Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І. І. МЕЧНИКОВА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ»

УДК: 615.281:579.861.2:579.882.11

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Комплексна дія протимікробних засобів на консорціум Сandida albicans і Staphylococcus aureus

03.00.07 - мікробіологія

Кочнєва Олена Володимирівна

Харків - 2014

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Харківському національному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Мінухін Валерій Володимирович, Харківський національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Похил Сергій Іванович, ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України», завідувач лабораторії нових та маловивчених інфекційних захворювань;

доктор медичних наук, професор Палій Гордій Кіндратович, Вінницький національний медичний університет ім. М. І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

Захист відбудеться « 27 » січня 2015 року о « 11.00 » годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України» за адресою: 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Автореферат розісланий «26» грудня 2014 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01, кандидат медичних наук Бруснік С. В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. До теперішнього часу залишається актуальним питання щодо розуміння існування мікроорганізмів як соціальних співтовариств, які формують багаточисельні асоціації. Компоненти цих асоціацій активно взаємодіють між собою, формуючи специфічно організовані та прикріплені до субстрату біоплівки. Мікроорганізми в біоплівках об'єднані складними міжклітинними зв'язками, які підтримують «відчуття кворуму» (Parsek M. R., 2005).

Мікробні біоплівки можуть утворюватися як одним, так і декількома різновидами збудників, формуючи складні міжвидові співтовариства (Adam B. et al., 2002; Harritt M., 2009). Консорціум Candida albicans і Staphylococcus aureus посідає третє місце серед причин виникнення мікстних захворювань з тяжкими ускладненнями та високою смертністю. За даними вчених у 27 % випадків асоціація цих збудників викликає нозокоміальні інфекції та сепсис (Klotz S. A. et al., 2007).

У багатьох країнах світу науковцями проводяться дослідження щодо визначення комбінованої дії протимікробних препаратів на інфекції, які викликані асоціацією C. albicans і S. aureus (Harriott M. et al., 2009), але й дотеперішнього часу спектр використання антимікробних речовин, ефективних відносно цього консорціуму, залишається обмеженим.

Незважаючи на те, що проводяться дослідні роботи в цій галузі, досі недостатньо вивчені питання щодо процесів взаємодії мікроорганізмів у міжвидових асоціаціях, закономірностей формування гетеромікробних біоплівок, утворених C. albicans і S. aureus, факторів їх патогенності та вірулентності, а також механізмів формування резистентності до хіміотерапевтичних препаратів. Тому, актуальним завданням є визначення нових комбінацій протимікробних засобів ефективних відносно консорціуму C. albicans і S. aureus.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційне дослідження проведено у рамках виконання планової фундаментальної науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології ХНМУ „Оптимізація діагностики й протимікробної терапії гнійно-запальних процесів з урахуванням комунікативних властивостей мікроорганізмів”, № держреєстрації 0111U00142. Дисертантом особисто виконано експериментальні дослідження щодо вивчення біологічних властивостей клінічних штамів C. аlbicans і S. аureus, виділених від хворих із різними гнійно-запальними інфекціями, визначена чутливість цих патогенів до хіміотерапевтичних препаратів різних груп, проведено статистичну обробку і аналіз отриманих результатів досліджень.

Тему дисертаційної роботи затверджено на Вченій раді ХНМУ (протокол № 5 від 20.05.2010 р.), проблемною комісією МОЗ і НАМН України зі спеціальностей 03.00.06 - вірусологія, 03.00.07 - мікробіологія (протокол № 109 від 29.04.2010 р.).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - підвищення ефективності дії комбінованих протимікробних речовин відносно асоціації Candida albicans і Staphylococcus aureus, які є поширеними збудниками інфекційних хвороб шкіри і підшкірної клітковини, на підставі отримання нових наукових даних про біологічні властивості цих патогенів.

Для досягнення мети визначено основні завдання дослідження:

1. Визначити чутливість до протимікробних препаратів (антибіотиків, антисептиків та антимікотиків) клінічних ізолятів та референтних штамів С. аlbicans і S. aureus.

2. Вивчити адгезивні властивості клінічних ізолятів та референтних штамів С. аlbicans і S. aureus.

3. Дослідити фагоцитарну активність нейтрофілів відносно клінічних ізолятів та референтних штамів С. аlbicans і S. аureus.

4. Встановити рівень вмісту тейхоєвих кислот у клітинах клінічних та референтних штамів S. аureus.

5. Порівняти здатність до формування біоплівок клінічних та референтних штамів C. аlbicans і S. аureus.

6. Вивчити ферментативну активність у клітинах клінічних і референтних штамів С. аlbicans і S. аureus.

7. Встановити кількісний вміст мікроелементів у клітинах клінічних і референтних штамів S. аureus.

8. Визначити комбінації протимікробних речовин з найвищою інгібуючою дією на асоціацію C. аlbicans і S. аureus в дослідах in vitro.

Об'єкт дослідження - асоціація С. аlbicans і S. аureus, які є поширеними збудниками інфекційних хвороб шкіри і підшкірної клітковини.

Предмет дослідження - біологічні властивості мікроорганізмів в асоціації С. аlbicans і S. aureus та ефекти дії на неї комбінованих протимікробних речовин.

Методи дослідження: бактеріологічний - виділення чистої культури клінічних штамів C. аlbicans і S. аureus; визначення здатності до формування біоплівок клінічних та референтних штамів C. аlbicans і S. аureus, а також їх антибіотикочутливості; бактеріоскопічний - вивчення морфологічної структури бактеріальних клітин; біохімічний - визначення вмісту тейхоєвих кислот, мікроелементів та ферментативної активності мікроорганізмів; цитологічний - вивчення адгезивних властивостей та фагоцитарної активності нейтрофілів; статистичний - обробка отриманих даних за допомогою стандартного пакету прикладних програм для медично-біологічних досліджень на персональному комп'ютері з застосуванням програм Microsoft Office для Windows XP.

