Изучение молекулярных основ предрасположенности к раку желудка

Размещено на http://www.allbest.ru/

53

Изучение молекулярных основ предрасположенности к раку желудка

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

РОНЦ-Республиканский Онкологический Центр

EcoRI-Эндонуклеаза (рестриктаза) выделенной из ешериха коли.

ДНК-Дезоксирибонуклеиновая кислота

ПДРФ-Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов

TNM-(Tumor Nodulus Metastasis)Oпухоль Узель Метастазы

H-Pylori-Helicobacter-Pylori

КТ-кишечный тип рака желудка

ДТ-диффузный тип рака желудка

L-(long) короткий

S-(short) длинный

bp-пар нуклеотидов

ПЦР-Полимеразно цепная реакция

TBE-(Tris-boric-Acid)Трис-Борная кислота

TAE-(Tris-Atsetate)Трис-Уксусная кислота

G-гуанин

A-аденин

T-тимин

C-цитозин

ВВЕДЕНИЕ

рак желудок генетический

Актуальность работы. Рак желудка остается одним из наиболее распространенных заболеваний в мире. Ежегодно регистрируется почти 1 млн. новых случаев и более 700 тысяч смертей от этого заболевания. Странами - «лидерами» являются Япония, Россия, Чили, Корея, Китай, Коста-Рика, Филлипины. Странами с низкой заболеваемостью являются США Австралия, Новая Зеландия. В Японии, численность населения которой составляет 169 млн., заболеваемость у мужчин составляет 120,9, а у женщин 33,3 на 100 тыс. населения (3).

Узбекистан является одним из регионов с высоким выявлением случаев рака желудка в Средней Азии. Случаи летального исхода составляют 60 случаев на 100 000 населения, в сравнении с 20 на 100 000 в среднем в мире. По данным РОНЦ МЗ РУз в 2010 год, в структуре онкопатологии в Республике Узбекистан рак желудка составлял 9,5 %, занимая 1-место среди мужчин и 2-место среди женщин.

Цель магистерской диссертационной работы:

· Изучение связи EcoRI полиморфизма L-myc гена и генетической предрасположенности к развитию рака желудка у населения Узбекистана.

Задачи исследования:

1. Выделение и идентификация геномной ДНК образцов крови больных раком желудка и здоровых лиц.

2. Полимеразно-цепная реакция на L-myc ген и детекция пцр-продуктов для отобранных образцов.

3. Проведение изучения полиморфизма путем детекции ПДРФ-фрагментов при помощи рестриктазы EcoRI .

4. Генотипирование и выявление связи между EcoRI полиморфизмом L-myc гена и предрасположенностью к раку желудка по полученным результатам.

Научная новизна настоящей магистерской диссертации является то, что впервые проведено молекулярное исследование гена L-myc при раке желудка в узбекской популяции, создание банка ДНК.

Практическая значимость работы:

Изучение молекулярных основ предрасположенности к раку желудка создаст новые возможности для медико-генетического консультирования и профилактики заболевания.

Структура магистрской диссертации: работа изложена на 64 страницах компьютерного текста, состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, который включает 61 первоисточника. Обсуждение включает 4 таблицы, 17 рисунков.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Эпидемиология рака желудка

Канцерогенез желудка является многоэтапным и мультифакториальным процессом как результат комплексных воздействий между окружающей средой и генетическими факторами(1).

Самым распространенным симптомом рака желудка является расстройство пищеварения. К другим симптомам относятся дискомфорт или ощущение тяжести в верхней части живота после еды с возможными тошнотой и рвотой: утрата аппетита; потеря массы тела и иногда наличие крови в рвотных массах или стуле.

Причины рака желудка можно разделить на несколько видов:

· Алиментарные - связанные с особенностями питания;

· Курение и алкоголь;

· Предшествующие хронические заболевания желудка: язвенная болезнь, эрозивный и атрофический гастриты;

· Генетические факторы.

С другой стороны, было выявлено, что высокий риск к развитию рака желудка у семейных раков желудка(2).

Согласно классификации, принятой Европейским региональным бюро ВОЗ, возраст от 60 до 74 лет считается пожилым, от 75 до 89 -- старческим. Лица 90 лет и старше определены как долгожители. Максимальные показатели заболеваемости раком желудка приходятся на возрастные группы 60--62 года у мужчин и 64--65 лет у женщин. Статистические данные свидетельствуют о том, что больные раком желудка пожилого и старческого возраста составляют почти половину всех заболевших в старшей возрастной группе -- 43,4% [4, 5, 6,7]

Международная классификация рака желудка - TNM

Самая важная классификация рака желудка (как и любой другой злокачественной опухоли) - это классификация TNM. Она разработана Международным противораковым союзом и используется во всем мире. С ее помощью определяется распространенность опухоли по желудку и организму человека и статистический прогноз результата лечения.

Буквы TNM - эта аббревиатура латинских слов: Tumor (опухоль), Nodulus (узел - в данном случае имеются в виду лимфатические узлы), Metastasis (метастазы).

Данная классификация может применяться только для гистологически подтвержденного диагноза рак желудка.

Классификация анатомических областей: кардиальный отдел, дно, тело, антральный и пилорический отделы.

TNM - клиническая классификация состояния опухоли

Т - первичная опухоль:

· Тх - выявление опухоли невозможно из-за недостатка данных;

· Т0 - первичная опухоль не определена;

· Tis - carcinomainsitu или преинвазивная карцинома: определена внутриэпителиальная опухоль при отсутствии поражения собственной пластинки слизистой оболочки;

· Т1 - со стороны опухоли происходит инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки или подслизистой основы;

· Т2 - инфильтрация мышечной или серозной оболочки;

· Т3 - прорастание опухолью серозной оболочки; инвазия в соседние структуры отсутствует;

· Т4 - распространение опухоли на соседние структуры.

