Диагностическое значение метода получения и исследования цитограмм базального трахеобронхиального секрета

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Диагностическое значение метода получения и исследования цитограмм базального трахеобронхиального секрета

14.00.05 - внутренние болезни

кандидата медицинских наук

Медведева Елизавета Владимировна

Хабаровск 2009

Работа выполнена на кафедре пропедевтики внутренних болезней ГОУ ВПО ДВГМУ РОСЗДРВа (ректор д.м.н., проф. В.П. Молочный) на базе 301 Окружного военного клинического госпиталя (начальник Б.Н. Корсяков) и ГУЗ «Клинического центра восстановительной медицины и реабилитации»

(главный врач Т.М. Макарова).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Вячеслав Анатольевич Добрых

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Сергей Леонидович Жарский

кандидат медицинских наук Татьяна Петровна Мамровская

Ведущая организация: Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

Защита диссертации состоится «_____» _______ 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.026.01 по защите диссертаций при Дальневосточном государственном медицинском университете (680000, г. Хабаровск, ул. Муравьева - Амурского, 35, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке Дальневосточного государственного медицинского университета по адресу: г. Хабаровск, ул. Муравьева - Амурского, 35.

Автореферат диссертации разослан «_____» мая 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ДОБРЫХ

доктор медицинских наук, Вячеслав Анатольевич

профессор

цитологический трахеобронхиальный секрет респираторный

Cписок используемых сокращений

БА - бронхиальная астма

БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж

БС - бронхиальный секрет

БТС - базальный трахеобронхиальный секрет

ВП - внебольничная пневмония

ИМ - индуцированная мокрота

ИНДП - инфекция нижних дыхательных путей

ИК - индекс курения

МФ - макрофаги

П/Л - пачко /лет

ОРЗ - острое респираторное заболевание

ОФВ₁- объем форсированного выдоха за 1 секунду

ФВД - функция внешнего дыхания

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХБ - хронический бронхит

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Рост числа тяжело протекающих заболеваний респираторной системы, обусловлен, прежде всего, поздней диагностикой болезни и недооценкой опасности ее тяжелых последствий, как на поликлиническом, так и на госпитальном этапе (Н.А.Коровина,2001; А.Г. Чучалин, 1997).

Изучение механизмов воспаления при заболеваниях респираторной системы и контроль над ними, в частности для оптимизации лечения, предусматривают количественную оценку степени выраженности этого процесса (Л.И.Волкова и др., 2004; А.Э. Макаревич, 2000).

Доступным и удобным методом оценки воспалительного процесса в дыхательных путях считается изучение мокроты (M.N.Dikes et al., 1994). Однако то обстоятельство что мокрота представляет собой неконтролируемую смесь бронхиального секрета, слизи носоглотки и слюны резко снижает ее диагностическую ценность. Не всегда удается получить спонтанную мокроту, и тогда приходится прибегать к инвазивным процедурам, таким как бронхоскопия и бронхоальвеолярный лаваж. Однако эти методы не лишены ряда недостатков (С.Н.Авдеев и др.,1987). Индуцирование мокроты гипертоническим раствором хлорида натрия может изменять состав получаемых образцов, вызывать бронхоспазм и удушье в ответ на ингаляцию (M. Robinson et al., 1994; R.Djukanovic et al., 2002).

Проведенный нами анализ существующих традиционных методов, получения и исследования секрета бронхов позволяет считать, что эти методы обладают разной информативностью, сложностью выполнения, имеют ряд существенных недостатков. Они заключаются в том, что практически все перечисленные методики вызывают изменение состава секрета, присутствующего в дыхательных путях (примесь слюны к получаемому материалу, эффект разведения, дополнительная стимуляция секреции при инвазивных процедурах), сопряжены с технической сложностью выполнения и травматизацией дыхательных путей, что искажает свойства базального трахеобронхиального секрета (индуцированная мокрота, бронхоальвеолярный лаваж).

Все эти факты послужили отправным пунктом разработки нами нового варианта устройства для получения базального трахеобронхиального секрета и оценки диагностической значимости его цитологических характеристик, на основе оригинального базового устройства названного его автором В. А. Добрых «фарингеальной ловушкой».

Цель исследования:

Усовершенствование технологии получения образцов БТС и изучение его цитологических характеристик у здоровых людей и при заболеваниях респираторной системы.

Задачи исследования:

1. Усовершенствовать методику получения образцов БТС с помощью разработанного нами нового варианта устройства «фарингеальная ловушка».

2. Провести сравнительный анализ цитологических характеристик образцов БТС в зависимости от способа его получения, и метода исследования мазка.

3. Исследовать цитологические характеристики образцов БТС у здоровых людей с учетом их возраста, пола и фактора табакокурения.

4. Провести сравнительные исследования цитологических характеристик образцов БТС при острых респираторных заболеваниях верхних и нижних дыхательных путей.

5. Провести сравнительное изучение цитологических характеристик образцов БТС у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями бронхолегочной системы.

Научная новизна работы:

1. Создан новый вариант устройства «фарингеальная ловушка».

2. Впервые определены цитологические характеристики БТС у практически здоровых людей и их изменение при асимптомном табакокурении.

3. Впервые выявлены цитологические изменения в составе БТС в зависимости от фаз менструального цикла у практически здоровых женщин.

4. Впервые установлено влияние интенсивности табакокурения на формирование эозинофилии БТС у больных с внебольничной пневмонией.

5. Впервые конкретизированы топические клеточные взаимоотношения в БТС у больных с хроническими воспалительными заболеваниями бронхолегочной системы.

