Експериментальне обґрунтування застосування хіміотерапевтичних та імунобіологічних препаратів при перитоніті, спричиненому Escherichia coli

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

АНОТАЦІЯ

Косілова О. Ю. Експериментальне обґрунтування застосування хіміотерапевтичних та імунобіологічних препаратів при перитоніті, спричиненому Escherichia coli. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України”, Харків, 2014.

Дисертаційна робота присвячена вивченню етіологічного фактора при перитонітах. В роботі представлені дані проведеного ретроспективного аналізу. Встановлено, що серед збудників інтраабдомінальних інфекцій (ІАІ) переважала грамнегативна мікрофлора - 71,2 %, серед якої домінувала E.coli, на її частку приходилось 62,6 %. Питома вага перитонітів в структурі ІАІ становила 9,8 %. При перитонітах частіше зустрічалась грамнегативна мікрофлора - 78,8 %, частка E.coli в якій була - 60,9 %. При вивченні чутливості до антибіотиків було встановлено, що E.coli, які виділені від дітей, були чутливими до цефалоспоринів ІІІ та ІV поколінь (89,0±7,4) %, фторхінолонів від (78,0±9,8) % до (89,0±7,4) % відповідно. Штами E.coli, які були виділені від дорослих, навпаки проявили виражену стійкість до окремих антибіотиків групи пеніцилінів, цефалоспоринів та фторхінолонів від (71,4±12,1) % до (85,7±9,3) % відповідно. Встановлено, що чутливість штамів E.coli до колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу, які були вилучені від дітей хворих на перитоніт та музейні, знаходились на одному рівні (60,0±11,2) % та (52,0±9,9) % відповідно. Чутливість штамів E.coli, які вилучені від дорослих складала (80,0±8,0) % та (76,0±8,5) %.

Доведено, що лікування гатифлоксацином в комбінації з колі-фагом та колі-протейним бактеріофагом мало оптимальний терапевтичний ефект.

Ключові слова: Escherichia coli, перитоніт, протимікробні засоби, колі-протейний бактеріофаг, антибіотикорезистентність.

АННОТАЦИЯ

Косилова О. Ю. Експериментальное обоснование применения химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов при перитоните, вызванном Escherichia coli. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07-микробиология. - ГУ “Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова НАМН Украины”, Харьков, 2014.

Диссертация посвящена повышению эффективности противомикробной терапии перитонита в эксперименте путем разработки рациональной схемы комбинированного применения антибиотиков и бактериофагов на основании комплексного исследования биологических свойств E. coli, выделенных при перитонитах.

На основании полученных данных было установлено, что удельный вес перитонитов в составе интраабдоминальных инфекций (ИАИ) составил 9,8 %. При перитоните чаще встречалась грамотрицательная микрофлора - 78,8 %, среди которой E.coli составила - 60,9 %. При изучении чувствительности к антибиотикам было установлено, что E.coli, выделенные от детей, были чувствительны к антибиотикам из группы цефалоспоринов ІІІ та ІV поколений 89,0±7,4 %, фторхинолонов от 78,0±9,8 % до 89,0±7,4 % соответсвенно. Штами E.coli, выделенные от взрослых на оборот проявляли выраженную устойчивость к отдельным группам антибиотиков группы пенициллинов, цефалоспоринов и фторхинолонов от (71,4±12,1) % до (85,7±9,3) % соответственно. У взрослых полирезистентные штаммы E.coli встречались в 2 раза чаще, чем у детей (р?0,05). Установлено, что штамы E.coli, выделенные при перитоните от детей и музейные, были в одинаковой степени чувствительные к коли-фагу и коли-протейному бактериофагу, а именно в (60,0±11,2) % и (52,0±9,9) % случаев соответственно. Количество чувствительных штаммов, выделенных от взрослых, к бактериофагам составляло - (80,0±8,0) % и (76,0±8,5) %. Комбинированная терапия гатифлоксацином с коли-фагом и коли-протейным бактериофагом при лечении експериментального перитонита, вызванного E.coli, характеризовалась противовоспалительным эффектом. Показатели С-реактивного белка и серомукоидов при этом достоверно снижались.

При экспериментально смоделированном перитоните эффективным было комбинированное применение противомикробного средства (гатифлоксацина) с коли- или коли-протейным бактериофагами, где выживаемость животных составила 90,0 % в сравнении с монотерапией гатифлоксацином (70,0 %) и коли- или коли-протейным бактериофагом (80,0 %).

Доказано, что применение коли-фага и коли-протейного бактериофага в комплексной терапии с гатифлоксацином при экспериментальном эшерихиозном перитоните, приводило к повышению показателей фагоцитарного числа в 1,2 раза. Лечение гатифлоксацином в комбинации с коли-фагом и коли-протейным бактериофагом имело оптимальный терапевтический эффект. На пятые сутки наблюдения воспалительные, дистрофические и гемореологические изменения в паренхиматозных органах и листках брюшины по сравнению с другими группами участвующими в опыте, выражены слабо.