N - регионарные лимфатические узлы. К данной категории относят гепатодуоденальные узлы, а также узлы, расположенные вдоль общей печеночной, селезеночной и чревной артерий, а также малой и большой кривизны. Вовлечение других лимфатических узлов внутри брюшины (ретропанкреатические, мезентериальные и парааортальные), классифицируется как отдаленные метастазы:

· Nx - оценка состояния регионарных лимфатических узлов невозможна из-за нехватки данных;

· N0 - признаки метастазов в регионарных лимфатических узлах отсутствуют;

· N1 - в 1-6 лимфатических узлах присутствуют метастазы;

· N2 - 7-15 лимфатических узлах присутствуют метастазы;

· N3 - более 15 лимфатических узлов поражены метастазами.

М - обнаружено наличие отдаленных метастатических поражений:

· Мх - отдаленные метастатические поражения не могут быть определены из-за нехватки данных,

· М0 - признаки отдаленных метастазов отсутствуют;

· M1 - выявлено наличие отдаленных метастазов.(48)

Как и при многих других видах рака, исход и эффективность лечения рака желудка в настоящее время зависит от стадии заболевания. В различных исследованиях была показана значительная взаимосвязь между заболеваниями желудка и предраковых состояний с H.pylori инфицированностью. Так, в странах высокой заболеваемостью раком желудка инфицированность H.pylori намного выше, чем в группах с низкой заболеваемостью им. Частота инфицирования в развитых странах составляет около 15 % населения, в менее развитых странах - до 100 % . В тех популяциях, где снизилась зараженность H. pylori, также снизился показатель заболеваемости раком желудка. (49). Относительный риск заболевания у лиц, которые вскармливались грудью матери менее года, в 3-4 раза выше, чем у лиц, вскармливающихся более года, что возможно, обусловлено снижением защитной функции слизистой желудка из-за недостатка иммуноглобулина А и более ранним инфицированием H. pylori.(50)

К предраковым заболеваниям желудка относятся: аденоматозные полипы, хронический гастрит. (51) В то же время предполагается некоторая генетическая предрасположенность хозяина к развитию рака желудка и двенадцатиперстной кишки. (8, 9, 10)

1.2 Генетические полиморфизмы и рак желудка

В исследованиях последних лет показано, что генетический полиморфизм хозяина ассоциирован с воспалительными процессами, метаболизмом канцерогенов, антиоксидантной защитой и регуляцией клеточной пролиферации.

Полиморфизмы генов вовлеченных в развитие этих процессов были исследованы в качестве биомаркеров предрасположенности к раку желудка (РЖ). Однако описанные данные являются относительно противоречивыми. (11, 12, 13)

По классификации Лаурену (The Lauren Classification of Gastric Cancer) различают два типа рака желудка - кишечный (КТ) и диффузный (ДТ). КТ начинается с хронического гастрита с кишечными метаплазиями, структурально подходит к раку кишечнику и встречается у людей пожилого возраста, у мужчин. ДТ развивается только в желудке, у молодых лиц, особенно у женщин(14).

Также было демонстрировано, что генетические механизмы, приводящие к диффузному и кишечному типу рака желудка отличаются друг от друга(15).

L-myc ген EcoRI полиморфизм

В результате мета-анализа было выявлено широко изученный генетический полиморфизм EcoRI гена L-myc (16).

Семейство генов myc человека объединяет шесть генов: c-myc, N-myc, L-myc, S-myc, B-myc и P-myc. Известно, что активация генов c-myc, Nmyc или L-myc приводит к злокачественному перерождению клеток.(52). Гены семейства myc, кодирующие транскрипционные факторы MYC, рассматриваются как перспективные терапевтические мишени, поскольку их повышенная экспрессия наблюдается во многих типах опухолей человека, и имеются данные, что она напрямую связана с активацией пролиферации клеток и их злокачественной трансформацией. (53) Гиперэкспрессия гена c-myc наблюдается в таких опухолях, как миеломы, лимфомы, карциномы, нейробластомы, повышенный уровень мРНК гена L-myc выявляется при раке. Протоонкогены семейство Myc участвуют в развитие рака. Транскрипционные факторы семейства MYC находятся в начале каскада сигнальных событий, приводящих к злокачественному перерождению клетки. Ингибирование экспрессии MYC регулируемых генов, также обладающих трансформирующей активностью, будет в меньшей степени влиять на развитие опухоли, чем ингибирование экспрессии самого myc.(54)

Постоянная экспрессия myc наблюдается только в делящихся клетках, которые составляют меньшую часть клеточной популяции в большинстве органов. Еще одним подходом, направленным на ингибирование онкогенной функции MYC, является использование агентов, вызывающих нарушение образования комплекса MYC/MAX.(55) Впервые Nau и другие определили L-myc ген, который имеет аналогичную структуру с C-myc и N-myc гены из клеточной линии рака легких человека(17). Kaye и др. изучили всю нуклеотидную последовательность L-myc гена (18).

Ген L-myc, который активируется в конце малигнизации, был обнаружен в 1- хромосоме человека. В этом полиморфизме произошла трансверсия - место Гуанина вставился Тимин (G/T) в 3109 нуклеотиде (19).



Рисунок.1 Homo sapiens (human) genome view

Рисунок.2. Хромосома 1p34.2.- L-myc GGGGCTAGGGGCTGGGTAAGACAGAA[G/T]TCCAAACACAGCGTAATCAGCCAAT

Рисунок.3. Одно нуклеотидная замена G на Т на втором интроне гена L-myc rs3134613 [Homo sapiens]

Протоонкогены, являясь нормальными клеточными генами, обладают высокой эволюционной консервативностью, что указывает на их участие в жизненно важных клеточных функциях. Полученный к настоящему времени обширный экспериментальный материал говорит о том, что протоонкогены образуют позитивную систему контроля роста, деления и дифференцировки клеток.

L-myc ген имеет 2-х аллельный полиморфизм, rs3134613,L/S, выявляющий после расщепления с помощью рестрикционного фермента EcoRI с сайтом узнавания gAATTC 3109 - нуклеотидной позиции второго интрона этого гена. (20,21,22)

На рисунки № 4. показана схематическая структура гена L-myc. EcoRI полиморфизм находится на втором интроне.