Практическая значимость работы:

В результате проведенных нами исследований предложена усовершенствованная методика получения и исследования цитологических характеристик БТС. Благодаря новой методике стала возможна количественная оценка клеточного состава БТС у здоровых людей и при патологии респираторной системы.

Установлены количественные характеристики клеточного состава образцов БТС, ассоциированные с асимптомным табакокурением и клиническими симптомами хронического бронхита, которые могут использоваться в качестве объективного биомаркера для диагностики этапов формирования хронического бронхита и ХОБЛ, связанных с табакокурением.

Положения выносимые на защиту:

1. Новый вариант устройства «фарингеальная ловушка», усовершенствованная с его помощью методика получения образцов БТС и исследования их цитологических характеристик позволяют улучшить диагностику воспалительных и иных изменений слизистой трахеобронхиального дерева.

2. У молодых людей в возрасте 18-24 года отсутствуют гендерные различия в цитограммах образцов БТС. Имеются достоверные цитологические различия в образцах БТС на разных фазах менструального цикла у практически здоровых молодых женщин, заключающиеся в том, что в фазу пролиферации чаще встречаются клетки мерцательного эпителия, а в фазу секреции чаще определяются нейтрофилы. При асимптомном табакокурении в соответствии с его интенсивностью в цитограмме БТС имеет место однотипное прогрессирующее снижение относительного содержания альвеолярных макрофагов и нарастание нейтрофилов и эозинофилов.

3. Имеются достоверные различия цитологических показателей в образцах БТС у пациентов с ОРЗ в зависимости от преобладающего поражения тех или иных отделов дыхательных путей. У больных ОРЗ симптоматика кашля ассоциируется с повышенным количеством макрофагов и клеток мерцательного эпителия, у больных с симптоматикой острого ринофарингита имеется повышенный уровень нейтрофилов. При остром ринофарингите имеются достоверные корреляции между уровнем лихорадки, абсолютным числом нейтрофилов и неэпителиальным цитозом. При остром ларинготрахеите имеет место достоверная положительная корреляционная связь между показателями абсолютного количества клеток мерцательного эпителия и уровнем лихорадки.

4. В острый период внебольничной пневмонии в образцах БТС преобладает нейтрофильный лейкоцитоз, а абсолютное количество макрофагов достоверно снижено. В период разрешения заболевания увеличивается присутствие в образцах БТС макрофагов, а абсолютное количество нейтрофилов и общий цитоз достоверно снижены. В период разрешения пневмонии уровень эозинофилии БТС связан с интенсивностью табакокурения.

5. У больных ХБ уровень общего цитоза тесно коррелирует в форме положительной связи с длительностью и интенсивностью табакокурения. У больных ХОБЛ в отличие от больных ХБ имеет место более низкий уровень цитоза и содержания макрофагов при повышении количества нейтрофилов. У больных БА в зависимости от повышения степени тяжести заболевания отмечается достоверное увеличение общего цитоза, относительного и абсолютного количества эозинофилов и нейтрофилов.

6. В отличие от больных хроническим бронхитом и ХОБЛ при БА имеет место более выраженная неравномерность распределение клеток в образцах БТС суммарно и в отдельности макрофагов. При ХОБЛ в образцах БТС отмечен определенный «топический антагонизм» нейтрофилов и макрофагов, а при бронхиальной астме, напротив, имеет место «топический синергизм» этих клеток. Эозинофилы у больных бронхиальной астмой «топически интактны» по отношению к нейтрофилам и макрофагам.

Апробация результатов диссертации: материалы исследования были доложены на симпозиумах II съезда врачей - пульмонологов Сибири и Дальнего Востока в 2007 году и 18 Национального конгресса по болезням органов дыхания. Результаты исследований были представлены в материалах 15,17,18 Национальных конгрессов по болезням органов дыхания (Москва, Екатеринбург 2005, 2007, 2008 гг.). Получено положительное решение о выдаче патента на устройство заявке № 2007141467 от 7.11.2007 года. Созданный нами новый вариант устройства для получения трахеобронхиального содержимого при патологии бронхолегочной системы был награжден серебряной медалью и дипломом II степени на международной XV выставке-конгрессе «Высокие технологии, Инновации. Инвестиции» в Санкт-Петербурге в марте 2009 году.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 в центральных научных изданиях, получены 7 свидетельств на рационализа-торские предложения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, который включает в себя 139 отечественных и 100 зарубежных источников. Текст изложен на 149 страниц машинописного текста, иллюстрирован 40 рисунками, 24 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Обследование больных и здоровых людей проводилось на базе терапевтических и ПАО (патологоанатомического) отделений, 301 ОВКГ, ГУЗ «Клинического центра восстановительной медицины и реабилитации» г. Хабаровска в 2005-2009 г. Обследовано в общей сложности 420 человек. В соответствии с целями и задачами исследования весь контингент обследованных был распределен на 6 групп.

В 1 группу вошли 52 пациента мужского пола, в возрасте от 18 до 24 лет, с диагнозом внебольничной пневмонии. Все пациенты были курильщиками со стажем курения 3-5 лет. Диагноз внебольничной пневмонии был установлен на основании клинико- рентгенологических и лабораторных данных в соответствии с МКБ-Х и практическими рекомендации по диагностике, лечению и профилактике внебольничной пневмонии.

Получение образцов БТС осуществлялось дважды: первый раз на 2-3 день заболевания и повторно в период разрешения заболевания на 12-13 день пребывания в стационаре после проведения контрольной рентгенографии грудной клетки, на которой во всех случаях отмечалось выраженная положительная динамика выявленных ранее изменений.