Ключевые слова: Escherichia coli, перитонит, противомикробные препараты, коли-протейный бактериофаг, антибиотикорезистентность.

SUMMARY

Kosilova O.Yu. Experimental basis of usage of the chemotherapeutical and immunobioligical medicines at peritonitis caused by Escherichia coli - Manuscript.

The thesis for the PhD degree (candidate of medical science) on speciality 03.00.07-microbiology. - SE “I. I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of NAMS of Ukraine”, Kharkiv, 2014.

The thesis is devoted to the study of etiological factors at peritonitis. This paper presents the conducted retrospective analysis. Based on these data it was revealed that Gram-negative microflora - 71.2 % (E.coli - 62.6 %) - was dominated among the causative agents of intra-abdominal infections (IAI). The share of primary peritonitis in the structure of IAI was 9.8 %. Gram-negative microflora - 78.8 % - was more common for peritonitis, in which the proportion of E.coli was 60.9 %. In the study of antibiotic susceptibility it was found that E.coli picked out from children the Cephalosporin group of III and IV generations (89,0 ± 7,4) %, Fluoroquinolones from (78,0 ± 9,8) % to (89,0 ± 7.4) %, respectively. By contrast the strains of E.coli, which were picked out from adults, showed a strong resistance to certain antibiotics Penicillin group, Cephalosporins group and Fluoroquinolones group from 71,4 ± 12,1 % to 85,7 ± 9,3 %, respectively. It is established that the susceptibility of E.coli strains to phage coli and Bacteriophagum coli-proteicum that have been extracted from children with peritonitis and museum, were on the same level (60,0±11,2) % and (52,0 ± 9,9) %, respectively. Susceptibility of strains of E.coli, which were extracted from adults, was (80,0±8,0) % and (76,0 ± 8,5) %. It was proved the treatment with Gatifloxacin in combination with coli phage and Bacteriophagum coli-proteicum had optimal therapeutic effect.

Key words: Escherichia coli, peritonitis, antimicrobe preparations, Bacteriophagum coli-proteicum, antibioticresistance.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нормальна мікрофлора кишечника відіграє важливу роль у життєдіяльності організму хазяїна. Порушення видового складу і популяційного рівня автохтонних облігатних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів призводить до порушення барґєрної функції шлунково-кишкового тракту (ШКТ), що супроводжується контамінацією патогенними та умовно патогенними алохтонними мікроорганізмами, а також транслокацією мікроорганізмів у внутрішні органи і у кров, та сприяє генералізації патологічного процесу при інтраабдомінальній інфекції (ІАІ), формуванню гострого перитоніту і абдомінального сепсису (АС) (Ашрафов Р. А., 2001; Гостищев В. К., 2002; Десятерик В.І., 2005; Саенко В.Ф., 2003; Sedrak M., 2002; Бойко В.В., Криворучко И.А., Минухин В.В. и др., 2002, Мамедов А. М., Гамзаев С. М., Шахаммедов Н. А. и др., 2007).

Перитоніт відносять до важких інфекцій із незадовільним прогнозом: летальність при перитоніті складає від 3,5 % (при проникаючих пораненнях черевної порожнини і ранньому оперативному лікуванні) до 60 % при абдомінальному сепсисі з поліорганною недостатністю (ПОН) (Стручков Ю. В., Горбачева И. В., 2007, Козлов Р. К., 2007).

Існують різні форми гострого перитоніту, які сприяють проявам як місцевого так і загального характеру і відрізняються діапазоном впливу інтоксикації на функції органів та систем організму людини. За окремими параметрами перитоніт поділяють на первинний, який виникає внаслідок попадання мікрофлори до черевної порожнини гематогенним або лімфогенним шляхом, та вторинний, який є наслідком розповсюдження запального процесу з органів і тканин черевної порожнини, заочеревинного простору, перфорації органів тощо. Окремо виділяють післяопераційний, травматичний, акушерський, гінекологічний, жовчний, сечовий перитоніти (Стручков Ю. В., Горбачева И. В., 2007, Шевченко Ю. Л., Ветшев П. С., Савенкова Н. Н., 2004).

В етіології даного захворювання в останні 10-15 років спостерігається зсув від грампозитивних мікроорганізмів у бік умовно-патогенних грамнегативних бактерій як типових збудників гнійно-септичних ускладнень. Серед флори, що виділяється з черевної порожнини при перитоніті, одне з провідних місць на сучасному етапі займає неклострідіальна анаеробна інфекція в асоціації з аеробними мікроорганізмами, серед яких, у свою чергу, перше місце займає кишкова паличка (Schaumann R., Blatz R., Beer J. et al., 2004, Ерюхин И.А., Шляпников С.А., 2006).