L-myc - это обычный ген, который может стать онкогеном в последствий мутаций или повышения экспрессии. Многие протоонкогены кодируют белки, которые регулируют клеточный рост и дифференцировку. Примерами продуктов протоонкогенов являются белки, вовлеченных в сигнальные пути-- белок Myc, а также белки WNT, RAS, ERK и TRK. L-myc - ген- регулятор клеточного цикла

Myc (L-Myc) -- кодирует белок, связывающийся с ДНК и являющийся фактором транскрипции. Продукт гена Myc регулирует экспрессию до 15 % всех генов, связывается черезэнхансерные последовательности (E-boxes) и усиливает активность ацетилтрансфераз гистонов. Мутантные версии гена

Myc обнаружены во многих опухолях, при этом ген экспрессируется постоянно, что приводит к нарушению регуляции многих генов, в том числе, отвечающих за пролиферацию клеток.



Рисунок 4



Рисунок 5. Обзор про-апоптотических путей передачи сигнала.

Превращение клеточных протоонкогенов в онкогены может происходить в результате: мутаций кодирующей последовательности протоонкогена, что приведет к образованию измененного белкового продукта, или (и) в результате повышения уровня экспрессии прото-онкогена, вследствие чего в клетке увеличивается количество белка.

Литературный анализ показывает, что больные с гомозиготой SS или гетерозиготой LS генотипами имели высокую частоту местастазов и плохого диагноза опухоли.(23)

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сбор образцов крови пациентов с доказанным диагнозом рака желудка 30(16 мужчин, 14 женщин, возраст: от 28 до 82 , средний возраст: 55) образцов был осуществлен из абдоминального отделения Ташкентского Областного Онкологического Диспансера в период 2010-2011 гг. Отбор пациентов осуществлялся на основе поставленного в клинике диагноза и с согласия пробанда.

Контрольную группу составили 30 здоровых людей (13 мужчин, 17 женщин, возраст: от 19 до 57, средний возраст: 38), у которых не было случаев рака желудка. Венозная кровь в количестве 1мл отбирался в 0,1мл раствора цитрата натрия (антикоагулянт) и храниться в -20°C.

Таблица 1.Список больных

№	№ ТООД	ФИО	пол	возраст	TNM	Генотипирование
1	8	Эшманов Р.	муж	82	T3 N2 M1	LS
2	1	Миразимов Мурат	муж	62	T3 N2 M0	LS
3	3	Хакимова Шафоат	жен	66	T3 N2 M0	LS
4	4	Холматов Тулан	муж	60	T3 N2 M1	SS
5	5	Абдуллаев Тохир	муж	53	T3 Nx M1	LS
6	6	Тожикулов Туйчибек	муж	54	T3 N2 M0	LL
7	7	Юсупов Талъат	муж	74	T3 N2 M0	LS
8	10	Ахмедов Икромхон	муж	66	T2 N2 M0	LS
9	11	Эгамбердиев Тохир	муж	61	T2 N1 M0	LS
10	2	Юсупалиева Яхшигуль	жен	54	T3 N1 M0	LL
11	4	Хушвактова Тухтагуль	жен	46	T4 N2 M1	SS
12	1	Искалова Зухра	жен	43	T3 N2 M0	LS
13	2	Абдусаматова Динара	жен	28	T3 N2 M1	LS
14	1	Хасанова Умида Э.	жен	29	T4 N2 M1	LS
15	5	Хайдарова Махбуба	жен	69	T4 N2 M1	LS
16	9	Раимов Валиджон Т.	муж	41	T3 N2 M0	SS
17	11	Мухаммадиева Дилором	жен	48	T4 N2 M0	LS
18	12	Солиев Ганижон Р.	муж	51	полипоз	SS
19	3	Жураев Эркин	муж	70	T4 N2 M1	LL
20	5	Баубеков Хамиджон М.	муж	62	?	SS
21	6	Ахмедов Фархад Х.	муж	34	T4 N2 M1	LS
22	3	Холбаев Гуломиддин	муж	56	T2 N2 M0	LS
23	4	Атакулова Камола	жен	38	T3 N2 M1	LL
24	1	Юсупов Аликул Солиевич	муж	53		LL
	рус
1	2	Денисова НинаВ	жен	75	T3 N2 M1	LL
2	3	Семенова Надежда	жен	70	T3 N2 M1	LS
	корейс
1	9	Ли Мария	жен	74	T4 N1 M0	SS
2	1	Шегай Зинаида	жен	54	полип	LL
	татар
1	2	Ягьяев Талят	муж	63	T2 N2 M0	LL
	казах
1	2	Акбердиева Малу	жен	49	T4 N2 M0	SS

Таблица 2Контрольная группа

№	№ пробирки	ФИО	пол	возраст	диагноз	Генотипирование
1	1	Убайдуллаева Мухаббат Искандаровна	женс	31	здоров	LL
2	2	Шеримбетов Санжар	мужс	29	здоров	LS
3	3	Ибрагимов Зафар	мужс	27	здоров	LS
4	4	Мухамедов Рустам Султанович	мужс	57	здоров	LL
5	6	Адылов Бахтиёр	мужс	34	здоров	LS
6	7	Якубов Миракбар	мужс	40	здоров	LL
7	9	Далимова Дилбар Акбаровна	женс	37	здоров	LL
8	15	Ибрагимов Кахрамон	мужс	28	здоров	LS
9	16	Ахмедов Баходир	мужс	23	здоров	LS
10	18	Муминова Шахло	женс	23	здоров	LL
11	20	Мирхайдарова Малика Дамировна	женс	29	здоров	LS
12	21	Турдикулова Шахло Уткуровна	женс	37	здоров	LL
13	22	Абдурахимов Аброр	мужс	34	здоров	SS
14	25	Отаева Зарина	женс	26	здоров	SS
15	26	Нурматова Саида	женс	23	здоров	SS
16	28	Адилов Бегзод	мужс	25	здоров	LS
17	29	Урманова Гулноза	женс	22	здоров	SS
18	31	Ибрагимов Аваз	мужс	21	здоров	LS
19	32	Рустамова Шохиста	женс	22	здоров	LS
20	33	Артикходжаева Дурдона	женс	28	здоров	LL
21	34	Назарова Матлюба	женс	19	здоров	LS
22	35	Исломов Анвар	мужс	24	здоров	LS
23	36	Кадырова Роза	женс	25	здоров	LS
24	37	Юнусова Наргиза	женс	25	здоров	LS
1	23	Давлетчурин Дамир	мужс	26	здоров	SS
2	10	Бурнашева Амина	женс	28	здоров	LL
3	14	Нишанова Севара	женс	33	здоров	LS
1	11	Ким Дина	женс	27	здоров	SS
2	12	Ким Алексей	мужс	33	здоров	SS
1	24	Хужабекова Гулноза	женс	24	здоров	LS

2.1 Метод выделения ДНК

Выделение ДНК проводилась с использованием сухого набора реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (Москва)

Характеристика набора

1. ДНК, выделенная из свежего биологического материала (цельной крови, клеточной культуры, гомогената ткани и т.д.), является высокомолекулярной, 40-50 тысяче нуклеотидных пар.