Наукова новизна одержаних результатів. Комплексне дослідження біологічних властивостей штамів C. аlbicans і S. аureus дозволило вперше виявити взаємозв'язок між структурними елементами клітинної стінки мікроорганізмів, їх адгезивними властивостями, стійкістю до фагоцитозу та здатністю до формування біоплівок. Встановлено пряму кореляційну залежність між рівнем вмістому тейхоєвих кислот у клітинах клінічних штамів S. аureus, показниками адгезивності (r = 0,643) та здатністю до біоплівкоутворення мікроорганізмами. З'ясовано, що посилення синтезу ферментів направлених на окисно-відновні процеси для формування факторів захисту мікробної клітини та формування антибіотикорезистентності асоціює із підвищенням їх протидії до фагоцитозу.

Вперше визначено, що збільшення у клітинах клінічних ізолятів S. аureus вмісту калію (84,2±1,84) мкмоль/мл у порівнянні з вмістом натрію (70,4±2,8) мкмоль/мл призводить до зміни біопотенціалу на зовнішній мембрані клітин та впливає на здатність мікроорганізмів до формування біоплівок. Для референтних штамів ці показники були менші (р<0,05) та становили - (61,12±2,71) мкмоль/л для калію і (58,12±1,8) мкмоль/л для натрію.

Доповнено наукові дані про комбіновану дію протимікробних речовин відносно асоціації C. аlbicans і S. аureus. Встановлено, що найбільшу активність відносно консорціуму C. аlbicans і S. аureus в дослідах in vitro, серед вивчених протимікробних речовин, має комбінація антимікотика тербінафіну та антисептика бензоїлпероксиду, МІК - (1,3±0,09) мкг/мл. Вперше доведено, що вказана комбінація впливає не тільки на планктонні форми клітин, а й на мікроорганізми мобілізовані у біоплівках.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі експериментальних даних при визначенні дії протимікробних засобів встановлено найбільш ефективну комбінацію на основі антимікотичної речовини тербінафіну та антисептичної речовини бензоїлпероксиду, що є перспективним для подальшої розробки нових підходів профілактики та лікування гнійно-запальних інфекцій, викликаних асоціацію C. аlbicans і S. аureus у лікувально-профілактичних установах. Запропоновано спосіб зниження патогенних і вірулентних властивостей асоціації C. albіcans і S. aureus комбінацією протимікробних засобів на основі антимікотичної речовини тербінафіну та антисептика на основі бензоїлпероксиду (інформаційний лист № 321 від 04.06.2013 р., патент України на корисну модель № 88795 від 25.03.2014 р.). Результати проведеного мікробіологічного дослідження щодо визначення рівня вмісту тейхоєвих кислот, як фактору патогенності штамів S. аureus, пропонуються для впровадження в клініко-діагностичні лабораторії для підвищення ефективності розпізнавання захворювань, які спричинені цими патогенами. Розроблено та впроваджено у практику спосіб визначення патогенності Staphylococcus aureus за рівнем вмісту тейхоєвих кислот у їх клітинах (патент України на корисну модель № 88794 від 25.03.2014 р.).

Результати дисертаційних досліджень впроваджені у навчальні програми кафедри мікробіології, вірусології та імунології Тернопільського державного медичного університету ім. І. Я. Горбачевського (акт про впровадження від 17.04.2013 р.) та Одеського національного медичного університету (акт про впровадження від 16.05.2013 р.), впроваджені у практику Харківської міської клінічної лікарні № 30 (акти про впровадження від 30.04.2014 р.) та ДУ «Інституту загальної та невідкладної хірургії НАМН України» (акти про впровадження від 23.06.2014 р.).

Особистий внесок здобувача. За особистої участі дисертанта визначена тема та мета дослідження, обґрунтовано актуальність і основні напрямки роботи, окреслено задачі наукових досліджень. Автором самостійно проведено аналіз літературних джерел та патентної інформації, визначено в експериментальних дослідженнях чутливість клінічних та референтних штамів С. аlbicans і S. аureus до хіміотерапевтичних препаратів. За результатами дослідження встановлено пряму кореляційну залежність між рівнем вмістому тейхоєвих кислот клітин S. аureus та їх адгезивними властивостями (r = 0,643), на основі чого запропоновано спосіб визначення патогенності S. aureus за рівнем тейхоєвих кислот. Дисертантом запропоновано спосіб зниження активності мікстної асоціації C. albicans і S. aureus шляхом застосування комбінації протимікробних речовин на основі антимікотика тербінафіну та антисептика бензоїлпероксиду. Проведено науковий аналіз, статистичну обробку, інтерпретацію та узагальнення отриманих результатів. Сформульовано висновки та практичні рекомендації.