У випадках інфекцій, викликаних грамнегативними бактеріями, традиційна антибіотикотерапія виявляється недостатньо ефективною. Це пояснюється широким розповсюдженням штамів, які несуть плазміди множинної лікарської резистентності, асоціацією декількох видів мікроорганізмів, що викликають інфекційний процес і мають свій спектр чутливості до антибіотиків, або зміною збудника в процесі лікування. Для лікування важких ІАІ пропонуються різні схеми з використанням антимікробних препаратів широкого спектру дії у вигляді монотерапії або комбінованої терапії. Переважно це цефалоспорини ІІІ покоління у поєднанні з аміноглікозидами. Розглядають також використання карбапенемів і фторхінолонів у поєднанні з аміноглікозидами. На цей час в дослідженнях і узгодженнях щодо лікування ІАІ, немає однозначних рекомендацій відносно оптимального режиму антибактеріальної терапії (АБТ) як при позашпитальних, так і при нозокоміальних ІАІ (Салманов А. Г., Марієвський В. Ф., Бойко В. В. та інші, 2012, Anderson V. R., Perry C. M., 2008, Nicoletti G., Nicolosi D., Rossolini G. M., Stefani S., 2009).

Профілактичне застосування антибіотиків у плановій абдомінальній хірургії є важливим компонентом підвищення ефективності оперативного лікування і скорочення термінів перебування пацієнтів у хірургічній клініці. Однак, і до теперішнього часу застосування антибіотикопрофілактики має значну кількість важливих питань, на які ще не знайдено однозначних відповідей.

Останніми роками проводяться дослідження, які присвячені пошукам альтернативних і синергічних методів антимікробної дії. Одним з них є бактеріофаги (Gуrski A. et al., 2009).

Застосування бактеріофагів сьогодні є перспективним в умовах зростаючої антибіотикорезистентності збудників гнійно-септичних захворювань, інфекцій і ускладнення ран.

Звґязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано у відповідності з планами науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського національного медичного університету МОЗ України: “Оптимізація діагностики й протимікробної терапії гнійно-запальних процесів з урахуванням комунікативних властивостей мікроорганізмів” (номер державної реєстрації 0111U00142). Дисертант виконала частину роботи, яка полягала у вивченні особливостей оптимізації протимікробної терапії гнійно-запальних процесів.

Тема дисертаційної роботи затверджена Проблемною комісією МОЗ, НАМН України зі спеціальностей вірусологія - 03.00.06 та мікробіологія - 03.00.07 (прот. № 137 від 29.04.2011 р.); вченою радою Харківського національного медичного університету (прот. № 5 від 18.05.2011 р.).

Мета і завдання дослідження. Мета - обґрунтувати доцільність застосування комбінації антибіотиків та бактеріофагів при експериментальному перитоніті, спричиненому Escherichia coli.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні завдання:

1. Визначити роль Escherichia coli в розвитку інтраабдомінальних інфекцій на основі ретроспективного аналізу захворюваності за 2000 - 2010 рр. в м. Харкові.

2. Вивчити біологічні властивості та рівень активності факторів патогенності (адгезивна, протеолітична, гемолітична) музейних та клінічних штамів Escherichia coli, які були виділені від хворих на перитоніт.

3. Розробити експериментальну модель перитоніту, спричиненого Escherichia coli.

4. Провести порівняльний аналіз антибіотикорезистентності клінічних та музейних штамів Escherichia coli.

5. Визначити чутливість музейних та клінічних штамів Escherichia coli, виділених від хворих на перитоніт до колі- та колі-протейного бактеріофагу.

6. Визначити в експерименті ефективність включення амікацину, гатифлоксацину, колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу у комплексну терапію перитоніту.

Обґєкт дослідження: біологічні властивості (біохімічна активність, чутливість до антибіотиків, колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу, продукція ферментів) штамів E. coli; патоморфологічні особливості внутрішніх органів (запалення парієтальної та вісцеральної очеревини, присутність макрофагів в інфільтраті, фібріну в ексудаті, а також запалення та дистрофічні зміни в печінці та гемореологічні порушення) фагоцитарна активність лейкоцитів, гематологічні, гострофазові показники запалення (СРБ - С - реактивний білок, серомукоїди) експериментальних тварин.

Предмет дослідження: клінічні та музейні штами E. coli, виділені від хворих на перитоніт.

Методи дослідження - мікробіологічні - ідентифікація та визначення біологічних властивостей вилучених штамів бактерій методами мікроскопії, культуральним, біохімічним; визначення антибіотикочутливості диско-дифузійним методом; дослідження гемолітичної, протеолітичної активностей; визначення адгезивних властивостей; імунологічні - визначення фагоцитарної активності лейкоцитів; патоморфологічні - особливості внутрішніх органів (запалення парієтальної та вісцеральної очеревини, присутність макрофагів в інфільтраті, фібріну в ексудаті, а також запалення та дистрофічні зміни в печінці та гемореологічні порушення); біохімічні - визначення гострофазових показників запалення (С-реактивний білок, серомукоїди); гематологічні - визначення формули крові; математико-статистичні. інфекція патогенність штам перитоніт

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на експериментальній моделі гострого перитоніту, спричиненого Escherichia coli, на підставі мікробіологічних, імунологічних, клініко-лабораторних та патоморфологічних досліджень, доведена ефективність комбінованого застосування гатифлоксацину з колі- та колі-протейним бактеріофагом.