2. Набор реагентов обеспечивает высокую чистоту выделенной ДНК OD (оптическая единица) 2601280 нм 1,6-2,0.

3. Выход чистой ДНК из цельной крови составляет 5-10 мкг из 200 мкл крови.

Выделение ДНК был осуществлен по протоколу выделения ДНК:

1. Приготовили рабочий раствор Солевого буфера. Содержимое флакона с 10-кратным Солевым буфером-10мл, перенесли в мерный цилиндр, довели бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96% этиловым спиртом до метки 300 мл и перемешали. Готовый рабочий раствор

Солевого буфера хранили в герметично закрытой посуде при температуре 4° С.

2. В пробирку объемом 1,5 мл внесли 200 мкл исследуемой пробы, добавили 800 мкл Лизирующего реагента и перемешали содержимое пробирки переворачиванием (10 раз).

3. Термостатировали пробирку со смесью 7 мин. при температуре 65°С. Если выделение ДНК проводится из твердого сухого мелкоизмельченного материала, то следует термостатировать 30-40 мин.

4. В пробирку с чистой смесью добавили 20 мкл суспензии сорбента NucleoS™ (40 мкл, если выделение ДНК проводится из цельной крови или другой богатой ДНК жидкости). Перед использованием NucleoS™ интенсивно перемешивали до гомогенной суспензии на вортексе.

5. Пробирку поместили на ротатор и перемешивали 10 мин (10 об/мин)

6. Центрифугировали 10 секунд при 5000 оборотов в минуту.

7. Осторожно, не задевая осадок, удаляли супернатант.

8. К осадку добавили 400 мкл Лизирующего реагента, тщательно перемешивали на вортексе до полного гомогенного состояния.

9. Добавили в пробирку 1 мл рабочего раствора Солевого буфера (см. пункт 1).

10. Перемешивали содержимое пробирки переворачиванием пробирки 10 раз.

11. Центрифугировали 10 секунд при 5000 об/мин.

12. Осторожно удаляли супернатант, не задевая осадок.

13. Добавили в пробирку 1 мл Солевого буфера, перемешивали содержимое пробирки на вортексе, центрифугировали 10 секунд при 5000 об/мин., осторожно удаляли супернатант, не задевая осадок.

14. Повторяли положение 13.

15. Посушили осадок при температуре 65°C в течение 4 мин.

16. В эту же пробирку внесли 200 мкл ЭкстраГенаЕ™. ЭкстраГенЕ™ отбирали от общего объема при постоянном перемешивании!

17. Суспендировали содержимое пробирки на вортексе 10 сек до получения гомогенной суспензии, затем термостатировали 5 мин при 65°С.

18. Еще раз суспендировали содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием.

19. Центрифугировали 1 минут при 10000 об. в мин.

20. Перенесли супернатант с ДНК в чистую пронумерованную пробирку. ДНК храниться при температуре -20°С.

Для детекций выделенных геномных ДНК использовали 0,9%-агарозный Гель-Электрофорез.

2.2 Метод полимеразно-цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) - высокая чувствительность и специфичность - изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис. В настоящее время ПЦР-диагностика является, пожалуй, самым точным и чувствительным методом диагностики инфекционных заболеваний.
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК достаточные для визуальной детекции. Можно сказать, что метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, повторяющуюся много раз и столько, сколько это необходимо для исследования. Метод включает несколько этапов. Сначала происходит расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных "стартовых блоках" - коротких двунитевых участках. Для проведения такого процесса используют две генетические пробы - праймеры, которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК.

Праймер (англ. primer) -- это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), комплементарный ДНК или РНК мишени, служит затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразой, а также при репликации ДНК. Затравка необходима ДНК-полимеразам для инициации синтеза новой цепи, с 3'-конца (гидроксильной группы) праймера. ДНК-полимераза последовательно добавляет к 3'-концу праймера нуклеотиды, комплементарные матричной цепи (18).

Для амплификации гена L-myc использовались следующие праймеры (Синтол, Россия) (16).

Праймер форвард:

Праймер реверс:

Следующая стадия заключается в удлинении новой цепочки ДНК посредством присоединения имеющихся в реакционной смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Процесс удлинение начинается от праймеров и осуществляется при помощи фермента - ДНК-полимеразы при температуры 72⁰С (специфический бактериальный фермент - Taq-полимераза, устойчивая к высоким температурам). Полимераза осуществляет синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей после нового прогрева. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Процедура ПЦР включает несколько высокотемпературных этапов, поэтому используются термостабильные ДНК-полимеразы. В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса - синтез цепей ДНК.

Расчет рабочих концентраций праймеров

Поставка ПЦР- праймеров производителем осуществляется в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) в лиофилизированном виде. Для расчета рабочих концентраций праймеров ОЕ перевели в мкмоль. Определили концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ олигонуклеотида соответствует концентрации 33 мкг/мл.