Во 2 группу были включены 28 обследованных мужского пола, больных хроническим бронхитом, вызванным табакокурением. Диагноз хронического бронхита (ХБ) в соответствии с существующими эпидемиологическими критериями устанавливался при наличии длительного курения и симптоматики хронического кашля и /или выделения мокроты, на протяжении 3 месяцев в году 2 и более лет подряд. Возраст обследованных составил 23-46 лет.

В 3 группу вошли 8 больных ХОБЛ на I - II стадии заболевания. Все они были мужского пола, их средний возраст составил 56,1 лет. Основной причиной заболевания было длительное табакокурение. В среднем стаж курения составил 29,8 лет. Установление диагноза проводилось на основании критериев отраженных в клиническом руководстве «Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких» (2004г.). Для определения тяжести заболевания этим пациентам проводилось стандартное спирографическое исследование. Функциональными критериями ХОБЛ считали постбронходилятационные показатели ОФВ₁< 80% от должных величин и/ или ОФВ₁/ ФЖЕЛ (индекс Тиффно) <70%.

В 4 группу вошли больные бронхиальной астмой легкого и среднетяжелого течения. Все они были женского пола, их средний возраст составил 41,4 лет. Установление диагноза проводилось на основании критериев отраженных в клиническом руководстве «Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы» (2006 г.). Для определения тяжести заболевания помимо клинического обследования пациентам проводилось стандартное спирографическое исследование с проведением проб с бронхолитиками. Наличие обратимой бронхиальной обструкции (восстановление ОФВ₁, индекса Тиффно более чем на 15%), было одним из критериев, подтверждающих нозологический диагноз.

В 5 группу - вошли 24 студента больных ОРЗ (из них 12 мужского пола) в возрасте от 22 до 28 лет на 4-5 день заболевания. В зависимости от преобладающей симптоматики поражения тех или иных отделов дыхательных путей обследуемые были разделены на 3 подгруппы: 1) острый ринофарингит - 10 обследованных 2) острый бронхит - 8 больных 3) острый ларинготрахеит - 6 больных.

6 группа - курящие и некурящие практически здоровые волонтеры мужского и женского пола, студенты ДВГМУ и сотрудники фирмы «Мегатекс». Среди обследованных 7 человек были некурящими, а 64 человек являлись курильщиками с различным стажем и интенсивностью курения.

Традиционные методы обследования пациентов 1, 3, 4 групп включали рентгенографию, исследование функции внешнего дыхания (ФВД), общий и биохимический анализы крови.

Причиной отнесения получения и исследования базального трахеобронхиального секрета в раздел оригинальных методик в наших исследованиях стало то, что нами была существенно изменена конструкция «фарингеальной ловушки» и усовершенствована методика получения образцов базального трахеобронхиального секрета, впервые проведено изучение его клеточного состава.

Модифицированное устройство состояло из трех металлических пластин, соединенных между собой пружинной рукоятью (см. рис. 1).

Рис. 1. «Фарингеальная ловушка» в действии

Процедура исследования состояла в том, что после получения информированного согласия пациента устройство вводилось в ротовую полость, с фиксацией нижней пластиной корня языка пациента. Верхняя пластина выдвигалась и устанавливалась напротив входа в гортань. Пациент производил несколько сильных кашлевых толчков, секрет попадал на экран верхней пластины (рис 1), после чего верхняя пластина возвращалась в исходное положение, устройство извлекалось из ротовой полости. Секрет с экрана устройства переносился на предметное стекло.

По традиционной методике из полученного материала делался мазок и высушивался при комнатной температуре. Затем его окрашивали методом May-Grunwald-Giemsa, после чего проводили подсчет клеточных элементов. Цитологическое исследование окрашенных препаратов проводилось при увеличении в 1000 раз на светооптическом бинокулярном микроскопе. Мы провели сравнительное изучение 2 методик просмотра мазка: подсчет клеток в областях их наибольшего скопления (традиционная методика), и в случайно выбранных полях зрения, что более соответствовало решению задач нашего исследования. Изначально клеточные элементы анализировали при просмотре не менее 20 полей зрения, повторно для анализа особенностей топического распределения клеток - в 10 случайно выбранных полях зрения.*

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программ BIOSTAT и Microsoft Exсel. В части сопоставлений определяли среднюю арифметическую (М), её ошибку (±m), рассчитывали критерий соответствия (х²) и коэффициент корреляции (г). Парный корреляционный анализ выполняли по методу Пирсона. Оценку достоверности различий данных оценивали по обычному и парному критерию Стьюдента (t) и значению вероятности (р). Различия считались достоверными при t<2,0, что соответствовало вероятности безошибочного прогноза, равной 95% и более (р<0,05). Значительная часть полученных нами данных была проанализирована с помощью непараметрических методов Вилкоксона - Манна - Уитни и Фишера.

Результаты собственных исследований.

С целью сравнительной оценки диагностической значимости цитологических характеристик образцов БТС, полученных по вышеописанной методике, нами было обследовано 42 больных внебольничной пневмонией мужского пола в возрасте от 18 до 24 лет в период разрешения инфильтрации, и достижения стойкого клинического эффекта (на 10-14 день лечения в стационаре). У каждого больного получали БТС с помощью «фарингеальной ловушки». В тот же день у этих больных традиционным методом получали мокроту. Была произведена сравнительная оценка клеточных элементов в мокроте и базальном трахеобронхиальном секрете (БТС).

Сопоставление цитологических характеристик мокроты, и образцов БТС, полученных с помощью “фарингеальной ловушки”, показало, что образцы БТС достоверно точнее отражают известные цитологические характеристики секрета бронхов, в сравнении с мокротой полученной традиционным методом (M.N.Dikes et al., 1994; М.В.Самсонова, 2006).