Вперше встановлено, що комбіноване застосування гатифлоксацину з колі-фагом та колі-протейним бактеріофагом призводить до пригнічення росту Escherichia coli, усунення ознак мікробного запалення у тканинах паренхіматозних органів (печінка, селезінка, серце та листках очеревини), а також нормалізації лабораторних показників (гематологічних, гострофазових показників запалення і фагоцитарної активності лейкоцитів).

Вперше доведено, що імунобіологічні препарати (колі- та колі-протейний бактеріофаг) підвищують фагоцитарну активність лейкоцитів експериментальних тварин, як окремо так і в комбінації з гатифлоксацином.

Встановлено, що штами E. сoli, виділені від хворих на перитоніт, в порівнянні з музейними штамами, виявляють більш високу адгезивну, протеолітичну та гемолітичну активність. Вони відрізнялись від штамів групи порівняння полірезистентністю до антибіотиків, але при цьому, як і музейні штами, були високочутливими до колі- та колі-протейного бактеріофагу.

Встановлено велику кількість (85,7±9,3) % полірезистентних штамів E. coli, які ізольовані з черевної порожнини у хворих на перитоніт протягом 2011-2013 рр. у порівнянні з ретроспективними даними за 2000-2010 рр.

Практичне значення одержаних результатів. Удосконалено спосіб потенціювання дії антибіотиків з групи фторхінолонів. Використано прийом поєднання лікарських засобів для посилення дії одного препарату іншим та розроблено спосіб потенціювання дії антибіотиків із групи фторхінолонів шляхом додавання колі-протейного бактеріофагу. Ефективність способу доведена експериментально на підставі патоморфологічних досліджень, змодельованого перитоніту у мишей. Встановлено, що лікування експериментального перитоніту поєднанням діючої речовини гатифлоксацину з колі-протейним бактеріофагом є більш ефективним, ніж використання монотерапії з призначенням діючої речовини гатифлоксацину, що підтверджує потенціювання дії антибіотиків із групи фторхінолонів колі-протейним бактеріофагом.

Вищевикладене знайшло своє відображення в Інформаційному листі № 96 - 2013 “Спосіб потенціювання дії антибіотиків із групи фторхінолонів”.

Пріоритетність досліджень підтверджено патентом України на корисну модель № 80884 “Спосіб потенціювання дії антибактеріальних препаратів з групи фторхінолонів”, заявкою № u 201410637 “Спосіб моделювання гострого перитоніту” від 29.09.2014 р. Результати досліджень подано до реєстру галузевих нововведень за № 2789/05 від 10.11.2014 р. “Спосіб потенціювання дії протимікробних засобів із групи фторхінолонів”.

Отримані результати впроваджені в практику хірургічного відділення КЗОЗ “Обласна дитяча клінічна лікарня №1” м. Харкова (акт впровадження від 11.02.13), гінекологічного відділення КЗОЗ “Міський пологовий будинок №1” м. Харкова (акт впровадження від 03.12.12), навчальний процес Одеського національного медичного університету (акт впровадження від 15.05.13), ДЗ “Дніпропетровська медична академія МОЗ України” (акт впровадження від 14.05.2013). Дослідження обґрунтовують перспективність використання комбінованого методу (застосування колі-протейного бактеріофагу з гатифлоксацином) для лікування перитоніту.

Особистий внесок здобувача. Автору належить вибір теми, визначення мети, завдань, методології виконання дослідження. Особисто здобувачем проведено ретроспективний аналіз захворюваності на інтраабдомінальні інфекції за даними ДУ “Інститут загальної та невідкладної хірургії НАМН України”, ідентифікація та дослідження по вивченню факторів патогенності (адгезія, протеоліз, гемоліз) клінічних та музейних штамів E.coli. Вивчена антибіотикочутливість та фагочутливість клінічних та музейних штамів E.coli. Автором самостійно проведено експериментальні дослідження на лабораторних тваринах. Розроблена модель ешерихіозного перитоніту, на якій обґрунтована доцільність застосування комбінованої терапії гатифлоксацином та колі-протейним бактеріофагом. Здобувачем також самостійно проведено науковий аналіз, статистичну обробку, інтерпретацію та узагальнення отриманих результатів. Оформлено висновки та практичні рекомендації.