Для праймера, имеющего длину n пар нуклеотидов (п.н.), поставляемого в количестве (ОЕ), пересчет осуществлялся по этой формуле:

X=MW/10/(ОЕ)Ч33;

Приготовление рабочего раствора праймеров L-myc

Рабочий раствор (10 мкМолярный) праймеров L-myc из лиофильного стока-праймера приготавливали по следующему расчету:

50 мкл сток + 450 мкл ddH₂O

Протокол проведение ПЦР-реакции с использованием сухого набора реагентов GenePak™ PCR Core (производство ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия)

1. Перед проведением реакции вынули из холодильника нужное количество пробирок МастерМикса;

2. Промаркировали соответствующим образом необходимое количество пробирок Мастер-Микса: (+), (-) контроли и исследуемые пробы;

3. Добавили во все пробирки по 5 мкл смеси праймеров.

4. Добавили во все пробирки, включая и контроли, по 10 мкл ПЦР растворителя.

5. Добавили в соответствующие пробирки МастерМикса по 5 мкл исследуемой ДНК. В качестве (-) контроля следует использовать бидистилл. воду.

6. Перенесли пробирки в термоблок программируемого термостата и запустили соответствующую программу амплификации.

7. После окончания амплификации все пробирки перенесли в комнату для проведения электрофореза (детекции) ДНК.

8. 5-10 мкл ПЦР продукта использовать для анализа гель-электрофорезом без дополнительного разбавления краской для нанесения.

ПЦР амплификация проводилась следующими условиями:

Начальная денатурация 94єС - 5 мин: основная денатурация 94єС -20 сек, отжиг 60єС - 40 сек, элонгация 72єС 40 сек, финальная элонгация 72єС - 8 мин, общий цикл ПЦР - 30 цикл, на ПЦР-термоцикле.



Рисунок.6 Схема ПЦР амплификаци

2.3 Метод ПДРФ

Для определения генетического дефекта нужно знать, какой из генов затронут и где расположен этот ген. Мощным инструментом для определения пораженных генов и скрининга популяции людей на наличие измененного гена считается анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). ферменты, названные эндонуклеазами рестрикции, разрезают ДНК по специфичным последовательностям -- сайтам рестрикции. Две молекулы ДНК будут разрезаны на фрагменты одинаковой длины, если молекулы идентичны. Но если в одной молекуле есть сайт рестрикции, а другой нет, то фрагменты будут различной длины. Если в одной молекуле будет больше пар оснований до сайта рестрикции, чем в другой, то фрагменты также будут различными и т.д.

На практике это означает, что, разрезая эндонуклеазами рестрикции часть генома двух индивидуумов одного вида, можно получить фрагменты различной длины, в зависимости от строения проверяемой части генома индивидуума. Это также значит, что при сравнении гомологичных районов обеих хромосом пары можно получить фрагменты различной длины. Такая картина наблюдается, если в хромосоме есть делеция, или где-нибудь между сайтами рестрикции существует инсерция -- мутация, убирающая сам сайт рестрикции, а также если аллели генов различны между сайтами рестрикции. Как только расположение гена установлено, его можно клонировать, определить природу дефекта, вызывающего генетическую болезнь, разработать новые методы лечения.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, Restriction fragment length polymorphism, RFLP) -- это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза).

При использовании данного исследования получаются различные результаты от различных образцов, и при помощи ПДРФ можно идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК, в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. В виду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения. Анализ разнообразия ПДРФ является важным инструментом в картировании генома, локализации генов, ответственных за генетические заболевания, определения риска заболевания, получения генетических отпечатков(genetic fingerprinting) и определения родства.

В настоящее время известно более 500 типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соответствующими первым трем буквам латинского названия вида бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии открытия этого фермента у данного вида. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают три класса рестриктаз: часто-, средне- и редкощепящие.

РЕСТРИКТАЗЫ (эндодезоксирибонуклеазы рестрикции), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических (бактерии и сине-зеленые водоросли) и некоторых др. организмах и выполняющие тем самым "иммунную" функцию.

Распознавание чужеродной ДНК осуществляется в специфических нуклеотидных последовательностях (сайтах), которые в собственной ДНК клетки "отмечены" благодаря модификации (чаще всего метилированию) спец. ферментами (напр., метилазами); иногда такой модифицирующей активностью обладают и сами Р.

По принятой номенклатуре Р. обычно обозначают сокращенным назв. их продуцента, в котором первая буква-начальная буква название . рода, две следующие-начальные буквы назв. вида и последующие - обозначение штамма и номера выделенной из него Р., напр.: HindIII--третья Р. из Наето-philus influenzae d.

Р. подразделяют на 3 класса. К первому классу принадлежат ферменты (напр., ЕсоК из Escherichia coli К12), узнающие специфические. последовательность сайта, но разрывающие нить ДНК в произвольной точке (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимод. с удаленной областью ДНК или передвигается вдоль нити ДНК). Ко второму классу принадлежат ферменты (напр., EcoRI), расщепляющие ДНК в строго определенной точке но отношению к сайту узнавания. К третьему классу относят ферменты промежуточного. типа (напр., EcoPI), разрывающие нить ДНК в несколько. точках на разном удалении от сайта узнавания.

Наиболее значение имеют Р. второго класса, широко применяемые в генетической инженерии и при установлении структуры ДНК. Эти ферменты (мол. масса, рН оптим. каталитич. активности и рI значительно варьируют в зависимости от источника) расщепляют обе нити ДНК. При этом разрыв осуществляет иногда одна молекула Р. в обеих нитях, иногда-две молекулы фермента (каждая атакует лишь одну нить, как, напр., EcoRI). В большинстве случаев 3, 5-фосфодиэфирные связи в ДНК расщепляются с образованием 5-фосфатов на месте разрыва молекулы (см. Нуклеиновые кислоты ), лишь немногие Р. (напр., Nсil) образуют фрагменты с 3-фосфатными группами. Все Р. второго класса-Mg²⁺-зависимые ферменты. Для некоторых Р. (напр., EcoRI) установлена первичная структура.

Расщепление ДНК происходит обычно в пределах сайта узнавания, редко-на определенном расстоянии от него. При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5- или З-концами (см. рис.). Р. с одинаковыми сайтами узнавания наз. изошизомерами.

Схема расщепления ДНК разными рестриктазами: А, С, G и Т-соотв. дезок-сиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин; N-любой дезоксинуклеозид, ферменты; 1-HalIII, 2-EcoI, 3-BglI, 4-HgaI.