Персональний внесок автора оприлюднено у написаних самостійно або у співавторстві наукових працях фахових і міжнародних видавництвах, які наведено за текстом дисертації та в авторефераті у списку публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на семінарах та наукових форумах, у тому числі з міжнародною участю: Х науково-практична конференція з міжнародною участю «Рани, ранова інфекція, пластика та з'єднання тканин» (Київ, 2010); VI международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, 2011); міжнародна науково-практична конференція «Biofilms in nosocomial fungal infections» (Paris, 2011); VII міжнародна наково-практична конференція «NAUKOWA PRZESTRZEС EUROPY - 2011» (Praha, 2011); всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 70-летию профессора А. А. Чумакова «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль 2012); тематична наукова-практична конференція молодих вчених та студентів «Сучасні питання антибіотикотерапії» (Харків, 2012); межвузівська конференція молодих вчених та студентів «Медицина третього тисячоліття» (Харків, 2010, 2012, 2013, 2014); VIIІ з'їзд Товариства мікробіологів України ім. С. М. Виноградського (Ялта, 2013); науково-практична конференція з міжнародною участю, присвячена 90-річчю кафедри інфекційних хвороб ХНМУ (Харків, 2013); 5-я Международная научно-практическая конференция (Белгород, 2013); межвузовская ежегодная заочная научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины» (Екатеринбург, 2014); всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2014); міжкафедральна науково-практична конференція студентів-бакалаврату «Антибіотикорезистентність. Сучасний погляд на проблему та шляхи подолання» (Харків, 2014); міжнародна наукова конференція «Мікробіологія та імунологія - перспективи розвитку в XXI столітті» (Київ, 2014); VII International interdisciplinary scientific conference of young scientists and medical students (Харків, 2014), 24^th ECCMID (Barselona, 2014); XVIII міжнародний конгрес студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2014).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 31 наукова праця (4 - у моноавторстві), у тому числі 8 статей (2 - у моноавторстві), з них 6 у наукових фахових виданнях, затверджених МОН України, 2 статті у міжнародних провідних виданнях, 20 тез у збірниках матеріалів з'їздів та науково-практичних конференцій (5 - із міжнародною участю), 2 патенти України на корисну модель, один інформаційний лист про нововведення в сфері охорони здоров'я.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 165 сторінках машинописного тексту. В структурі дисертації: вступ, огляд літератури, матеріали та методи дослідження, 4 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, висновки, практичні рекомендації, додаток. Робота ілюстрована 14 рисунками, містить 32 таблиці, список використаної літератури викладено на 21 сторінці (всього 203 джерела, серед них 117 - україно- та російськомовних кирилицею, 86 - іноземних латиною).

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано актуальність проблеми, визначена мета, завдання, об'єкт та предмет дослідження, сформульовано наукову новизну, розкрито теоретичне та практичне значення роботи.

В огляді літератури проаналізовано сучасний стан проблеми щодо ролі консорціума С. аlbicans і S. аureus у виникненні гнійно-запальних інфекцій. Наведено узагальнені дані про співіснування і взаємодію цих мікроорганізмів в асоціації. Проаналізовано сучасний стан питання щодо здатності бактерій до формування біоплівок, їх антибіотикорезистентності та шляхів вирішення цієї проблеми.

Матеріали і методи дослідження. Для реалізації мети та вирішення завдань, поставлених у роботі, впродовж її виконання було досліджено 70 штамів мікроорганізмів: 55 штамів S. аureus виділених від хворих на різні гнійно - запальні процеси у перші 48 год. з моменту госпіталізації до стаціонару та 4 референтних штами (по 2 штама АТСС 25923, АТСС 6538 Р) в якості контрольної групи; 10 штамів C. аlbicans, які були виділені з мокротиння від хворих на пневмонію і змивів трахеї та один референтний штам АТСС 885-653. Усі штами S. аureus було об'єднано у 4 групи з урахуванням перебігу інфекційного процесу при якому вони виділені: група 1 - штами виділені з гнійного відділяємого ран при гострих інфекційних процесах шкіри та підшкірної клітковини; група 2 - штами виділені з гнійного відділяємого ран при затяжних інфекційних процесах шкіри та підшкірної клітковини; група 3 - штами виділені з слизу зіву та носа при обстеженні на носійство; група 4 - референтні штами (контрольна група).

Виділення та ідентифікацію чистої культури штамів S. аureus і C. аlbicans проводили за загальноприйнятими мікробіологічними методами, на основі морфологічних, тінкторіальних, культуральних та біохімічних властивостей. протимікробний штам нейтрофіл

Для визначення антибіотикочутливості штамів використовували диско - дифузійний метод. Чутливість штамів до антибактеріальних препаратів визначали за допомогою стандартизованих дисків (НИЦФ, м. Санкт-Петербург). Отримані результати порівнювали із нормативними значеннями згідно методичних вказівок «Про визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» затверджених наказом МОЗ України від 05.04.2007 № 167. Мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) протимікробних речовин на планктонні клітини ізолятів та референтних штамів S. аurеus і C. аlbicans визначали методом серійних розведень. Антимікробну активність відносно асоціації клінічних штамів С. аlbicans і S. аureus вивчали на трьох комбінаціях протимікробних речовин: тербінафін і бензоїлпероксид; тербінафін, еритроміцин та ефірна олія полину; еритроміцин, тербінафін і лаферон.

Для визначення адгезивних властивостей мікроорганізмів був застосований метод Бриліса В. І. та співавторів (1991) з обрахунком середнього показника адгезії.

Фагоцитарну активність нейтрофілів in vitro визначали за уніфікованими методами Меньшикова В. В. (1987).

Здатність мікроорганізмів до формування біоплівок вивчали за методикою Романової Ю. М., Гінзбурга А. Л. (2004). Отримані результати оцінювали за показниками середньої оптичної щільності (од. ОЩ.) при довжині хвилі 545 нм та підраховували кількість КУО після відповідних розведень.

Визначення вмісту тейхоєвих кислот (ТК) проводили фотометричним методом. При цьому, екстрагування ТК здійснювали 10%-ною трихлороцтовою кислотою при 2-4 °С впродовж 24 год. з наступним осадженням ацетоном. Кількісні показники ТК вимірювали на СФ-46 при довжині хвилі 254 нм.