Персональний внесок автора у всіх опублікованих зі співавторами працях наводиться за текстом дисертації та в авторефераті у списку фахових публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертаційної роботи оприлюднено і обговорено на конгресах, зґїздах та науково - практичних конференціях, а саме: науково - практичній конференції за участю міжнародних спеціалістів “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями”, присвячена 125-річчю заснування ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України” (Харків, 2012); конференції “Медицина та фармація ХХІ століття - крок у майбутнє (Запоріжжя, 2012); 5th International Scientific Interdisciplinary Conference for medical students and young doctors (Kharkiv, 2012); межвузівській конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття” (Харків, 2013); ХVI Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (с международным участием) (Санкт - Петербург, 2013); 15th International Congress of Immunology (Milan, Italy, August 22 - 27, 2013); конференції “Епідеміологічні дослідження в клінічній медицині: досягнення та перспективи” (Харків 3 - 4 жовтня 2013); конференції “Актуальні питання парентеральних інфекцій” (Харків, 2013).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 наукових праць (2 - одноосібно), у тому числі 7 статей у фахових виданнях (1 - закордонна, 1 - у журналі, що входить до міжнародних наукометричних баз), 1 деклараційний патент, 1 інформаційний лист, 8 тез у матеріалах науково-практичних конференцій, зґїздів та конгресів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 191 сторінках компґютерного друку, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів та методів досліджень, 4 розділи власних досліджень, розділ “Аналіз та узагальнення одержаних результатів”, висновки та рекомендації щодо практичного впровадження результатів дослідження, додаток. Список використаних джерел налічує 306 посилань (184 кирилицею і 122 латиницею), який викладено на 34 сторінках. Робота ілюстрована 15 (13 стор.) таблицями та 37 рисунками (2 стор.).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі означено актуальність проблеми лікування та профілактики післяопераційних гнійних ускладнень в абдомінальній хірургії в сучасних умовах, їх медична та соціальна значущість. Наведено основні причини неефективності сучасного лікування перитоніту. Обґрунтовано сутність мети та завдань досліджень, визначено звґязок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведені дані щодо апробації отриманих результатів та впровадження їх в медичну практику, вказано структуру дисертації і її обсяг.

У першому розділі подано огляд літератури, який включає 4 підрозділи, викладено відомості щодо етіологічного фактору перитоніту, означено особливості патогенезу перитоніту, як запального процесу, обумовленого інтраабдомінальною інфекцією, проаналізовано епідеміологічний нагляд за розвитком антибіотикорезистеності, а також переваги та недоліки антибіотикотерапії та фаготерапії перитоніту.

У другому розділі наведено матеріали, методи і обсяг досліджень. Основний обсяг робіт виконано в лабораторії медичної мікробіології з Музеєм мікроорганізмів ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова НАМН України”.

Ідентифікацію E.coli проводили згідно чинної нормативно - методичної документації. При дослідженні користувались селективними та диференційно - діагностичними середовищами, виробництва Hi Media, [India].

Приготування поживних середовищ здійснювалось у відповідності з вимогами (ГОСТ 10.444.1 - 84 (СТСЭВ 3833 - 82). - [Действителен от 1985-07-01]. - М. : Медицина, 1985).

Живильні середовища для вилучення та ідентифікації мікробів застосовували відповідно до особливостей культивування бактерій. Визначено чутливість E.coli до 30 хіміотерапевтичних препаратів (цефалоспорини; фторхінолони; аміноглікозиди; пеніциліни; тетрацикліни; поліміксини; нітрофурани; хлорамфенікол; ко-тримаксозол, визначали на середовищі Мюллер-Хінтон Hi Media, (India) з використанням стандартних комерційних дисків Hi Media, (India). Результати дослідження інтерпретували у відповідності до наказу Міністерства охорони здоров'я України № 167 від 05.04.2007 р. “Про затвердження методичних вказівок “Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів”. Адгезивні властивості вивчено згідно методики В. І. Бриліса із співавторами з використанням формалінізованих еритроцитів людини резус - позитивної 0 (І) групи крові (В.І. Бриліс, Т.А. Бриліс, А.А. Ланцер 1991).

Експерименти на тваринах виконано згідно Міжнародним рекомендаціям щодо проведення медико - біологічних досліджень з використанням тварин (Хроніка ВООЗ, 1985) та Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою (Страсбург, 1980).

Статистичну обробку одержаних результатів здійснювали за стандартною методикою визначення середнього значення та його стандартного відхилення (М±m) і критерію Стьюдента. Достовірність різниці оцінювали при рівні вірогідності р<0,05. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою прикладних компґютерних програм з електронними таблицями Microsoft Excel 2003 та “Biostat-6”.

У третьому розділі наведено дані ретроспективного аналізу, які представлені у табл.1.