Применение Р. второго класса позволяет вырезать из ДНК определенные фрагменты, а также встраивать их в заданные места векторных молекул ДНК, т. е. направленно конструировать молекулы с новой генетич. информацией. (56)

Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная масса, а значит, и физическое расстояние между сайтами.

Для проведения ПДРФ использовали рестрикционный фермент - EcoRI (FERMENTAS INTERNATIONAL INC) (16).

Концентрация EcoRI - 5000 u (10 u/µl), сайт узнавания этого фермента

Состав рестрикционной смеси:

1) ddH₂O - 8 мкл;

2) 10хBuffer - 1,5 мкл;

3) EcoRI - 0,5 мкл;

Все компоненты осторожно перемешивали и добавляли в каждую пробирку (0,1 мкл) по 10 мкл рестрикционной смеси и 5 мкл ПЦР-продукта, рестрикционный анализ проводился в термостате (Bio-Rad, Китай) при +37єC в течении 16 часов. Полученные фрагменты разделялись с помощью 3%-агарозной геля-электрофореза с этидиум бромидом.

Рисунок 7. Анализ L-myc полиморфизма. Маркер-ДНК молекулярный вес маркера VIII (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) (19).

2.4 Метод Геля-Электрофореза

Электрофорез ДНК, ПЦР-продукта, Рестрикционных фрагментов -- это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Скорость движения молекулы в поле единичной напражённости называется электрофоретической подвижностью и является важной харктеристикой вещества. При двежение молекулы в электрическом поле её подвижность зависит от заряда, силы сопротивление среды и характера растворителя, который сам, чаще всего, является электролитом. В этих условиях вокруг макромолекулы образует ионная атмосфера. Благодаря механической прочности и достаточно большому размеру пор агарозные гели нашли широкие применение при разделение крупных макромолекул, таких как ДНК. Варьируя концентрацию агарозы, можно менять средний размерпор в геле.(57)Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.

Разделение ДНК в агарозных гелях чаще всего проводят в буферах, приготовленных на основе Трис-Уксусная кислта_ЭДТА(Tris-Acetate-EDTA, или ТАЕ) или Трис-Борная кислота-ЭДТА(Tris Boric Acid-EDTA, или ТВЕ) с рабочим диапозоном рН в интервале 7.0:9.2 Трис это краткое название соединения трис-(оксиметил)-аминометан.(trishydroxymethylaminomethane, или 2-амино 2-гидроксиметил-1.3-пропандиол-С₄ Н₁₁ N O₃ ). Оно представляет собой молекулу метана, в которой три атома водорода замещены на три остатка метанола (-СН₂ОН), а четвертый - на амино (-NН₂) группу: NН₂С(СН₂ОН)₃. В растворе трис принимает протонированную форму. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.

По сравнению с ТВЕ, в буфере ТАЕ линейная ДНК обладает большой подвижностью, а суперспиральная форма несколько лучше разделяется. Однако по своей буферной ёмкости ТАЕ значительно уступает ТВЕ, и по этой причине ТАЕ не годится для длительных форезов и эксперементов, требующих высоких напряжений.

После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.

Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

Принцип гель-электрофореза

Нуклеиновые кислоты имеют суммарный отрицательный заряд. Под действием электрического поля отрицательно заряженные молекулы ДНК двигаются в геле в сторону положительного заряда, при этом более короткие молекулы ДНК двигаются быстрее больших молекул, таким образом они распределяются в геле в соответствии с молекулярным весом.

Химический состав агарозы - D-galactose 3,6-anhydro L-galactose.

Постановка гель-электрофореза

1.Приготовляли агарозный гель в % по ниже приведенному протоколу.

2. Добавили 0,5хТBE буфера и нагревали до полного растворения.Добавляли по 5 мкл Этидиум Бромида. При добавление этидиум бромида в гель происходит связывание с нуклеиновыми кислотами с образованием низкомолекулярного соединения.

3.Агарозный раствор переливали в специальную форму, где при охлаждении происходило застывание геля.

4. После полимеризации геля вынимали и опускали в камеру с 0,5xTBE буфером.

5. Гребенок осторожно вынимали. Образовывались лунки для нанесения образца.

6.Перемещивали по 5 мкл краски (бромфенолсиний+глицерин) и 5 мкл ДНК, ПЦР-продукта, Рестрикционного фрагмента и начиная с 2-лунки нанесли их в лунки геля.

7. Для детекции ПЦР-продуктов и Рестрикционных фрагментов использовали Маркер - 100 bp DNA Ladder RTU(Ready to Use) (GeneDireX, Тайвань). Наносили маркер в 1-ю лунку.

8.Закрывали крышку камеры, прогоняли образцов 30-45 минут под действием электрического тока 120Вольт, 70 ампер.

Визуализация результатов гель-электрофореза

Под действием ультрафиолетового света, этидиум бромид связанный с нуклеиновой кислотой обладает способностью к свечению. Используя “Гель-документирующую систему” визуализируется и фотодокументируется гель. Мы использовали современную систему гель документирования. (Bio-Rad, Китай).



Рисунок.8

Приготовление растворов

1. Цитрат натрия (3,8%) антикоагулянт для образцов крови при транспортировке

3,8 гр - Цитрата натрия

100 мл - дис. воды

Перемешать на вортексе. Хранить при +4°С.

2. 0.9% агароза для детекции ДНК образцов

0,9 гр - Агарозы

100 мл - 0.5x TBE буфер

Растопить в микроволновой печи. Добавить 7мкл раствора Этидиума Бромида (1мг\мл). Хранить при комнатной температуре.

3. 10xTBE буфер (1 л)

121 гр - Трис

55 гр - Борная кислота

7,55 гр - ЭДТА

Растворить в небольшом объеме дис. воды (около 500мл) при помощи магнитной мешалки и довести дис. водой до отметки 1л. Хранить при комнатной температуре.

4. 5xTBE буфер (100 мл)

5 мл - 10xTBE буфер

95 мл - ddH₂O

Перемещать при помощи магнитной мешалки. Хранить при комнатной температуре.