Визначення основних метаболітів катаболізму глюкози - ацетату та лактату проводили за методами, наведеними у Асатіані В. С. (1969). Аспартатдегідрогеназу визначали по закисленню середовища (з використанням iндикатора крезолового червоного) після його iнкубацiї, вимiрювали оптичну щільність при довжині хвилі 547 нм. Фосфофруктокiназну (КФ 2.7.1.11.) визначали за швидкістю окислення НАДН₂ з використанням суміжних ферментів - фруктозо-1,6-дифосфатальдолази, гліцерол-3-фосфатдегiдрогенази та тріозофосфатізомерази. Активність глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази (КФ 1.1.1.49) визначали за методом Kornberg А., Horecker B. (1955), по реакцiї вiдновлення HAДФ⁺ при окисленнi глюкозо-6-фосфату.

Активнiсть ферментiв виражали в нмолях перетвореного субстрату за 1 (хв.) на 1 мг бiлка.

Дослідження кількісного вмісту елементного складу клітин S. аureus проводили методом атомно-абсорбційної спектроскопії (дослідження проводили на базі Харківського науково-дослідного інституту гігієни праці та професійних захворювань).

Каталітичну активність аспарагінової протеінази C. albicans оцінювали спектрофотометричним методом по зменшенню концентрації субстрату - гемоглобіну (Hb), у присутності ферменту.

При визначенні фосфоліпазної активності C. albicans використовували титрометричний метод в модифікації Суплотова С. Н. (2009). Показники оцінювали в ммоль/лЧгод. Для вивчення протеазної активності використовували біуретовий метод, показники оцінювали в мг/хв.Чмл.

Результати дослідження обробляли з використанням прикладних програм EXEL і «STATISTICA 6». Розраховували середню арифметичну та її стандартну помилку (М±m). Достовірність відмінностей оцінювали за допомогою критерія Стьюдента (t). Відмінності розцінювали як статистично значущі при р<0,05. Взаємозв'язок параметрів оцінювали методом кореляційного аналізу, визначаючи коефіцієнт рангової кореляції Спірмена (rs).

Результати досліджень та їх обговорення. Антибіотикочутливість клінічних і референтних штамів Staphylococcus aureus. Чутливість S. aureus визначали до наступних антибіотиків: цефотаксим, цефалотин, цефалексин, цефаклор, цефазолін, цефуроксим, канаміцин, еритроміцин, рокситроміцин, рифампіцин, кліндаміцин, фузидин, метицилін.

При визначенні чутливості штамів S. aureus диско-дифузійним методом до антибактеріальних препаратів було встановлено, що найбільш ефективну дію (р<0,05) виявили цефалоспорини 1-го покоління (цефалотин - 40 (67,8 %) чутливих штамів) та 2-го покоління (цефаклор 49 - (83 %) чутливих штамів), майже 80 % штамів, які досліджувались були полірезистентними, серед них 40 % метицилінрезистентних штамів (MRSA).

При визначенні чутливості штамів C. albicans до протимікробних речовин методом серійних розведень встановлено, що найбільш ефективну дію (р<0,05) виявили тербінафін, МІК - (4,0±0,27) мкг/мл та амфотеріцин В, МІК - (1,2±0,05) мкг/мл.

Адгезивні властивості клінічних та референтних штамів C. аlbicans і S. aureus. За даними проведеного дослідження було встановлено, що показники адгезивності були більш високі (р<0,05) у клінічних ізолятів, ніж у референтних штамів (табл. 1). Так, індекс адгезивності мікроорганізмів (ІАМ) для клінічних ізолятів C. albicans складав - (5,72±1,1), для референтних штамів - (3,09±0,15). Показники індексу адгезивності для клінічних ізолятів S. aureus становили - (4,98±1,3), для референтних штамів - (2,44±0,54).

З 59 штамів золотистого стафілокока, які вивчалися 84,7 % мали високоадгезивні властивості, 8,5 % були низькоадгезивними, інші 6,8 % - неадгезивними. Штами C. аlbicans мали високоадгезивні властивості у 87 %, низькоадгезивні - близько у 13 %.

При вивченні адгезивних властивостей C. аlbicans і S. аureus в мікропрепаратах, на поверхні еритроцитів виявляли як окремі мікробні клітини, так і групи клітин, об?єднані між собою, інколи, у вигляді суцільного шару. Така картина спостерігалась у високоадгезивних, а іноді у середньоадгезивних штамів. Якщо культури мікроорганізмів були неадгезивними, то на поверхні еритроцитів мікробні клітини не виявлялися.

Таблиця 1 Середні показники адгезивних властивостей клінічних та референтних штамів C. albicans і S. аureus

Примітка. * - різниця достовірна з контролем (референтні штами) (р<0,05); представлено результати досліджень 3-х повторів.

Найвищі (р<0,05) показники адгезивної активності виявлено у асоціацій мікроорганізмів C. albicans і S. aureus, що вірогідно свідчить про посилення вірулентних властивостей цих патогенів у консорціумі. Індекс адгезивності мікроорганізмів для клінічних ізолятів C. albicans + S. aureus складав - (7,17±1,76), для референтних штамів - (3,41±1,24).