На следующем этапе исследования нами проводилось сравнительное изучение 2 методик просмотра мазка: подсчет клеток в областях их наибольшего скопления (традиционная методика), и в случайно выбранных полях зрения, что было более подходящим для решения задач нашего исследования. Сравнивались оба подхода применительно к образцам БТС, у 18 здоровых курящих волонтеров мужского пола в возрасте от 18 до 23 лет.

* - выражаем искреннюю благодарность за помощь в работе сотрудникам 301 ОВКГ: зав. лабораторией Н. Ю. Рукиной, зав. ЛОР-отделением П. Я. Побережному, врачу цитологу ПАО О. А. Ковалевой и врачам 7 и 24 отделений.

Проведенный анализ, не выявил ни каких различий клеточного состава БТС между этими способами, что означает, что для обследованного контингента молодых мужчин каждый из вышеназванных методов может заменять другой при традиционной оценке цитограмм. В тоже время метод просмотра случайно выбранных полей зрения более пригоден для оценки взаимодействия клеток по топическому признаку. Именно он дает возможность более объективно оценивать взаимодействия клеток при различных видах воспалительных реакции в слизистой бронхов.

Следующим этапом нашего исследования стало сопоставление цитологических характеристик образцов биосубстрата, взятых со слизистой поверхности гортани, задней стенки глотки и БТС, полученного посредством «фарингеальной ловушки». Нами было обследовано 10 практически здоровых волонтеров мужского пола в возрасте от 18 до 22 лет. В течение одного часа, проводилось взятие биоматериала в 3 этапа. На первом этапе получали БТС с помощью «фарингеальной ловушки». На втором этапе через 15-20 минут, получали образцы биосубстрата со слизистой поверхности задней стенки глотки. На третьем этапе через 10-15 минут получали образцы биосубстрата со слизистой поверхности верхнего отдела гортани.

Проведенный анализ показал, что клеточный состав образцов БТС резко отличался от клеточного состава биоматериалов, полученных с поверхностей задней стенки глотки, слизистой гортани, представленного преимущественно клетками плоского эпителия (83%), мерцательного эпителия (4%) и нейтрофилов (13%). Это указывало на то, что полученный с помощью «фарингеальной ловушки» биоматериал является преимущественно содержимым нижних дыхательных путей, что подтверждалось минимальным количеством клеток плоского эпителия (9%), значительным содержанием макрофагов (60%), нейтрофилов (26%), эозинофилов (3%) и клеток цилиндрического эпителия (2%).

Следующим этапом нашего исследования стало проведение цитологического анализа образцов БТС, в зависимости от фаз менструального цикла. В исследовании участвовали практически здоровые волонтеры женщины в возрасте 18 - 20 лет.

Полученные данные показали, что в образцах БТС, в зависимости от фаз менструального цикла выявляются достоверные различия. В фазу пролиферации чаще, чем в фазу секреции, встречались клетки мерцательного эпителия (26%), а в фазу секреции чаще встречались нейтрофилы (40%). Достоверных различий в содержании макрофагов, эозинофилов не было отмечено.

При сопоставлении цитологических характеристик образцов БТС у здоровых молодых людей одного возраста (18-24 лет) гендерных различий изучаемых показателей не было выявлено ни для одного параметра.

Изучение цитологического состава образцов БТС у больных ОРЗ в наших исследованиях преследовало не только научную, но и конкретную цель дифференциальной диагностики бактериального и вирусного воспаления - вопроса важного для медицинской практики. Известно, что воспалительная реакция, связанная с этими возбудителями проявляются различной лабораторной реакцией клеток крови: нейтрофильный лейкоцитоз при бактериальной инфекции и нейтропения при ОРВИ.

В таблице 1 приведены данные о цитологических характеристиках образцов БТС больных ОРЗ имеющих различную симптоматику заболевания.

Таблица 1 Сравнительные цитологические характеристики БТС у больных ОРЗ с симптомами острого ринофарингита, острого бронхита, острого ларинготрахеита.

Клеточный состав БТС	1 группа Острый ринофарингит n=10 843 клеток	2 группа Острый бронхит n=8 830 клеток	3 группа Острый ларинготрахеит n=6 236 клеток
МФ %	11,8	79,1*	7,8**
Нейтрофилы %	87,9*	19,4	29,5***
Мерцательный эпителий %	0,3	1,5**	62,7***
Цитоз (в среднем клеток в 10 полях зрения)	84,3 клеток	103,8 клеток**	39,3 клеток***

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в 1 и 2 группах (р<0,05), ** - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в 2 и 3 группах(р<0,05), ), *** - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в 1 и 3 группах (р<0,05).

При анализе данных представленных в таблице несколько необычными кажутся заметные различия состава БТС при разных вариантах ОРЗ. Вероятно, выявленный нейтрофилез у больных острым ринофарингитом связан с бактериальной природой воспаления, в то же время у больных острым бронхитом отсутствие нейтрофильной реакции, подтверждало известные данные преимущественно вирусной этиологии этого варианта ОРЗ.

В связи с тем, что образцы БТС преимущественно представляют собой биоматериал, содержащийся в гортани и трахее, острый воспалительный процесс на этом уровне вероятно и проявился большим количеством десквамированных клеток мерцательного эпителия.

Таким образом, наши исследования показали, что цитограммы базального трахеобронхиального секрета полученные у больных ОРЗ имеющих симптомы острого ринофарингита, острого бронхита и острого ларинготрахеита существенно различаются по клеточному составу, что связанно с уровнем поражения дыхательных путей и возможными этиологическими различиями.

