстракта уменьшается в ряду: Гимнема-25>Гимнема-50?Гимнема-75.

2. Гимнема-25 проявляет антидиабетогенные свойства в экспериментах на животных со стрептозотоцин-индуцированным и иммунозависимым сахарным диабетом, что подтверждается снижением гипергликемии и полидипсии, а также уменьшением количества гликозилированного гемоглобина в крови крыс.

3. Гимнема-25 оказывает ингибирующее действие на всасывание глюкозы и жирных кислот в кишечнике крыс как при пероральном введении животным, так и при непосредственном добавлении в перфузат при постоянной перфузии тонкого кишечника крыс.

4. При курсовом введении Гимнема-25 способствует увеличению скорости утилизации глюкозы мышечной тканью (диафрагмой) интактных животных и крыс с сахарным диабетом.

5. Гимнема-25 при пероральном применении снижает цитотоксическое действие стрептозотоцина на в-клетки поджелудочной железы, способствуя увеличению площади островков и ядер в-клеток поджелудочной железы.

6. При пероральном применении Гимнема-25 способствует нормализации реологических свойств крови при экспериментальном стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете, что подтверждается снижением вязкости крови во всем диапазоне скоростей сдвига. Гимнема-25 снижает гиперагрегацию тромбоцитов.

7. Гимнема-25 оказывает воздействие на липидный спектр крови крыс с иммунозависимым сахарным диабетом. Установлено снижение уровней ХС, ЛПНП и ЛПОНП. При этом показатель индекса атерогенности был ниже на 25,9% по сравнению с животными с сахарным диабетом.

8. При применении Гимнемы-25 снижается образование конечных ТБК-активных продуктов липопероксидации. Гимнема-25 в больших концентрациях проявляет антиоксидантную активность в условиях in vivo, что выражается в снижении уровней конъюгированных диенов, малонового диальдегида и супероксиддисмутазы.

9. По уровню острой токсичности при пероральном введении Гимнема-25 относится к классу малотоксичных веществ (LD₅₀ > 5г/кг).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

гимнема экстракт сахарный диабет

1. Влияние сухого экстракта Gymnema sylvestre на содержание глюкозы в крови интактных крыс // Тез. докл.. IX Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области: Тезисы докладов. Изд-во ВолГМУ. 2004 - С 63-64 (соавт. Самохина М.П., Степанов А.В.).

2. Гипогликемические свойства экстракта Гимнемы лесной на модели иммунозависимого сахарного диабета // Материалы 63-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых учёных ВолГМУ, посвященной 70-летию ВолГМУ (с международным участием) «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2005. - С. 92 (соавт. Агарков Д.Ю., Самохина М.П., Степанов А.В.).

3. Гипогликемические свойства экстракта Gymnema sylvestre на поглощение глюкозы мышечной тканью крыс (изолированной диафрагмой) // Тез. докл. X Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. ВолГМУ-Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2005. - С. 41-42 (соавт. Самохина М.П.).

4. Влияние сухого экстракта Гимнемы лесной на уровень глюкозы в крови у крыс с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом // Материалы 64-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых учёных ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2006. - С. 132-133 (соавт. Агарков Д.Ю., Чепляева Н.И., Самохина М.П.).

5. Сахароснижающие свойства экстракта Гимнемы лесной при экспериментальном стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете // Материалы 64-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых учёных ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2006. - С. 139 (соавт. Агарков Д.Ю., Чепляева Н.И., Самохина М.П.).

6. Влияние сухого экстракта Гимнемы лесной на развитие и течение иммунозависимой формы сахарного диабета у крыс // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2006. - С. 795 (соавт. Спасов А.А., Самохина М.П., Буланов А.Е., Агарков Д.Ю.).

7. Изучение гипогликемической активности лекарственной Композиции на основе Гимнемы лесной у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе // XI Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации. - М., 2006. - С. 157 (соавт. Самохина М.П., Науменко Л.В., Агарков Д.Ю.).

8. Изучение влияния сухого экстракта Gymnema sylvestre в гравиметрической концентрации 25% на поглощение глюкозы мышечной тканью крыс в условиях экспериментального стрептозотоцин-индуцированного диабета Тез. докл. XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2006. - С. 18-19 (соавт. Агарков Д.Ю., Чепляева Н.И.).

9. Гипогликемические свойства экстракта Гимнемы лесной // Вестник ВолГМУ. - Волгоград, 2007. - №1 (21). - С. 79-82 (соав. Спасов А.А., Самохина М.П., Писарев В.Б., Снигур Г.Л., Агарков Д.Ю., Буланов А.Е.).

10. Изучение влияния «ДИА-» на уровень гликемии у крыс с нарушениями углеводного обмена // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 873 (соавт. Спасов А.А., Самохина М.П., Буланов А.Е., Агарков Д.Ю.).

11. Сравнительная характеристика гипогликемических свойств препаратов Диа-в и При-в // Материалы 65-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых учёных ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2007. - С. 151-152 (соавт. Чепляева Н.И., Самохина М.П.).

12. Гемореологическая активность экстрактов Гимнемы лесной при стрептозотоцин-индуцированном сахарном диабете // Экспериментальная и клиническая фармакология. - М., 2008. - Том 71, №3. - С. 31-33 (соав. Спасов А.А., Самохина М.П., Буланов А.Е., Науменко Л.В., Агарков Д.Ю.).

Размещено на Allbest.ru