Фагоцитарна активність нейтрофілів відносно клінічних та референтних штамів C. аlbicans і S. aureus. За результатами проведеного дослідження встановлено зниження (р<0,05) фагоцитарної активності нейтрофілів щодо клінічних ізолятів C. albicans і S. aureus у порівнянні із референтними штамами цих мікроорганізмів (рис. 1). Показники фагоцитарної активності були достовірно вищими (р<0,05) відносно референтних штамів асоціації C. аlbicans + S. aureus: індекс поглинання - (65,0±6,39) %, фагоцитарне число - (3,36±0,27), відсоток перетравлення - (70,89±3,9) % та індекс перетравлення - (1,66±0,02) %. Відносно клінічних ізолятів асоціації C. аlbicans + S. aureus ці показники складали: індекс поглинання - (42,6±4,22) %, фагоцитарне число - (3,03±0,07), відсоток перетравлення - (54,23±4,06) % та індекс перетравлення - (0,69±0,05) %.

Рис. 1. Показники фагоцитарної активності нейтрофілів (фагоцитарне число) відносно штамів C. аlbicans і S. aureus та їх асоціацій

Таким чином, встановлено достовірну різницю між показниками стійкості до фагоцитозу у клінічних ізолятів та референтних штамів (р<0,05), при цьому клінічні штами асоціації C. аlbicans + S. aureus виявили найбільш агресивні властивості відносно фагоцитів.

Вміст тейхоєвих кислот у клітинах клінічних та референтних штамів Staphylococcus aureus. Результати проведеного дослідження показали, що показники рівня вмісту тейхоєвих кислот у клітинах S. аurеus клінічних ізолятів та референтних штамів достовірно відрізнялись (р<0,05). Показники середньої оптичної щільності для групи 1 складали - (0,542±0,016) од. ОЩ., а для групи 4 значення становило - (0,147±0,014) од. ОЩ., (р<0,05). Показники групи 2 і 3 були меншими у порівнянні з групою 1, але вищі ніж у референтних штамів. Значення для цих груп складали (0,381±0,019) од. ОЩ. та (0,196±0,013) од. ОЩ, відповідно.

Таким чином, можна зробити висновок, що рівень вмісту тейхоєвих кислот у клітинах S. аureus клінічних ізолятів більш високий (р<0,05), ніж у референтних штамів та залежить від локалізації інфекційного процесу. При гострих запальних процесах (штами групи 1) відмічалось збільшення показників вмісту тейхоєвих кислот у порівнянні з референтними штамами, що може вказувати на посилення вірулентності цих патогенів. Це, ймовірно, пов'язано із вищим ступенем агресивності клінічних штамів та впливає на активацію комплементу, що в свою чергу призводить до системної реакції, наслідком якої є зниження фагоцитарної активності.

При вивченні зв'язку між показниками адгезивних властивостей та рівнем вмісту тейхоєвих кислот клітин S. аureus, встановлено пряму кореляційну залежність (r = 0,643), що може бути пов'язано із здатністю мікроорганізмів до формування біоплівок (рис. 2).

n = 11

Коефіцієнт регресії: відхилення b - 0,1112, зрушення a - “+“3,8;

Коефіцієнт кореляції: r = 0,643, t - 10,62

Рис. 2. Аналіз кореляційної залежності між рівнем вмісту тейхоєвих кислот та адгезивними властивостями штамів S. aureus (пряма стійка кореляційна залежність)

Здатність до формування біоплівок клінічних та референтних штамів C. albicans і S. aureus. При визначені здатності до формування біоплівок відносно більші показники, що характеризують цей процес, були виявлені у клінічних ізолятів С. albicans - (1,0686±0,007) од. ОЩ., дещо менш активними щодо плівкоутворення були клінічні штами S. аureus - (1,0683±0,006) од. ОЩ., а найменші (р<0,05) показники такої активності були у референтних штамів S. аureus - (0,0550±0,005) од. ОЩ. та С. albicans - (0,0650±0,006) од. ОЩ. Для клінічних штамів асоціації C. аlbicans + S. aureus середні показники, за якими оцінювали здатність вказаної асоціації до плівкоутворення, складали - (1,0892±0,006) од. ОЩ., для референтних штамів - (0,0776±0,004) од. ОЩ.

Отже, біоплівки, які були утворені асоціацією мікроорганізмів C. аlbicans і S. aureus мали найвищі (р<0,05) показники оптичної щільності у порівнянні з біоплівками, які формували моновидові культури мікроорганізмів. Можливо припустити, що при утворенні асоціації мікроорганізмів збільшується їх сумарний патогенний потенціал та резистентність до хіміотерапевтичних препаратів, що підтверджують літературні дані.

Ферментативна активність клінічних та референтних штамів С. albicans і S. aureus. Проведені дослідження показали, що показники утворення лактату у клінічних ізолятів S. aureus перевищували - (13,85±0,64) мкмоль за 1 год. на 1 мг білка показники у референтних штамів - (12,95±0,23) мкмоль за 1 год. на 1 мг білка. Показники утворення пірувату були нижчі (р<0,05) у референтних штамів - (0,29±0,07) мкмоль за 1 год. на 1 мг білка, для клінічних ізолятів ці показники складали - (0,41±0,36) мкмоль за 1 год. на 1 мг білка. При аналізі кількісного співвідношення лактат/піруват виявлено зсув у бік лактату у клінічних штамів.

За даними аналізу співвідношення НАД⁺ і НАДН₂, як регуляторів функції дихального ланцюга мітохондрій встановлено, що у клінічних ізолятів відбувались реакції із зсувом у бік окислення (зменшення показників НАДН₂ - (0,005±0,0002) ммоль/л та збільшення НАД⁺ - (0,57±0,05) ммоль/л, у референтних штамів навпаки - у бік відновлення, що вказує на суттєві (р<0,05) відмінності катаболічного обміну, інтенсивності ряду реакцій пов'язаних з біосинтетичними процесами і змінами у складі мембранних структур штамів S. aureus різного походження.