Таблиця 1

Структура інтраабдомінальних інфекцій

Встановлено достатньо широкий спектр мікроорганізмів, який представлений 1021 ізолятами 20 видів мікроорганізмів. Слід відмітити, що серед збудників гнійно - запальних процесів органів черевної порожнини переважала грамнегативна мікрофлора (рис.1.). Лише при виразковій хворобі шлунка з ускладненням, частота грамнегативних мікроорганізмів була значно нижче і складала (6,2±1,0) %

Серед ентеробактерій при ІАІ найчастіше виділялись Escherichia coli (62,6±1,9) %. Мали місце поодинокі випадки виділення P.mirabilis, P. morganii, Enterobacter та Acinetobacter. З представників неферментуючих грамнегативних бактерій - P.aeruginosа, яка складала (25,0±1,7) %.

Встановлено, що серед представників грампозитивної мікрофлори, що були ізольовані з черевної порожнини, домінували мікроорганізми роду Staphylococcus. На їх частку припадало (59,2±3,7) % випадків.

Виділені мікроорганізми зустрічалися як в монокультурі, так і в асоціаціях. Мікроорганізми в монокультурі висівались в (85,0±1,4) % випадків.

Встановлено, що асоціації мікроорганізмів складали (15,3±1,2) %, на долю двокомпонентних асоціацій припадало (91,7±2,6) %, трьохкомпонентних- (8,3±8,7) %.

В структурі ІАІ питома вага перитонітів складала 9,8 %. Аналіз мікробного складу при перитоніті показав, що грампозитивних мікроорганізмів було виділено 21,2 %, а грамнегативних - 78,8 % (рис.2). Основними представниками грамнегативної мікрофлори були E. coli. На її частку припадало (60,9±5,4) % випадків. Також було виділено (21,0±7,8) % представників роду Proteus, а саме: P. vulgaris та P. mirabilis . З представників неферментуючих грамнегативних бактерій - P. aeruginosa (31,7±5,2) %.

Грампозитивна мікрофлора була представлена родом Staphylococcus (S. aureus і S. epidermidis) та Enterococcus з домінуванням виду E. faecalis.

Встановлено, що частіше при перитоніті виділялись двокомпонентні асоціації - (78,0±5,6) %. На долю трьохкомпонентних асоціацій приходилось (22,2±5,6) % випадків.

Співвідношення грампозитивної і грамнегативної мікрофлори при перитоніті

У четвертому розділі надано детальну характеристику біологічних властивостей та результати чутливості до протимікробних засобів, колі- та колі - протейного бактеріофагів музейних (19) та клінічних штамів E.coli, які були ізольовані з черевної порожнини хворих на перитоніт (50). При дослідженні біологічних властивостей встановлено, що штами були каталазопозитивні та оксидазонегативні, не мали здатності утилізувати цитрат Сімонса та гідролізувати сечовину, ферментували глюкозу з утворенням кислоти та газу, декарбоксилювали лізин. Але слід зазначити, що деякі штами характеризувались варіабельною біохімічною активністю. Досліджувані музейні штами E.coli утилізували ацетат, але не утилізували малонат; здатність до індолоутворення мали 10 (52,6±11,4) % з 19 штамів. При вивченні рухливості життєздатних колекційних штамів E.coli, встановлено, що із 19 штамів 3 (15,7±8,3) % зразки виявилися нерухливими.

Результати вивчення чутливості клінічних штамів до антибіотиків показали, що штами, виділені від дітей, мали 100 % чутливість до антибіотиків з групи карбапенемів (іміпенем і меропенем). Проявили виражену чутливість до цефалоспоринів 3 - го покоління (цефатоксим і цефтріаксон - 89,0±7,37 %) і 4 - го покоління (цефепім - 89,0±7,37 %). Високі показники чутливості відмічені до фторхінолонів (ципрофлоксацин - 89,0±7,37 %, офлоксацин, гатифлоксацин, норфлоксацин і левофлоксацин - по 83,0±8,85 %, пефлоксацин - 78,0±9,76 %).

Разом з тим клінічні штами E. coli виявили виражену стійкість до пеніцилінів, особливо, до ампіциліну (100 %) і в (50,0±11,7) % випадків до ампіциліну/клавуланату і амоксициліну. Високі показники резистентності відмічені до тетрацикліну- (72,0±10,58) % і доксицикліну - (89,0±7,37) %.

У штамів, ізольованих від дорослих хворих, виражена чутливість відмічалася тільки до карбапенемів: іміпенему - (93,0±6,8) % і меропенему - (78,5±10,9) %, в (50,0±13,3) % випадків відмічена чутливість до фурамагу.

До решти груп антибіотиків клінічні штами E. coli проявляли виражену стійкість.

У дітей 44,4 % штамів володіли полірезистентністю, у дорослих - 85,7 % штамів. У дітей виділено по 12,5 % штамів, які були стійкі до 2-х, 4-х і 5-и груп, 62,5 % - до 3 - х групп антибіотиків.

У дорослих виділено по 8,3 % клінічних штамів, які були стійкі до 2 - х, 3 - х і 6 - и груп антибіотиків, в 25,0 % виявлена резистентність до 5 груп і у 50,0 %-до 4 - х груп.