5. 2% агароза для детекции ПЦР-продуукта

2 гр - Агарозы

100 мл - 0.5xTBE

Растопить в микроволновой печи. Добавить 7мкл раствора Этидиума

Бромида (1мг\мл). Хранить при комнатной температуре.

6. 3% агароза для детекции ПДРФ-продукта

3 гр - Агарозы

100 мл - 0.5xTBE

Растопить в микроволновой печи. Добавить 7мкл раствора Этидиума

Бромида (1мг\мл). Хранить при комнатной температуре.

7. Краситель для нанесения проб в гель - Бромфенол Синий и Ксиленцианол

2,5 гр - Бромфенол Синий

2,5 гр - Ксиленцианол

10 мл - 30% глицерина

Перемешать на вортексе. Хранить при -20°С.

8. Этидиум Бромид (1мгр\мл)

1 мг - Этидиума Бромида

1 мл - дис. воды

Перемешать на вортексе. Хранить при комнатной температуре.

2.5 Статистическая обработка полученных результатов

Оценку погрешностей экспериментальных данных проводили, определяя среднее квадратичное отклонение m по формуле:

где - средняя квадратичная ошибка;

n - число измерений;

- отклонение от среднего.

Конечный результат выражали как M ± m, где М - средняя величина.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Генотипирование образцов по гену L-myc

Генетические и иммунологические маркеры являются важными инструментами для выявления предрасположенности к опухоли и определению группы риска развития рака.

Известно, что прото-онкогены семейства Myc участвуют в развитии многих типов опухолей. Некоторые исследования дали связь между полиморфизмом EcoRI и предрасположенности к разным неоплазмам, такие как, рак молочной железы и рак пищевода и саркома костной ткани. Но не была обнаружена корреляция между раком мочевого пузыря, рак почек и других органов.(58)

Достоверная связь было выявлено в пациентах рака желудка Турции и Японии, тогда как в Европейской и Российской популяции отсутствовала эта ассоциация с полиморфизмом EcoRI L-myc гена.(59)

Причина того, как интроник полиморфизм этого гена может воздействовать развитию раковых клеток, пока еще не известно. Потому что вовремя сплайсинга происходит вырезания интронов ДНК - некодирующих генов и сшиваются только экзоны - белок кодирующие гены. Само по себе после сплайсинга исчезает интроны и все полиморфизмы внутри этих интронов. Как некодирующий полиморфизм внутри интрона L-myc гена, локус не приводит к перестройке белка L-myc гена; зато это может привести к генетической предрасположенности к раку желудка диффузного типа через следующие механизмы: (1) прекращения регуляции экспрессии белка L-myc, этот процесс может привести к существенным изменениям структуру хроматина (Knoepfler и др., 2006), (2) модуляция транскрипцию генов-мищени способствует к неустойчивости хромосомы (Eilers и Eisenman, 2008); (3) другие близрасположенные полиморфизмы находящиеся в неравновесном сцеплении с rs3134613 могут иметь функциональную роль(Spinola и др., 2001, 2007).

В наших экспериментах пцр-продукт весом 613 bp, имеющий EcoRI полиморфичный сайт гена L-myc был амплифицирован с помощью метода полимеразной цепной реакции. L аллель не имел рестрикционного сайта, а внутри S аллеля находится 1 рестрикционный сайт.

В результате проведенных исследований выяснено то, что при помощи праймеров 2-го интрона выяснено наличие в геномная ДНК человека наличие именно L-myc гена, имеющего полиморфизм к EcoRI и проведена амплификация этих участков. Полученные пцр-продукты L-myc гена были подвергнуты рестрикции. В результате рестрикции при наличии сайтов рестрикции фрагмент поделён на 2 фрагмента, при его отсутствии наблюдался один фрагмент.

Рисунок 3.1.1. ПЦР-продукты из образцов больных раком желудка.

Рисунок 3.1.2. Контроль-ПЦР продукт.



Рисунок3.1.3. Контроль-ПЦР продукт.

После обработки рестрикционного энзима EcoRI, были получены три генотипа: L/L - гомозигота, фрагмент весом 613 bp,; L/S - гетерозигота, продуцирующий 613-, 481- и 132-bp фрагментов; и S/S - гомозигота мутант, с 481- и 132-bp фрагментами (рисунок. Анализ L-myc полиморфизма. Маркер-ДНК молекулярный вес маркера VIII (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) .

Предыдущих научных исследованиях была выявлена ассоциация полиморфизма rs3134613 с клинико-патологическими признаками в разных опухолей, например, раках легких, почки и колоректального рака. Тогда как другие исследования не обнаруживали значительную связь в тех же типов рака (60)

Основная функция продуктов MYC - это ингибирование клеточную завершающую дифференциацию и активизировать пролиферацию (61)

В исследованиях Chen и др. (2010) предполагали, что в раке желудке, S аллель может иметь сильное воздействие на ингибирующую функцию, чем G аллель.

Возможно, что белок L-myc вовлечен в ткано-специфик регуляции клеточного роста и изменения в экспрессии этого белка могут участвовать формировании опухоля. Также, вероятно, что L-myc онкоген непосредственно включает себя. Как основной транскрипт, L-myc ген часто участвует в процессах много численных созревших мРНК, которые могут, кодировать в структурно - индивидуальных белков. (18)

Dlugosza и др. (2002) изучали связь L-myc полиморфизма с предрасположенностью и развитию к раку желудка. Не было обнаружено различие в распределении генотипов L-myc между больной и контрольной группе, и сделали вывод, что присутствие S аллеля в гене L-myc не является фактором риска развития рак желудка у больных раком желудка Европейской. (23)

В контрасте с результатами Dlugosz и др., L-myc локус является ассоциированным с генетической склонности к раку желудка у Японской популяции. (20)

В других исследованиях, этническое отличие в частотах L-myc генотипов было обнаружено между Китайской и Афро-Американской популяции: Афро-Американская популяция имела высокую частоту S аллеля. (37, 44).

Однако, в мета-анализе Crossen и др., частота аллелей были сходными среди Норвежских, Японских, Индийских, Америка-Европейских, Английско-Европейских и гериатрических Австралийских пациентах Европейского происхождения, но различались от Афро-Американских пациентов. (45)

Возможное объяснение этих конфликтующих результатов - или факторы окружающей среды, или этническое происхождение изученных пациентов.