Еще одним этапом нашего исследования стал сравнительный корреляционный анализ числа клеток в образцах БТС и показателей степени лихорадки у больных ОРЗ. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции цитологических характеристик образцов БТС и степени лихорадки у больных ОРЗ.

Клинический вариант ОРВИ	Макрофаги	Мерцательный эпителий	Нейтрофилы	Цитоз
Острый ринофарингит	-0,39	-0,32	0,59*	0,62*
Острый бронхит	0,16	0,29	0,41	0,22
Острый ларинготрахеит	0,31	0,78*	0,38	0,25

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в обеих группах (р<0,05).

Представленные в таблице данные показывают, что при остром ринофарингите имеются достоверные корреляции между степенью лихорадки и абсолютным числом нейтрофилов, цитозом, а при остром ларинготрахеите существует достоверная положительная связь между показателями абсолютного количества клеток мерцательного эпителия и степенью лихорадки.

Таким образом, общий интоксикационный синдром в ряде случаев был положительно связан с выраженностью нейтрофильного воспаления и активностью десквамации мерцательного эпителия.

На следующем этапе исследований мы сопоставляли абсолютные показатели клеточного состава в 10 полях зрения в образцах БТС у больных ОРЗ в зависимости от наличия или отсутствия у них кашля (ср. значение). Полученные нами результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Абсолютные показатели клеточного состава в 10 полях зрения в образцах БТС у больных ОРЗ в зависимости от наличия или отсутствия кашля (средние значения).

Клетки	Кашель n=14	Отсутствие кашля n=10
МФ	48,0*	11,0
Мерцательный эпителий	11,1*	4,1
Нейтрофилы	16,9	72,9*
Цитоз	76,2	84,3

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в обеих группах (р<0,05).

Представленные в таблице данные показывают, что симптоматика кашля у больных ОРЗ ассоциируется с относительно большим количеством макрофагов и клеток мерцательного эпителия (р<0,05), в то же время относительный нейтрофилез достоверно выше у пациентов с отсутствием симптома кашля (р<0,05). Это различие связано, вероятно, с тем, что у больных с симптомами кашля (острый ларинготрахеит и острый бронхит) воспалительный процесс имел преимущественно вирусную природу, в то время как при отсутствии кашля (острый ринофарингит) нейтрофильная реакция свидетельствовала о преобладании бактериального воспаления.

Еще одним разделом нашего исследования стало изучение цитограмм образцов БТС в динамике у больных ВП мужчин молодого возраста, являющиеся военнослужащими. Контрольную группу составили асимптомные курящие. Соответствующего социального положения, возраста и пола.

Получение БТС осуществлялось дважды: первый раз на 2-3 день заболевания и повторно в период разрешения заболевания на 12-13 день пребывания в стационаре.

Динамика изменений клеточного состава базального трахеобронхиального секрета у больных внебольничной пневмонией отражена в таблице 4.

Таблица 4 Сравнительные характеристики цитограмм неэпителиальных клеток образцов БТС в период разгара и разрешения внебольничной пневмонии.

Клеточный состав БТС	Контрольная группа n=7 427 клеток	Период разгара (2-3 день) n=10 1170 клеток	Период разрешения (12-13 день) n=10 570 клеток
МФ %	43,5±4,1	27,1±4,2*	77,2±7,6**
Нейтрофилы %	56,2±4,2*	71,3±7,2*	20,5±3,2**
Эозинофилы %	0,3±0,1	1,5±0,5	1,6±0,5
Цитоз (в среднем клеток в 10 полях зрения)	61,2 клеток	117 клеток*	56,9 клеток

Примечание: * - обозначены достоверные различия в сравнении с группой контроля, ** - достоверные различия при сравнении периодов течения пневмонии (р<0,05).

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что, цитологический состав БТС в различные периоды пневмонии существенно изменяется. Если в острый период заболевания преобладает нейтрофильный лейкоцитоз, а абсолютное количество макрофагов достоверно снижается, то в период разрешения заболевания достоверно увеличивается присутствие в образцах БТС макрофагов, а количество нейтрофилов и общий цитоз достоверно снижается.

На основании выявления у ряда больных внебольничной пневмонии высокой эозинофилии БТС на следующем этапе исследований нами было проведено сопоставление цитограмм у молодых мужчин больных пневмонией в период разрешения заболевания с высоким индексом курения (ИК более 120) и у молодых курящих без симптомов острой инфекции нижних дыхательных путей (ИНДП) с такими же показателями индекса курения. Результаты представлены на таблице 5

Таблица 5. Неэпителиальные цитограммы образцов БТС у молодых мужчин больных пневмонией и без признаков ИНДП с высоким показателем индекса курения (%).

Клеточный состав, %	Больные пневмонией n=5 516 клеток	Пациенты без ИНДП n =13 1574 клетки
Нейтрофилы	85,0 *	51,7
Макрофаги	3,8	46,6*
Эозинофилы	9,0 *	1,7
Лимфоциты	2,3	0,06

Примечание: * - обозначены статистически достоверные различия сравниваемых показателей (р< 0,05).

Как следует из представленных в таблице результатов у пациентов с пневмонией, было закономерно увеличено относительное количество нейтрофилов и уменьшено число макрофагов, что можно связать с наличием бактериальной инфекции. Достоверно более высокий уровень эозинофилии у больных пневмонией, вероятно, объясняется сочетанным потенцирующим сенсибилизирующим эффектом влияния интенсивного табакокурения, бактериальной инфекции и применявшейся антибактериальной терапии. Этот вывод подтверждался тем, что у асимптомных курящих и больных хроническим бронхитом эозинофилия образцов БТС не была связана с интенсивностью курения, а у больных внебольничной пневмонией с низкой интенсивностью курения эозинофилия не отмечалась.