Враховуючи, що при перитоніті домінуючим мікроорганізмом є E.coli, який виявлявся в асоціації з представниками роду Proteus в (21±7,8) % випадків, нами були проведені дослідження чутливості мікроорганізмів не тільки до колі-фагу, а й до колі-протейного бактеріофагу.

При дослідженні чутливості отриманих штамів E.coli до колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу, були отримані наступні результати.

Кількість чутливих штамів E.coli по відношенню до колі-фагу і колі-протейного бактеріофагу, які виділені від дітей хворих на перитоніт та музейні штами, була на одному рівні (60,0±9,8) % та (52,0±9,9) %. Як видно з табл. 2. кількість чутливих штамів E.coli, які були виділені від дорослих хворих на перитоніт, складала (80,0±8,0) % та (76,0±8,5) % і була достовірно нижче ніж в групі порівняння (92,0±5,4) %. Було проведено порівняння результатів, які отримали при застосуванні колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу у штамів виділених від дітей, дорослих і музейних та не отримано достовірної різниці між показниками (р?0,05).

Таким чином, можна зазначити, що для лікування перитоніту, який спричинений E.coli, можна використовувати як колі-, так і колі-протейний бактеріофаг.

Таблиця 2

Чутливість штамів E.coli, які ізольовані від хворих на перитоніт, музейних та штамів виділених від умовно здорових людей (група порівняння), до колі- та колі-протейного бактеріофагу, (M±m) %

У п'ятому розділі надано характеристику морфологічних змін внутрішніх органів при змодельованому перитоніті без лікування та при лікуванні хіміотерапевтичними (амікацин, гатифлоксацин) та імунобіологічними (колі-бактеріофаг та колі-протейний бактеріофаг) препаратами. Після розрахунку інфікуючої дози (5Ч10⁸ мікробних тіл на мишу) здорових мишей розподілили на 9 груп для проведення експериментальної частини. Всього в дослідах було використано 750 мишей. І - а група (порівняння, неліковані) тварини (83 тварини), 2 - а група, яка отримувала амікацин в дозі 0,2 мг/кг (83 тварини). 3 - я група, де тварини отримували гатифлоксацин в дозі 0,25 мг/кг (83 миші). 4 - а група тварин, яким вводили колі - або колі-протейний бактеріофаг (83 миші). 5-а група - тварин отримувала комбінацію амікацину та гатифлоксацину (80 мишей). 6-а група, яка отримувала амікацин з колі- або колі-протейним бактеріофагом (0,03 мг/кг) (83 миші). 7 - а група тварин, які отримували гатифлоксацин та колі- або колі-протейний бактеріофаг (83 миші). 8 - а дослідна група, яка отримувала амікацин, гатифлоксацин та колі- або колі-протейний бактеріофаг (83 миші). 9 - а група - дослідні тварини групи контролю, які отримували 0,9 % розчин NaCl (83 миші). Дослідження гістологічних, гематологічних, фагоцитарної активності лейкоцитів та біохімічних показників у лабораторних тварин проводили на 1 - у, 3 - ю та 5 -у добу. Препарати вводили внутрішньоочеревинно щоденно (1 раз на добу) протягом 5-ти діб. Визначення клінічної ефективності комбінованого застосування антибіотиків з бактеріофагами у лабораторних тварин проводили на 1-у, 3-ю, 5-у добу під час лікування. Результати отримані при застосуванні колі бактеріофагу суттєво не відрізнялись від показників з колі-протейним бактеріофагом.

Виходячи з даних табл. 3 можливо оцінити термін життя піддослідних тварин при ешерихіозному перитоніті і терапії що проводилась, та відповідно оцінити ступінь активності препаратів, які були взяті в експеримент.

При порівняльному аналізі якості монотерапії та комбінованої терапії по показнику тривалості життя піддослідних тварин з ешерихіозним перитонітом ми зґясували, що найменша летальність (10,0 %) реєструвалась в 7 групі при лікуванні тварин комбінацією препаратів гатифлоксацину з колі- або колі-протейним бактеріофагом у порівнянні з монотерапією гатифлоксацином (30,0 % - летальних випадків) та окремо колі- або колі-протейним бактеріофагом (20,0 % - летальних випадків) та позитивним контролем, де летальність досягала 100,0 % на 3 добу.

Таким чином, можна зробити висновок, що найбільш ефективним є комбіноване лікування антимікробним препаратом з групи фторхінолонів та колі- або колі-протейним бактеріофагом. Тривалість життя при даній комбінації препаратів - 90,0 %, що говорить про те, що комбіноване застосування препаратів має високий терапевтичний ефект.

Таблиця 3

Виживання піддослідних тварин при ешерихіозному перитоніті

Примітка. В експерименті був використаний клінічний штам E.coli, виділений від дорослих хворих на перитоніт та референтний штам АТСС 25922. Відмінностей, щодо виживання піддослідних тварин не було виявлено.