Young и др. обнаружили пониженную частоту L аллеля у старых пациентов. Пока SS генотип может показать предрасположенность к развитию рака, таким образом, объясняя значительную разницу между старыми больными рака и молодыми здоровыми лицами, существует и другое объяснение, что L аллель может провоцировать раннюю смерть, возможно ожидаемый от сердечных заболеваний. (46)

Такие тенденции были обнаружены в полиморфизме 5,10-метилентетрагидрофолат редуктаз (MTHFR) гена C677T у пациентов с инфарктом миокарда. Генотип ТТ этого полиморфизма был возможно исключен из популяции, потому что был ассоциирован с смертельным исходом от инфаркта миокарда. (47)

В контрасты с результатами Shibuta и др.(1998), в нашем исследовании не было выявлено достоверная корреляция между L-myc EcoRI полиморфизмом и предрасположенностью к раку желудка у популяции Узбекистана. Хотя узбекская популяция относится к Азиатскому происхождению. Эти противоречивые результаты могут быть причиной из-за этнического разнообразия, количеством образцов, или разновидности методов исследования.



Рисунок 3.2.1. Образцы РЖ. Рестрикционные фрагменты.

Рисунок 3.2.2. Образцы РЖ. Рестрикционные фрагменты.

Рисунок 3.2.3. Образцы РЖ. Рестрикционные фрагменты.



Рисунок 3.2.4. Контроль-рестрикционныефрагменты

Рисунок 3.2.5. Контроль-рестрикционныефрагменты



Рисунок 3.2.6. Контроль-рестрикционныефрагменты

Таблица 3.1.Частоты генотипов больной и здоровой группы показаны

	N	Распределение генотипов
		SS	LS	LL
Больная группа	30	7(23.3%)	15(50%)	8(26.7%)
Здоровая группа	30	7(23.3%)	15(50%)	8(26.7%)

Таблица 3.2. Частоты генотипов и аллелей rs3134613 группы больных раком желудка и здоровых

	Количество L myc аллели
	L	S	P
Больная группа	31	29	-
Здоровая группа	31	29	-

Связь между S аллелем гена L-myc и раком желудка

Ассоциация полиморфизма rs3134613 гена L-myc с развитием рака желудка

В работе 30 больных раком желудка и 30 здоровых лица были генотипированы по rs3134613 полиморфизму, как видно из Таблиц 1 и 2. Распределение генотипов в группе больных: LL - 26,6%, LS - 50%, SS - 23,3% и контрольной группе: LL - 26,7%, LS - 50%, SS - 23,3%. Сравнения случаев и контроли показывает, что значительной разницы в распределении генотипов и частоты аллелей rs3134613 не выявлено (p>0.05).

Ассоциация полиморфизма rs3134613 L-myc гена с клинико-патологическими данными рака желудка

Пациенты, болевшие раком желудка, были подразделены на группы основными клинико-патологическими признаками - гистология, стадия и место расположения, плюс возраст и пол пациентов. Анализы Пирсон чІ- теста показали, что между генотипами и клиническими показателями, такие как расположения и величина рака желудка не имеется значительная статистически достоверная связь (все p>0.05).

Далее пациенты были классифицированы на два генотипа: `LS + SS тип' и `LL тип'. Здесь результаты анализов показали незначительную связь между S аллелем (LS+SS) и метастазами лимфа узлов (P > 0.05).

ВЫВОДЫ

1. Проведено молекулярно-генетическое исследование EcoRI полиморфизма во втором интроне прото-онкогена L-myc среди 30 пробандов с раком желудка и 30 здоровых пробандов узбекской популяции.

2. Проведено генотипирование по следующим генотипам: LL, LS, SS- группа больных и контрольных групп по методу полиморфизма длин рестрикционного фрагмента.

3. Разница между распределениями генотипов между больной и контрольной группами не обнаружена, т.к. значение Пирсон chi-square теста=0.02, степень свободы 1- df = 1, p= 0.89, OR ( S аллель) = 0,98 , OR( L аллель)= 1,02, в сязи с чем можно утверждать, что S аллель L-myc гена не может служить маркером в развитии рака желудка популяции Узбекистана.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Correa P., Schneider B.G. Etiology of gastric cancer: what is new? Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2005, 14: 1865-1868.

2. Zagari R.M., Bazzoli F. Gastric cancer: who is at risk? Dig. Dis. 2004, 22: 302-305.

4. Аксель Е.М., Давыдов М.И. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 2000 году. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ. М 2002;85--106.

5. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Структура заболеваемости злокачественными новообразованиями в странах бывшего СССР. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000 г.М 2001; 107--111.

6. Долгушин Б.И., Нечушкин М.И., Черкасов В.А. и др. Восстановление проходимости стриктур трубчатых органов металлическими сетчатыми протезами у неоперабельных онкологических больных пожилого возраста. Клин геронтол 2005; 6: 15--25.

7. Мерабишвили В.М. Рак желудка: эпидемиология, профилактика, оценка эффективности лечения на популяционном уровне. Практ. Онкол., 2001; 3: 3--8.

8. El-Omar E.M., Carrington M., Chow W. H. et al. “Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer”. Nature, 2000; 404: 398-402.

9. Gonzalez C.A.., Sala N., Capella G. “Genetic susceptibility and gastric cancer risk”. Int. J. Cancer 2002; 100: 249- 260.

10. Silva F., Carvalho F., Peixoto A. et al. “MUC1 gene polymorphism in the gastric carcinogenesis pathway”. Eur.J. Hum. Genet., 2001; 9:548- 552.

11. Zhang J., Dou C., Song Y. et al.“Polymorphisms of tumor necrosis factor-alpha are associated with increased susceptibility to gastric cancer: a meta-analysis”. J Hum Genet 2008; 53: 479-489.

12. Wang G.Y., Lu C.Q., Zhang R.M., Hu X.H., Luo Z.W.“The E-cadherin gene polymorphism 160C-4A and cancer risk: a huge review and meta-analysis of 26 case-control studies”. Am J Epidemiol 2008; 167: 7- 14.