При визначенні вмісту протеінази в клітинах C. albicans показники були дещо вищими у клінічних штамів та становили (3,7Ч10⁷) ммоль/л, для референтних штамів - (2,5Ч10⁷) ммоль/л. Показники каталітичної активності протеінази були дещо нижчі у референтних штамів та складали (1,2Ч10⁸) мкмоль/лЧхв., для клінічних ізолятів ці показники визначено на рівні (1,7Ч10⁸ ) мкммоль/лЧхв.

Показники фосфоліпазної активності для референтних штамів C. albicans становили (20,1±2,2) ммоль/лЧгод., для клінічних ізолятів - (27,3±1,9) ммоль/лЧгод. При дослідженні протеазної активності у клінічних ізолятів встановлено достовірно вищі показники (р<0,001), які складали - (0,37±0,04) мг/хв.Чмл, у той час, як у референтних штамів вони сягли - (0,24±0,05) мг/хв.Чмл.

Збільшення кількості цих ферментів (р<0,001) у клінічних ізолятів, сприяє гідролітичному розчепленню жирних кислот у фосфоліпідах підвищуючи стійкість C. albicans до киснезалежної бактерицидної дії фагоцитів, що спостерігалось в результатах досліджень. Тобто, при вивченні фагоцитарної активності нейтрофілів відносно ізолятів C. albicans відмічалось зниження усіх її показників.

Вміст мікроелементів клітинної стінки клінічних і референтних штамів S. aureus. При визначенні вмісту мікроелементів клітинної стінки S. aureus у клінічних ізолятів виявлено більшу (р<0,05) кількість заліза (27,8±2,05) мкмоль/мл, калію (84,2±1,84) мкмоль/мл та магнію (60,07±1,37) мкмоль/мл, що призводить до збільшення синтезу ферментів дегідрогеназ та зсуву окисно-відновних процесів у бік катаболічних.

Встановлено, що у клінічних ізолятів рівень вмісту калію (84,2±1,84) мкмоль/мл був більш високим (р<0,05) ніж натрію (70,4±2,8) мкмоль/мл, що можливо призводить до накопичення негативно зарядженого потенціалу на зовнішній мембрані клітин, та впливає на швидкість утворення біоплівок мікроорганізмами.

Дія комбінацій протимікробних препаратів на консорціум C. аlbicans і S. аurеus. Антимікробну активність відносно асоціації клінічних штамів С. аlbicans і S. аureus вивчали на трьох комбінаціях протимікробних речовин: тербінафін і бензоїлпероксид; тербінафін, еритроміцин та ефірна олія полину; еритроміцин, тербінафін і лаферон (табл. 2).

При визначенні комбінованої дії використовували концентрації мінімальних терапевтичних доз антимікробних речовин. Вибір протимікробних засобів для визначення комбінованої дії був обумовлений механізмом їхньої дії, економічною вартістю та здатністю цих речовин пригнічувати не тільки планктонні форми клітин, а й діяти на мікроорганізми мобілізовані у біоплівці.

Отримані результати оцінювали за показниками середньої оптичної щільності та кількістю КУО після відповідних розведень. Для встановлення ефективності протимікробної дії речовин було визначено кількість КУО в 1 мл поживного середовища при висіві мікроорганізмів із дослідних зразків з протимікробною речовиною. Отримані результати порівнювали з кількістю КУО в 1 мл поживного середовища при висіві мікроорганізмів з контрольних зразків без протимікробної речовини.

За даними проведеного дослідження було встановлено, що комбінована дія тербінафіну, еритроміцину та ефірної олії полину відносно асоціації С. аlbicans + S. aureus була більш ефективна у порівнянні з дією окремих протимікробних засобів (зменшення кількості КУО) та у порівнянні з контрольними значеннями (кількість КУО на 1 мл поживного середовища при висіві з контрольних зразків без протимікробних речовин), МІК сладала - (2,6±0,08) мкг/мл.

Комбінація тербінафіну, еритроміцину та лаферону проявила меншу ефективність, але мала досить високу протимікробну активність відносно асоціації С. аlbicans + S. aureus у порівнянні з дією окремих антимікробних речовин та у порівнянні з контрольними значеннями, МІК становила - (3,16±0,14) мкг/мл.

Комбінація на основі антимікотичної речовини тербінафіну та антисептика на основі бензоїлпероксиду виявилась найбільш ефективною щодо інгібування асоціації С. аlbicans + S. aureus, показники середньої оптичної щільності складали (0,0401±0,012) од. ОЩ., МІК - (1,3±0,09) мкг/мл.

Таблиця 2 Результати визначення ефективності дії комбінацій протимікробних речовин на асоціацію клінічних штамів С. аlbicans + S. aureus

Примітки: КУО - колонієутворюючі одиниці; * - різниця показників достовірна (р<0,05) у порівнянні з контролем; представлено результати досліджень виконаних у трьох повторах (при С. аlbicans + S. aureus n=19).

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та вирішення наукового завдання підвищення інгібуючої дії комбінацій протимікробних речовин відносно асоціації C. albicans і S. aureus, які є поширеними збудниками інфекційних хвороб шкіри та підшкірної клітковини. Отримано нові дані про біологічні властивості (біохімічний склад клітин, ферментативну активність, фактори патогенності, здатність до формування біоплівок) цих патогенів.

1. Консорціум C. albicans і S. aureus займає третє місце серед причин виникнення мікстних інфекційних захворювань шкіри і підшкірної клітковини людини та у 27 % випадків асоціація цих збудників викликає нозокоміальні інфекції. Підвищення комплексної дії протимікробних речовин відносно асоціації C. albicans і S. aureus є актуальною проблемою для сучасної медицини.