Таким образом, проведенный анализ показал, что интенсивное табакокурение является фактором риска развития эозинофилии дыхательных путей при внебольничной пневмонии нетяжелого течения.

Известно, что табакокурение является важнейшим фактором риска развития хронического бронхита (В.Ф.Жданов,2001; А.Г. Чучалин,2002).

В наших исследованиях мы оценивали влияние курения на цитологические характеристики БТС у здоровых молодых асимптомных курящих. Нами было обследовано 14 здоровых волонтеров мужского пола в возрасте от 18 до 24 лет. 7 из них были здоровыми молодыми асимптомными курящими с небольшим стажем и интенсивностью курения, другие 7 были здоровыми молодыми некурящими. Полученные нами результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 Сравнительные цитологические характеристики БТС у здоровых молодых некурящих и асимптомных курящих мужчин.

Клеточный состав БТС	Здоровые некурящие n=7 294 клеток	Асимптомные курящие n=7 427 клеток
МФ %	78,3±0,8*	43,5±4,1
Нейтрофилы %	21,7±0,8	56,2±4,2*
Эозинофилы %	0,0±0,0	0,3±0,8
Цитоз (в среднем клеток в 10 полях зрения)	42,1 клеток	61,2 клеток

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в обеих группах (р<0,05).

Результаты, приведенные в таблице, и другие данные показали, что при асимптомном табакокурении в цитограмме БТС выявлено однотипное прогрессирующее снижение относительного содержания альвеолярных макрофагов и нарастание нейтрофилов и эозинофилов.

На следующим этапе исследований мы сравнивали цитологические характеристики БТС у больных хроническим бронхитом с небольшим стажем курения (ИК =180, П/Л=4) и больных хроническим бронхитом с длительным стажем курения(ИК =240, П/Л =11), вне обострения заболевания. Полученные нами результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7 Сравнительные цитологические характеристики БТС у больных ХБ с небольшим стажем курения и больных ХБ с длительным стажем курения.

Клеточный состав БТС	Хронический бронхит (ИК =180, П/Л =4) n=12 1430 клеток	Хронический бронхит (ИК =240, П/Л =11) n=16 2640 клеток
МФ %	65,3±4,0	57,5±6,1
Нейтрофилы %	34,3±4,7	41,9±6,1
Эозинофилы %	0,4±0,3	0,6±0,4
Цитоз (в среднем клеток в 10 полях зрения)	119,5 клеток	165,3* клеток

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в обеих группах (р<0,05).

При анализе клеточного состава у больных ХБ с небольшим стажем курения и больных ХБ с длительным стажем курения (данные таблицы) достоверных различий в образцах БТС сравниваемых групп относительного содержания нейтрофилов, макрофагов, эозинофилов не отмечено. При исследовании цитоза выявилось достоверное преобладание количества клеток у больных ХБ с длительным стажем курения в отличие от больных ХБ с небольшим стажем курения. Нарастание цитоза происходило за счет преимущественного увеличения количества нейтрофилов.

Следующим этапом наших исследований было сравнение цитологических характеристик образцов БТС у больных хроническим бронхитом с длительным стажем курения (ИК =240, П/Л =11) и больных ХОБЛ на I - II стадии заболевания, вне периода обострения заболевания. Полученные нами результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8 Сравнительные цитологические характеристики БТС у больных хроническим бронхитом и больных ХОБЛ.

Клеточный состав БТС	Хронический бронхит (ИК =240, П/Л =11) n=16 2640 клеток	ХОБЛ n=8 976 клеток
МФ %	57,5±6,1*	27,7±3,4
Нейтрофилы %	41,9±6,1	70,5±3,0*
Эозинофилы %	0,6±0,4	1,8±0,7
Цитоз (в среднем клеток в 10 полях зрения)	165,3 клеток	122,2 клеток

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в обеих группах (р<0,05).

Приведенные в таблице данные выявили различия, проявляющиеся в достоверном преобладании у больных хроническим бронхитом относительного количества макрофагов, а у больных ХОБЛ достоверном преобладании нейтрофилов. Показатель цитоза у больных ХОБЛ уменьшался за счет снижения количества макрофагов.

Несмотря на то, что цитологический состав содержимого дыхательных путей при бронхиальной астме довольно хорошо изучен, исследований применительно к цитологическому составу БТС до настоящего времени не было.

В связи с этим мы посчитали необходимым провести исследование цитологических характеристик образцов БТС у больных БА.

В ходе наших исследований мы провели сравнения цитологических характеристик БТС у больных бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания. Нами было обследовано 24 больных бронхиальной астмой женского рода в возрасте от 25 до 45 лет, у семи из которых была легкая степень тяжести заболевания, а у 17 - средняя степень тяжести заболевания. Полученные результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9 Сравнительные цитологические характеристики БТС больных бронхиальной астмой легкой и средней степени тяжести.

Клеточный состав БТС	Больные бронхиальной астмой легкой степени тяжести n=7 675 клеток	Больные бронхиальной астмой средней степени тяжести n=17 4574 клеток
МФ %	69,3±2,1*	23,5±5,4
Нейтрофилы %	6,9±2,3	19,1±4,6*
Эозинофилы %	23,8±0,5	57,6±9,4*
Цитоз (в среднем клеток в 10 полях зрения)	96,4 клеток	269,0* клеток

Примечание: * - обозначены достоверные различия сравниваемых аналогичных показателей в обеих группах (р<0,05).