Порівняльний аналіз морфологічних змін в експериментальній моделі перитоніту у мишей показав, що застосування гатифлоксацину в комбінації з колі-протейним бактеріофагом чітко зменшує ступінь вираженості запально-дистрофічних змін і гемореологічних порушень в очеревині та печінці (табл.4).

При лікуванні “гатифлоксацин+колі-протейний бактеріофаг” на 3 -ю добу експериментального перитоніту запальні й дистрофічні зміни в паренхіматозних органах та листках очеревини, порівняно з іншими групами спостережень, виражені слабше (рис. 3). Гіперемія та реологічні порушення незначні. У селезінці зберігаються ознаки антигенної стимуляції у вигляді гіперплазії Т - зон білої пульпи, помірної макрофагальної реакції.

Таблиця 4

Морфологіні зміни у мишей з експериментальним перитонітом

Примітки:

+++-++++ - сильно виражені запальні та дистрофічні зміни;

++ - помірно виражені запальні та дистрофічні зміни;

+ - слабо виражені запальні та дистрофічні зміни.

КПБФ - колі-протейний бактеріофаг.

На 5 - у добу ще помітніше слабшають запальні й дистрофічні зміни в паренхіматозних органах та очеревині.

Так само, як і на 3 - ю добу, зберігається гіперплазія і гіпертрофія Купферових клітин, наявність у запальному інфільтраті макрофагів. Запалення очеревини характеризується втратою нейтрофільної і фібринозної складової, представлено дрібноосередковою лімфогістіоцитарною інфільтрацією на тлі слабо вираженого набряку і помірного повнокров'я судин. Зміни селезінки порівняно з 3-ю добою залишаються на тому самому рівні.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі на основі даних ретроспективного аналізу, вивчення біологічних властивостей клінічних та музейних штамів E.coli, їх чутливості до антибіотиків, проведеного експериментального дослідження з використанням антибіотиків в комбінації з колі- та колі-протейним бактеріофагами та узагальнення отриманих результатів визначено напрямки удосконалення лікувальної тактики при перитоніті.

1. При ретроспективному аналізі встановлено, що серед збудників інтраабдомінальної інфекції переважала грамнегативна мікрофлора - 71,2 %, серед якої домінувала E.coli (62,6 %). Питома вага перитонітів в структурі ІАІ становила 9,8 %, де також частіше зустрічалась грамнегативна мікрофлора - 78,8 %, а частка E.coli складала - 60,9 %.

2. Всі штами E.coli, які були вилучені від хворих на перитоніт і відібрані для подальших досліджень, мали типові біологічні властивості. Штами E.coli, які були вилучені від дітей, мали середню та високу адгезивну активність в (48,0±6,5) % та (52±6,7) % відповідно. Штами E.coli, виділені від дорослих хворих на перитоніт (20,0±4,4) % високу, (80,0±8,0) % - середню адгезивну активність у порівнянні зі штамами виділеними від умовно здорових людей.

3. Доведено, що (4,2±2,0)% штамів, які були виділені від дорослих, виявились здатними продукувати б-гемолізин, та проявляли високу резистентність до хіміотерапевтичних препаратів різних груп. При визначенні протеолітичної активності у клінічних та музейних штамів E.coli, встановлено, що всі штами були слабо активними. Штамів з високим ступенем протеолітичної активності виявлено не було.

4. На лабораторних тваринах розроблена модель гострого перитоніту, спричиненого Escherichia coli, основні характеристики якої були підтверджені бактеріологічними та патоморфологічними методами дослідження.

5. Чутливість E.coli до антибіотиків у хворих на перитоніт дітей та дорослих відрізнялася. Так, штами E.coli, які були виділені від дітей виявились чутливими до антибіотиків з групи цефалоспоринів ІІІ та ІV поколінь (89,0±7,4) %, фторхінолонів від (78,0±9,8) % до (89,0±7,4) % відповідно. Штами E.coli, які були виділені від дорослих, навпаки проявляли виражену стійкість до окремих антибіотиків групи пеніцилінів, цефалоспоринів та фторхінолонів від (71,4±12,1) % до (85,7±9,3) % відповідно. У дорослих полірезистентні штами E.coli зустрічалися в 2 рази частіше, ніж у дітей (р?0,05). Музейні штами E.coli, виявляли виражену стійкість до ампіциліну - 92,8 %, ампіциліну/клавуланату - 78,5 % та цефуроксиму - 64,0 %. Відмічено 100 % чутливість музейних штамів до препаратів з групи карбапенемів.

6. Встановлено, що кількість чутливих до колі- та колі-протейного бактеріофагів штамів E.coli, які вилучені від дітей хворих на перитоніт та музейних, були на одному рівні (60,0±11,2) % та (52,0±9,9) % відповідно. Кількість чутливих штамів E.coli, які були виділені від дорослих, до колі- та колі-протейного бактеріофагу була більшою (80,0±8,0) % та (76,0±8,5) %.