2. При визначенні чутливості клінічних та референтних штамів S. aureus до антибіотиків різних груп виявлено майже 80 % полірезистентних штамів, серед них 40 % штамів MRSA. Встановлено, що найбільш ефективну дію (р<0,05) відносно штамів C. albicans серед антимікотичних речовин, які вивчали, мали амфотеріцин В - МІК (1,2±0,05) мкг/мл. та тербінафін - МІК (4,0±0,27) мкг/мл.

3. Дослідження адгезивних властивостей C. аlbicans і S. аureus показало, що найбільші (р<0,05) показники цих властивостей були у асоціації клінічних ізолятів - індекс адгезивності мікроорганізмів (ІАМ) складав - (7,17±1,76), для референтних штамів - (3,41±1,24), що вказує на агресивно-колонізаційний потенціал цих патогенів при поєднанні їх у консорціум.

4. В дослідах in vitro було встановлено, що асоціація клінічних штамів C. аlbicans і S. аureus характеризувалась підвищеною стійкістю до фагоцитозу, про що свідчить зниження показників фагоцитарної активності нейтрофілів у порівнянні з референтними штамами: для клінічних штамів фагоцитарне число складало - (3,03±0,07), для референтних штамів - (3,36±0,27), що вказує на відносно вищу вірулентність цих патогенів при утворенні асоціації.

5. Показники рівня вмісту тейхоєвих кислот клітин S. аureus були більш високі (р<0,05) у клінічних ізолятів - (0,373±0,016) од. ОЩ., ніж у референтних штамів - (0,147±0,014) од. ОЩ., що прямо пов'язано зі ступенем агресивності клінічних штамів. Встановлено пряму кореляційну залежність між рівнем вмісту тейхоєвих кислот, показниками адгезивності (r = 0,643) штамів S. aureus різного походження, та здатністю цих мікроорганізмів до формування біоплівок.

6. Доведено, що клінічні ізоляти проявляли більш високу (р<0,05) здатність до формування біоплівок, ніж референтні штами, але найвищими показники біоплівкоутворення були у асоціацією мікроорганізмів С. аlbicans і S. aureus, середня оптична щільність біоплівок складала (1,0892±0,006) од. ОЩ. для клінічних ізолятів та (0,0776±0,004) од. ОЩ. - для референтних штамів. Вказане є ознакою посилення патогенних властивостей цих мікроорганізмів у консорціумі.

7. Дослідження ферментативної активності штамів S. aureus показало, що у клінічних ізолятів відбувались реакції із зсувом у бік окислення (зменшення показників НАДН₂ - (0,005±0,0002) ммоль/л та збільшення НАД⁺ - (0,57±0,05) ммоль/л, у референтних штамів навпаки - у бік відновлення, що відображає суттєві відмінності катаболічного обміну, інтенсивності ряду реакцій пов'язаних з біосинтетичними процесами і змінами у складі мембранних структур штамів S. aureus різного походження.

8. У клітинах клінічних ізолятів S. aureus встановлено збільшення кількісного вмісту мікроелементів, особливо вмісту калію (84,2±1,84) мкмоль/мл у порівнянні з рівнем натрію (70,4±2,8) мкмоль/мл, що призводить до зміни потенціалу на зовнішній мембрані клітин та впливає на здатність мікроорганізмів до формування біоплівок. Для референтних штамів ці показники були менші (р<0,05) та становили - (61,12±2,71) мкмоль/л для калію і (58,12±1,8) мкмоль/л для натрію.

9. Встановлено, що серед вивчених протимікробних речовин, комбінація антимікотика тербінафіну та антисептика бензоїлпероксиду має найбільшу (р<0,05) активність відносно асоціації С. аlbicans і S. aureus, МІК - (1,3±0,09) мкг/мл. Вказана комбінація ефективно діє у відношенні не тільки планктонних форм, а й впливає на мікроорганізми мобілізовані у біоплівках, про що свідчить зниження оптичної щільності останніх.

Практичні рекомендації

На підставі експериментальних даних при визначенні дії протимікробних засобів встановлено найбільш ефективну комбінацію на основі антимікотичної речовини тербінафіну та антисептичної речовини бензоїлпероксиду, що є перспективним для подальшої розробки нових підходів профілактики та лікування гнійно-запальних інфекцій у лікувально-профілактичних установах практичної охорони здоров'я (Спосіб зниження патогенних та вірулентних властивостей асоціації C. albіcans і S. aureus комбінацією протимікробних засобів на основі антимікотичної речовини тербінафіну та антисептика на основі бензоїлпероксиду - інформаційний лист № 321 від 04.06.2013 р., патент України на корисну модель № 88795 від 25.03.2014 р.).

Отримані результати відносно дії комбінацій протимікробних речовин на асоціацію С. аlbicans і S. аureus нададуть змогу розширити спектр використання ефективних хіміотерапевтичних засобів, що мають вплив на цих патогенів, та в подальшому можуть бути використані у приготуванні різних лікарських форм для лікування гострих та затяжних інфекційних процесів шкіри та підшкірної клітковини. Також можливе їх застосування для профілактики розвитку катетер-асоційованих інфекцій, які є актульною проблемою сучасної медицини.