Проведенные сопоставления показали, что у больных бронхиальной астмой при увеличении степени тяжести заболевания воспалительная реакция в дыхательных путях в цитограмме базального трахеобронхиального секрета проявляется достоверным увеличением общего цитоза, относительного и абсолютного количества эозинофилов, нейтрофилов (р<0,05).

В дальнейшей серии наших исследований была проведена оценка взаимодействий клеток воспаления при бронхиальной астме, ХБ, ХОБЛ по относительно новому диагностическому критерию: взаимному пространственному расположению клеток в образцах БТС.

Возможность изучения топического расположения клеток как показателя межклеточных взаимодействий в образцах БТС, реализованная в наших исследованиях, была обусловлена «нативностью» субстрата и минимальными модифицирующими влияниями при получении образцов.

Были исследованы образцы БТС у 49 пациентов (490 полей зрения, 4668 клеток). Определялась равномерность распределения клеток по полям зрения (площадь каждого около 0,01мм²) по критерию величины коэффициента вариации. Были рассчитаны коэффициенты корреляции между содержанием в полях зрения нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов у разных групп обследованных.

На рисунке 2 показаны величины, характеризующие степень неравномерности распределения всех неэпителиальных клеток в сравниваемых группах.

Рис. 2. Степень неравномерности распределения неэпителиальных клеток в полях зрения по критерию коэффициента вариации у здоровых некурящих, у больных хроническим бронхитом, у больных ХОБЛ и бронхиальной астмой.

Как показано на рисунке 2 наиболее выраженная достоверно значимая в сравнении с другими группами неравномерность распределения клеток отмечена в группе больных бронхиальной астмой.

На рисунке 3 приведены показатели неравномерности распределения по полям зрения нейтрофилов в тех же группах.

Рис. 3. Степень неравномерности распределения нейтрофилов в полях зрения по критерию коэффициента вариации.

Статистический анализ представленных на рисунке показателей не выявил достоверных различий ни в одном случае.

На рисунке 4 приведены показатели неравномерности распределения по полям зрения альвеолярных макрофагов в тех же группах.

Рис. 4. Степень неравномерности распределения альвеолярных макрофагов в полях зрения по критерию коэффициента вариации.

Приведенные данные показывают преобладание неравномерности распределения макрофагов.

Таким образом, у больных бронхиальной астмой распределение всех клеток суммарно и макрофагов было наиболее неравномерным в сравнении с другими группами.

Следующим этапом исследования стало корреляционное сопоставление содержание клеток каждого типа по полям зрения между собой. Были обследованы 7 здоровых некурящих мужчин (50 полей зрения), 8 здоровых курящих мужчин (61 поле зрения), 12 курящих больных хроническим бронхитом (124 поля зрения), 8 больных ХОБЛ (77 полей зрения), 14 больных бронхиальной астмой (140 полей зрения). На рисунке 5 показаны коэффициенты корреляции между нейтрофилами и макрофагами в сравниваемых группах.

Рис. 5. Корреляции содержания нейтрофилов и макрофагов в полях зрения в образцах БТС у здоровых некурящих мужчин (1), курильщиков (2), больных ХБ (3), больных ХОБЛ (4). Звездочками выделены статистически достоверные корреляции (р < 0,05).

Приведенные на рисунке результаты расчета показывают, что у здоровых некурящих достоверной корреляции между этими показателями выявлено не было. Достоверная положительная корреляционная связь между изучаемыми клетками имела место у асимптомных курильщиков.

В то же время, у больных хроническим бронхитом и, особенно, ХОБЛ, она приобрела отрицательный характер.

У пациентов с бронхиальной астмой была возможность проведение корреляционного анализа между содержащимися в образцах БТС клетками 3 типов: макрофагами, нейтрофилами, эозинофилами (см. рис. 6).



Рис. 6. Корреляции распределения по полям зрения у больных бронхиальной астмой эозинофилов и нейтрофилов (1), эозинофилов и макрофагов (2), нейтрофилов и макрофагов (3).

Примечание: звездочкой обозначена статистически достоверная корреляционная связь между пациентами 2 и 3 групп (р< 0,05).

Представленные на рисунке данные выявили положительную корреляционную связь только между нейтрофилами и макрофагами.

Таким образом, проведенные сопоставления позволяют придти к предварительному заключения о том, что при формировании ХОБЛ, связанной с табакокурением увеличивается «топический антагонизм» нейтрофилов и макрофагов, а при бронхиальной астме, напротив, имеет место их «топический синергизм». Эозинофилы в этом контексте у больных бронхиальной астмой являются «топически интактными» клетками по отношению к нейтрофилам и макрофагам.

Выводы

1.Разработанный нами новый вариант устройства - «фарингеальная ловушка» - и усовершенствованная методика получения образцов базального трахеобронхиального секрета и исследования их цитологических характеристик имеют существенные преимущества в сравнении с другими методиками получения образцов содержимого бронхиального дерева и изучения их цитологических параметров.

2. В цитограммах образцов БТС у молодых людей в возрасте 18-24 года гендерные различия отсутствуют. У практически здоровых молодых женщин имеются достоверные цитологические различия в образцах БТС на разных фазах менструального цикла. Клетки мерцательного эпителия чаще встречаются в фазу пролиферации, а нейтрофилы - в фазу секреции. У асимптомных курящих в зависимости от интенсивности табакокурения в образцах БТС имеется достоверное снижение относительного количества альвеолярных макрофагов и увеличения нейтрофилов и эозинофилов.

3.Симптоматика кашля у больных ОРЗ связана с повышенным количеством макрофагов и клеток мерцательного эпителия. При симптоматике ринофарингита у больных ОРЗ отмечается повышенный уровень нейтрофилов. При остром фарингите имеются достоверные корреляции между уровнем лихорадки, абсолютным числом нейтрофилов и цитозом. Имеется достоверная положительная корреляционная связь между показателями абсолютного количества клеток мерцательного эпителия и степенью лихорадки при остром ларинготрахеите.

4.В образцах БТС в остром периоде внебольничной пневмонии преобладает нейтрофильный лейкоцитоз, а абсолютное количество макрофагов достоверно снижено. В период разрешения заболевания в достоверно увеличивается количество макрофагов, а абсолютное количество нейтрофилов и общий цитоз достоверно снижаются. В период разрешения внебольничной пневмонии высокий уровень эозинофилии в образцах БТС зависит от интенсивности табакокурения.

5.Имеет место достоверное нарастание показателя цитоза у больных ХБ при увеличении длительности и интенсивности табакокурения. В образцах базального трахеобронхиального секрета у больных хроническим бронхитом имеется достоверное преобладание макрофагов, а у больных ХОБЛ - достоверное преобладание нейтрофилов. У больных ХОБЛ в отличие от больных с ХБ отмечено снижение цитоза, содержания макрофагов и нарастание нейтрофилов. При средней тяжести течения бронхиальной астмы в образцах БТС имеет место достоверное увеличение общего цитоза, относительного и абсолютного количества эозинофилов и нейтрофилов в сравнении с астмой легкой степени тяжести.

6.У больных бронхиальной астмой в отличие от больных хроническим бронхитом и ХОБЛ отмечена более выраженная неравномерность распределение клеток суммарно и отдельно макрофагов в образцах БТС. В образцах БТС при ХОБЛ имеет место определенный «топический антагонизм» нейтрофилов и макрофагов, а при бронхиальной астме, напротив, имеет место «топический синергизм» этих клеток. У больных бронхиальной астмой эозинофилы «топически интактны» по отношению к нейтрофилам и макрофагам.

Практические рекомендации

1.Созданный нами новый вариант устройства «фарингеальная ловушка» и усовершенствованная методика получения и исследования цитологических характеристик образцов базального трахеобронхиального секрета могут быть использованы для оценки выраженности воспалительных изменений в слизистой оболочке бронхов у асимптомных курильщиков, больных хроническим бронхитом, ХОБЛ и бронхиальной астмой.

2.Предлагаемое устройство и методика могут применяться как в поликлинике, так и в условиях стационара для ранней диагностики заболеваний бронхолегочной системы и оценки эффективности их лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Добрых, В.А. Цитологические характеристики базального трахеобронхиального секрета и мокроты у больных внебольничной пневмонией/ В.А. Добрых, Е.В. Медведева, Н.Ю.Рукина, С.А.Овчаренко// 15 Национальный Конгресс по болезням органов дыхания. Сборник тезисов М.2005 г. С.101.

2. Добрых, В.А. Динамика цитоморфологических изменений базального трахеобронхиального секрета при табакокурении и формировании хронического бронхита и ХОБЛ /В.А.Добрых, Е.В.Медведева, Е.А.Фролова // Материалы 2 съезда врачей - пульмонологов Сибири и Дальнего Востока, Благовещенск, 2007г. С.97-98.

3. Добрых, В.А. Цитоморфологические и физические характеристики базального трахеобронхиального секрета при табакокурении, хроническом бронхите и ХОБЛ/ В.А.Добрых, Е.В.Медведева, Е.А.Фролова, О.П.Гнатюк, С.И.Овчаренко, В.В.Кортелев// 17 Национальный Конгресс по болезням органов дыхания. Сборник тезисов М.2007г. С.164.

4. Медведева, Е.В. Метод получения и исследования цитологических характеристик базального трахеобронхиального секрета/ Е.В.Медведева, С.А.Овчаренко, Н.Ю.Рукина. Актуальные вопросы современной медицины. Материалы 64-й итоговой научной конференции// Хабаровск, апрель 2007 год. С 22-23.

5. Добрых, В.А. Неинвазивная технология получения и исследования базального трахеобронхиального секрета в диагностике заболеваний респираторной системы/ В.А.Добрых, Е.В. Медведева, О.П.Гнатюк, И.В.Уварова, Е.А.Фролова // 2 Национальный конгресс терапевтов. Сборник

материалов// Москва, 2007г. С.64.

6. Добрых, В.А.Характеристика субъективных симптомов, ассоциируемых с ХОБЛ, у городских жителей Приамурья/ В.А.Добрых, В.П.Колосов, Е.В.Медведева, Л.Д.Власова, П.В. Мотаева. // Дальневосточный медицинский журнал , 2007г., №1,С.19-22.

7. Добрых, В.А. Содержание нейтрофилов в базальном трахеобронхиальном секрете как биомаркер табакокурения и хронического кашля/ В.А.Добрых, Е.В.Медведева, О.П.Гнатюк, Т.М.Макарова, Е.А.Фролова. 18 Национальный Конгресс по болезням органов дыхания. Сборник трудов конгресса. // Уральский медицинский журнал. Екатеринбург, 2008г. С.143.

8. Добрых, В.А. Распределение клеток воспаления в базальном трахеобронхиальном секрете при табакокурении, хроническом бронхите, ХОБЛ и бронхиальной астме/ В.А.Добрых, Е.В.Медведева, О.П.Гнатюк, С.П.Фролов, О.А.Ковалева. 18 Национальный Конгресс по болезням органов дыхания. Сборник трудов конгресса. // Уральский медицинский журнал. Екатеринбург, 2008г. С.215.

Размещено на Allbest.ru