Результати проведеного мікробіологічного дослідження щодо визначення рівня вмісту тейхоєвих кислот, як фактору патогенності штамів S. аureus пропонуються для впровадження в клініко-діагностичні лабораторії для підвищення ефективності розпізнавання захворювань, які спричинені цими патогенами (Спосіб визначення патогенності Staphylococcus aureus за вмістом тейхоєвих кислот - патент України на корисну модель № 88794 від 25.03.2014 р.).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Лупай (Кочнєва) О. В. Визначення чутливості до хіміотерапевтичних препаратів ізолятів та референтних штамів Staphylococcus aureus / А. Я. Циганенко, О. В. Лупай // Вісник проблем біології і медицини. - 2011. - Вип. 4 (90). - С. 167-169. (Дисертантом проведено виділення чистих культур штамів S. aureus та визначена їх антибіотикочутливість).

2. Лупай (Кочнєва) О. В. Комбінована дія тербінафіну та бензоїлпероксиду на консорціум Candida albicans і Staphylococcus aureus [Електронний ресурс] / О. В. Лупай (Кочнєва) // Annals of Mechnikov's Institute. - 2012. - № 1. - С. 20-22. Режим доступу до журн.: http://www.imiamn.org/journal.htm. (Автором визначено нові комбінації протимікробних препаратів ефективних відносно консорціума даних мікроорганізмів в дослідах in vitro).

3. Визначення протимікробної дії препарату Гатимак на планктонні клітини та біоплівки штамів Staphylococcus aureus in vitro / А. Я. Циганенко, О. В. Лупай (Кочнєва), М. М. Мішина, С. М. Граматюк // Експериментальна і клінічна медицина. - 2012. - № 1. - С. 11-13. (Дисертантом виконано експериментальні дослідження та оброблено отримані результати).

4. Комбінована дія протимікробних речовин на консорціум C. albicans і S. aureus / В. В. Мінухін, О. В. Кочнєва, С. М. Граматюк, С. С. Крячко // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - 2013. - Вип. 2, № 116. - С. 34-40. (Дисертантом виконано експериментальні дослідження та обробку їх результатів).

5. Адгезивні властивості асоціації Candida albicans і Staphylococcus aureus / В. В. Мінухін, О. В. Кочнєва, С. М. Граматюк, М. П. Сухомлин // Вісник проблем біології і медицини. - 2013. - Вип. 100, № 2. - С. 89-90. (Дисертантом самостійно проведено ідентифікацію клінічних штамів мікроорганізмів та вивчення їх адгезивних властивостей).

6. Встановлення вмісту тейхоєвих кислот у клітинах клінічних і референтних штамів Staphylococcus aureus / В. В. Мінухін, О. В. Кочнєва, Т. М. Замазій, П. В. Оветчин, В. В. Титаренко // Одеський медичний журнал. - 2014. - № 2. - С. 14-17. (Автором проведено аналіз літературних джерел та виконано експериментальні дослідження).

7. Lupai (Kochneva) E. Antimicrobial resistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Candida albicans in polymicrobial biofilms / E. Lupai (Kochneva), V. Minukin, S. Gramatyk // Science Research. - 2013. - Vol. 1, № 2. - Р. 35-37. (Автором виконано експериментальні дослідження та оброблено отримані результати).

8. Кочнева Е. В. Определение факторов патогенности грибов Candida albicans и их роль в развитие инфекционного процесса / Е. В. Кочнева // Актуальные вопросы современной медицины : материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Екатеринбург, 2014. - С. 110-113. (Дисертантом виконано експериментальні дослідження та обробку їх результатів).

9. Патент на корисну модель № 88794 Україна, МПК G01N 33/00. Спосіб визначення патогенності Staphylococcus aureus за вмістом тейхоєвих кислот / О. В. Кочнєва, В. В. Мінухін, С. М. Граматюк, М. М. Мішина ; заявник та патентовласник Харківський національний медичний університет. - № u201314835 ; заявл. 18.12.2013 ; опубл. 25.03.2014. - Бюл. № 6. - 3 с. (Дисертантом виконано експериментальні дослідження та обробку результатів).

10. Патент на корисну модель № 88795 Україна, МПК A61K 9/00. Спосіб зниження полімікробної активності асоціації Candida albicans і Staphylococcus aureus / О. В. Кочнєва, В. В. Мінухін, С. М. Граматюк, Л. С. Габишева ; заявник та патентовласник Харківський національний медичний університет. - № u201314836 ; заявл. 18.12.2013 ; опубл. 25.03.2014. - Бюл. № 6. - 2 с. (Автором проведено аналіз літературних джерел та експериментальні дослідження).

11. Кочнєва О. В. Спосіб інгібування активності асоціації Candida albicans і Staphylococcus aureus комбінацією протимікробних речовин : [Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я № 321-2013] / О. В. Кочнєва, В. В. Мінухін, С. М. Граматюк, ХНМУ. - К. : Укрмедпатентінформ, 2013. - 4 с. (Дисертантом виконано експериментальні дослідження та обробку їх результатів).

12. Lupai (Kochneva) E. Antimicrobial resistance Candida albicans and Staphylococcus aureus in form polymicrobial biofilms / E. Lupai (Kochneva), S. Gramatyuk, A. Kuzmenko // Biofilms in nosocomial fungal infections: матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю, Paris, January 31 st - February 1 st, 2011. - Paris, 2011. - P. 41. (Дисертантом заплановано та виконано експериментальні дослідження).

13. Kochneva E. Combined effect of ozonous oleic acid and terbinafine on Candida albicans / E. Kochneva, S. Gramatyuk, O. Jafarli // 24^th ECCMID, Barselona, 10-13 May 2014. - Barselona, 2014. - Режим доступу: http://www.escmid.org/oll (Дисертантом виконано експериментальні дослідження та обробку їх результатів).